補陽還五湯超微飲片對局灶性腦缺血大鼠神經(jīng)干細胞移植后Bcl—2、Bax表達的影響

廖亮英 蔡光先 周賽男

〔摘要〕 目的 探討補陽還五湯超微飲片對局灶性腦缺血大鼠神經(jīng)干細胞移植后凋亡相關基因Bcl-2、Bax的影響。方法 將SD大鼠80只，雌雄各半，復制局灶性腦缺血大鼠模型，造模后按神經(jīng)功能缺損評分進行分層，隨機分為5組，每組15只，分別于移植后7 d、14 d、28 d進行神經(jīng)功能評分，采用補陽還五湯超微飲片與傳統(tǒng)飲片予以干預，于相應時間點處死大鼠后采用免疫組化法檢測凋亡基因Bcl-2、Bax。結果 補陽還五湯能顯著減輕神經(jīng)功能缺損，Bcl-2、Bax在各時間點（7 d、14 d、28 d）表達與模型組比較差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），模型加移植加補陽還五湯超微飲片組上調Bcl-2、拮抗Bax表達的作用優(yōu)于模型加移植加補陽還五湯傳統(tǒng)飲片組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。結論 補陽還五湯可調節(jié)腦缺血后Bcl-2、Bax的表達， 是其促進神經(jīng)功能恢復的可能機制之一，且超微飲片組的作用較傳統(tǒng)飲片組更加顯著。

〔關鍵詞〕 補陽還五湯；局灶性腦缺血；神經(jīng)干細胞；細胞移植；Bcl-2；Bax

〔中圖分類號〕R289.3；R255.2 〔文獻標志碼〕A 〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2018.03.007

Effects of Buyang Huanwu Ultra-Fine Powder on Apoptosis Gene Bcl-2 and Bax of Transplanted Neural Stem Cells in Rats with Focal Cerebral Ischemia

LIAO Liangying1， CAI Guangxian2*， ZHOU Sainan2

（1. The First Affiliated Hospