整合素αvβ3介導(dǎo)EPCs修復(fù)損傷血管內(nèi)皮及補(bǔ)陽還五湯的干預(yù)作用

賀冰 劉曉丹 李亮 李平 張偉

〔摘要〕 目的 探討補(bǔ)陽還五湯促進(jìn)EPCs修復(fù)損傷血管內(nèi)皮的作用，從歸巢環(huán)節(jié)闡釋其作用機(jī)制，為中醫(yī)藥防治心腦血管疾病提供參考。方法 以補(bǔ)陽還五湯灌胃及尾靜脈輸注EPCs作用于內(nèi)皮損傷的模型大鼠，從血管內(nèi)皮形態(tài)、EPCs歸巢等方面評價內(nèi)皮損傷修復(fù)情況，從整合素αvβ3和αvβ5介導(dǎo)的SDF-1/CXCR-4信號通路了解該方促進(jìn)EPCs歸巢的機(jī)制。結(jié)果 與單用EPC組（E組）和單用藥物組（b組）比較，補(bǔ)陽還五湯聯(lián)合EPC組（B組）αvβ3表達(dá)顯著增加（P<0.05），血管SDF-1表達(dá)顯著增高（P<0.01）。結(jié)論 補(bǔ)陽還五湯能促進(jìn)EPC修復(fù)損傷的血管內(nèi)皮，其作用機(jī)制可能與該方能上調(diào)整合素αvβ3介導(dǎo)的SDF-1信號通路相關(guān)蛋白，促進(jìn)EPCs的歸巢有關(guān)。

〔關(guān)鍵詞〕 整合素αvβ3；整合素αvβ5；內(nèi)皮祖細(xì)胞；補(bǔ)陽還五湯；歸巢

〔中圖分類號〕R289 〔文獻(xiàn)標(biāo)志碼〕A 〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2018.03.008

Intervention Effect of Buyang Huanwu Decoction on Integrin αvβ3-Mediated EPCs in Repairing Damaged Vascular Endothelium

HE Bing1， LIU Xiaodan2， LI Liang3， LI Ping2， ZHANG Wei4*

（1. The Second Affiliated Hospital of Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410005， China； 2. Hunan Key Laboratory of TCM Prevention and Treatment of Cardiovascnlar and Cerebrovascular Diseases， Changsha， Hunan 410005， China； 3. College of Traditional Chinese Medicine， Hunan University of Chinsese Medicine， Changsha， Hunan 410208， China；

4. College of Integrated Chinese and Western medicines， Hunan University of Chinsese Medicine， Changsha， Hunan 410208， China）

〔Abstract〕 Objective To investigate the role of Buyang Huanwu decoction （BYHWD） in promoting endothelial progenitor cell （EPC）-induced recovery of injuried endothelial cells， and explain the mechanism from EPCs homing. Methods The endothelial injuried rats were given gavage with BYHWD and vena caudalis injection of EPC. The repaired situation of injuried endothelium was observed. The effect of BYHWD on EPC homing was analyzed from integrin αvβ3 and integrin αvβ5-mediated SDF-1/CXCR-4 signaling pathway. Results Compared with group EPC （group E） and BYHED group （group b）， the protein expression of vascular αvβ3 in BYHWD combined with EPC （group B） increased more significantly （P<0.05）， vascular SDF-1 expression increased significantly （P<0.01）. Conclusion BYHED could promote EPC repairing damaged endothelium， the mechanism may be related to promote EPCs homing through upregulating αvβ3-mediated SDF-1signaling pathway.

〔Keywords〕 integrin αvβ3； integrin αvβ5； Endothelial progenitor cell； Buyang Huanwu decoction； homing

血管內(nèi)皮損傷是動脈粥樣硬化等多種心腦血管疾病的始動因素和共同的病理基礎(chǔ)[1]。因而，及時有效地修復(fù)損傷的血管內(nèi)皮是防治心腦血管疾病發(fā)生發(fā)展的有效手段和重要策略。內(nèi)皮祖細(xì)胞（endothelial progenitor cells，EPCs）是修復(fù)血管內(nèi)皮的種子細(xì)胞[2]，由于種子細(xì)胞的生存依賴于快速的血管化[3]，因而促進(jìn)EPCs的快速準(zhǔn)確的歸巢具有重要的科學(xué)意義。整合素的主要功能是黏附和信號傳導(dǎo)，介導(dǎo)細(xì)胞、基質(zhì)之間的相互作用，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞的黏附、增殖、分化、遷移、凋亡、血管發(fā)生等[4-5]，基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1（the stromal cell-derived factor-1，SDF-1）及其唯一受體趨化因子受體-4（CXC chemokine receptor 4，CXCR-4）軸在EPCs的歸巢、動員和分化中發(fā)揮著關(guān)鍵作用[6]。因此整合素與SDF-1/CXCR-4軸是否為調(diào)控EPCs歸巢并發(fā)揮修復(fù)作用的關(guān)鍵環(huán)節(jié)值得進(jìn)一步探討。中醫(yī)藥在防治心腦血管疾病方面積累了大量的經(jīng)驗，補(bǔ)陽還五湯（BYHWD）是中醫(yī)益氣活血法的代表方劑，本團(tuán)隊已有研究表明該方能促進(jìn)內(nèi)皮損傷的修復(fù)[7-9]，其機(jī)制與促進(jìn)EPCs的歸巢有關(guān)，但具體的作用環(huán)節(jié)和機(jī)制尚不清楚。因此，從整合素促進(jìn)歸巢環(huán)節(jié)加以研究補(bǔ)陽還五湯對EPCs修復(fù)受損內(nèi)皮的調(diào)控機(jī)制，對于該方的合理運(yùn)用具有重要意義，亦為中醫(yī)藥防治心腦血管疾病提供了新靶點、新參考。

1 材料

1.1 實驗動物

成年雄性SD大鼠，體質(zhì)量180～200 g，湖南斯萊克景達(dá)實驗動物有限公司，許可證號：scxk（湘）2011-0003。

1.2 主要試劑和儀器

兔抗鼠多克隆SDF-1抗體 （R&D Systems，Inc.， USA），兔抗鼠單克隆CXCR-4抗體（abcam， USA），兔抗鼠多克隆αvβ3、αvβ5抗體（Boster， WuHan），羊抗免二抗（Boster，WuHan）等。DF5000B Leica熒光顯微鏡、Leica CM 1850冰凍切片機(jī)（Leica Microsystems，Wetzlar，Germany）；DYY-6C電泳儀、DYCP-40D迷你轉(zhuǎn)印電泳儀（槽）（北京六一，CHN），圖像分析軟件IPP6.0等。

2 方法

2.1 EPCs的培養(yǎng)、鑒定和標(biāo)記

SD大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d后頸椎脫臼處死，采用改良密度梯度離心的方法獲取單個核細(xì)胞后培養(yǎng)[10]，72 h后半量換液，14 d左右可見細(xì)胞鋪滿培養(yǎng)瓶后可進(jìn)行鑒定或傳代。（1）EPCs功能學(xué)鑒定：按照文獻(xiàn)方法[11-12]，完成EPCs細(xì)胞表面標(biāo)志物及功能學(xué)鑒定，細(xì)胞傳代備用。（2）參考文獻(xiàn)[13]對EPCs進(jìn)行標(biāo)記。取培養(yǎng)14 d的EPCs，將熒光染色劑DAPI加入EPCs中，終濃度為50 mg/mol，在37 ℃ CO2培養(yǎng)箱中孵育24 h，標(biāo)記后的EPCs用無菌PBS沖洗6次，除去未結(jié)合的DAPI，熒光顯微鏡下觀察標(biāo)記的EPCs。

2.2 血管內(nèi)皮損傷模型的建立

根據(jù)文獻(xiàn)建立大鼠血管內(nèi)皮損傷模型[14]，SD雄性大鼠隨機(jī)分組后，以配方為2%膽固醇、0.5%膽酸鈉、3%豬油、0.2%丙基硫氧嘧啶和94.3%基礎(chǔ)飼料的高脂飼料喂養(yǎng)，輔以VitD腹腔注射，70萬U/kg，分2次注射，高脂喂養(yǎng)2周后第1次注射，又2周后第2次注射，各35萬U，持續(xù)高脂飼料喂養(yǎng)12周。隨機(jī)取5只大鼠，觀察內(nèi)膜形態(tài)，計量檢測內(nèi)膜厚度，SA-β-Gal法檢測內(nèi)皮衰老情況，可見大鼠主動脈內(nèi)膜增厚，出現(xiàn)動脈粥樣硬化樣改變，內(nèi)皮衰老檢測呈陽性，據(jù)此推測造模成功。

2.3 分組、給藥及處理

模型大鼠隨機(jī)分為單用補(bǔ)陽還五湯組（b組）、補(bǔ)陽還五湯聯(lián)合EPC組（B組）、單純EPC輸注組（E組），模型組（M組）共4組，并以健康SD大鼠設(shè)為空白對照組（C組），合計5個組。按組別給予藥物處理，B、b組以中藥灌胃補(bǔ)陽還五湯（生藥11.1 g/kg， 1次/d，連用30 d），每周稱體重調(diào)整灌胃藥量，其余各組灌胃蒸餾水。B、E組輸注數(shù)量約為2×106的DAPI標(biāo)記的EPCs以1 mL PBS混懸，通過尾靜脈于給藥的第8 d一次性輸注，其余各組輸注1 mLPBS，藥物干預(yù)30 d后處死動物取材進(jìn)行檢測。

2.4 血管內(nèi)皮αvβ3、αvβ5、SDF-1、CXCR-4蛋白表達(dá)檢測

分組、方法同前。各組大鼠于給藥30天后即末次給藥后次日，麻醉后處死動物，取出胸腹主動脈，將組織碾磨之后收集于干凈Ep管中，Bradford 法測定蛋白質(zhì)含量。用SDS-PAGE凝膠電泳法將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜后加入5%蛋白封閉液在室溫下?lián)u動孵育2 h。加入3 mL用TBST稀釋的I抗（αvβ3、αvβ51∶1 000、SDF-1 1∶200、CXCR-4 1：1 000），4 ℃緩慢搖動過夜后加入入羊抗鼠、羊抗兔第II抗體3 mL（1∶4 000），37 ℃孵育1 h。將膜放置于熒光成像儀內(nèi)，用凝膠成像系統(tǒng)曝光后將膠片進(jìn)行掃描，用圖像分析軟件IPP 6.0對圖像進(jìn)行光密度分析。

2.5 統(tǒng)計分析方法

運(yùn)用統(tǒng)計學(xué)軟件SPSS 17.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，實驗結(jié)果所有數(shù)據(jù)均采用“x±s”表示，多組間均數(shù)比較用單因素方差分析，組間兩兩比較方差齊者用LSD法，方差不齊者先將數(shù)據(jù)進(jìn)行自然對數(shù)轉(zhuǎn)換后再作單因素方差分析和兩兩比較。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 內(nèi)皮祖細(xì)胞的生長情況

原代培養(yǎng)細(xì)胞后48 h可見大部分細(xì)胞貼壁，72 h后可見細(xì)胞伸出偽足，5 d后可見細(xì)胞呈鋪路石狀，7 d后細(xì)胞梭行生長并開始融合，9 d左右可達(dá)到融合70%～80%，通過傳代換液后細(xì)胞呈指數(shù)生長，14 d左右可見集落形成。與單純密度梯度離心法比較，一是獲取細(xì)胞數(shù)量顯著增加；二是細(xì)胞更易融合形成集落，大大加速了生長和傳代，見圖1。

3.2 各組造模情況比較

結(jié)果顯示，M組可見血管內(nèi)膜顯著增生，血管內(nèi)膜中可見到SA-β-gal染色陽性，呈中等強(qiáng)度表達(dá)，而C組表達(dá)呈陰性。與M組比較，E組血管各層細(xì)胞排列整齊，血管內(nèi)膜未見陽性表達(dá)，b組血管內(nèi)膜可見弱陽性表達(dá)，而B組血管內(nèi)膜未見陽性表達(dá)，見圖2。

3.3 EPCs的歸巢

熒光顯微鏡下B組和E組血管壁可見藍(lán)色熒光，尤其是在內(nèi)膜部位及損傷嚴(yán)重部位的熒光表達(dá)更強(qiáng)；結(jié)合血管形態(tài)學(xué)及管壁計量檢測結(jié)果可見輸注EPCs的各組損傷修復(fù)較好，由此可知輸注的EPCs歸巢到損傷血管分化為內(nèi)皮細(xì)胞參與了損傷血管內(nèi)皮的修復(fù)，見圖3。

3.4 各組整合素表達(dá)的比較

與空白對照組比較，模型組αvβ3、αvβ5表達(dá)降低（P<0.05）。與模型組比較，各治療組αvβ3的表達(dá)均增加（P<0.05或P<0.01）；與單純EPC組比較，補(bǔ)陽還五湯聯(lián)合EPC組αvβ3表達(dá)有所增加但差異不明顯（P>0.05）。與單用補(bǔ)陽還五湯組比較，補(bǔ)陽還五湯組聯(lián)合EPC組αvβ3表達(dá)顯著增加（P<0.05）。與模型組比較，各治療組αvβ5的表達(dá)增加（P<0.05），但各治療組之間的比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。見表1，圖4。

3.5 各組SDF-1、CXCR-4表達(dá)的比較

結(jié)果表明：與空白對照組比較，模型組SDF-1蛋白表達(dá)顯著升高（P<0.05）。與模型組比較，補(bǔ)陽還五湯組聯(lián)合EPC組SDF-1蛋白表達(dá)顯著升高（P<0.01），而單用EPC組、補(bǔ)陽還五湯組與模型組比較無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。與單用EPC組比較，補(bǔ)陽還五湯聯(lián)合EPC組SDF-1表達(dá)顯著增高（P<0.01）。與單用藥物組比較，補(bǔ)陽還五湯聯(lián)合EPC組SDF-1表達(dá)顯著高于補(bǔ)陽還五湯組（P<0.05）。

在CXCR-4蛋白表達(dá)方面，與空白組比較，模型組CXCR-4表達(dá)顯著降低（P<0.05）。與模型組比較，b組表達(dá)下降（P<0.05），其余各治療組CXCR-4變化無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。見表2、圖5。

4 討論

補(bǔ)陽還五湯出自清代名醫(yī)王清任《醫(yī)林改錯》，具有益氣活血之功效，為治療缺血性腦血管病及后遺癥的有效方劑。已有研究表明[15-16]該方能通過增強(qiáng)VEGF及受體的表達(dá)和提高蛋白水平達(dá)到保護(hù)血管內(nèi)皮的作用，能通過各種途徑促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)NO，從而達(dá)到保護(hù)血管內(nèi)皮的作用[17]。在抗動脈粥樣硬化方面，補(bǔ)陽還五湯內(nèi)服加外敷治療閉塞性周圍動脈粥樣硬化有顯著療效[18]。可以通過抑制誘導(dǎo)型一氧化氮合酶的表達(dá)降低動脈粥樣硬化小鼠一氧化氮水平，防治動脈粥樣硬化[19]。還能下調(diào)MMP-9的表達(dá)，降低血脂，具有抗動脈粥樣化作用[20]。由此可見，該方具有較好的改善內(nèi)皮功能的作用。其作用機(jī)制主要在于降血脂、抗氧化損傷、調(diào)節(jié)內(nèi)皮活性物質(zhì)分泌、抗栓與促栓平衡、抗細(xì)胞凋亡等方面。

整合素是由α和β兩個亞單位組成，它們之間以非共價形式相連，目前研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)形成24個異源二聚體[21]。其中αvβ3在新生血管內(nèi)皮細(xì)胞有高度表達(dá)，αvβ3與配體結(jié)合后通過絲裂原激活的蛋白激酶（MAPK）途徑使內(nèi)皮細(xì)胞增殖，分化和遷移形成血管。整合素家族的粘附分子在EPC的歸巢中也起重要的作用，Schroeter等[22]發(fā)現(xiàn)瘦素（Leptin）能通過上調(diào)αvβ5促進(jìn)EPC的修復(fù)損傷的血管。Walter等[23]的研究表明整合素αvβ3和αvβ5能加快EPC粘附至血管損傷處。另有研究表明，SDF-1/CXCR-4軸參與造血干/祖細(xì)胞、T細(xì)胞等細(xì)胞的趨化和遷移過程[24]。因而整合素與SDF-1/CXCR-4軸在EPCs的作用環(huán)節(jié)是否具有相關(guān)性有待證實。

本實驗結(jié)果表明，與模型組相比，各實驗組αvβ3、αvβ5的表達(dá)均有所增強(qiáng)，結(jié)合受損內(nèi)皮修復(fù)情況和整合素的現(xiàn)代研究，可以推論αvβ3、αvβ5介導(dǎo)了EPC對損傷血管內(nèi)皮的修復(fù)。與單用復(fù)方比較，復(fù)方聯(lián)合EPC后αvβ3的表達(dá)增加。與單獨輸注EPC組比較，藥物聯(lián)合EPC輸注組兩類整合素的表達(dá)未見明顯增加。從而提示，整合素在促進(jìn)EPC歸巢方面亦有一定的積極作用，這可能與整合素的支持、粘附作用有關(guān)。

SDF-1/CXCR4調(diào)控歸巢方面，藥物聯(lián)合EPCs輸注組的SDF-1表達(dá)高于單獨輸注EPCs組，亦高于兩單獨藥物組。以上結(jié)果提示藥物聯(lián)合EPCs可能通過上調(diào)SDF-1的表達(dá)而促進(jìn)EPCs遷移、歸巢，促進(jìn)了損傷內(nèi)皮的修復(fù)。

綜上所述，整合素αvβ3和SDF-1在EPCs的歸巢方面發(fā)揮了積極的作用，而補(bǔ)陽還五湯能上調(diào)前兩者的表達(dá)，促進(jìn)了EPCs的歸巢，從而發(fā)揮修復(fù)損傷血管內(nèi)皮的作用，兩者的表達(dá)具有一定的正相關(guān)性，從而為整合素、SDF-1/CXCR4軸作為調(diào)控EPCs的重要環(huán)節(jié)提供了實驗參考，這方面的研究尚屬空白，兩者之間的溝通機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

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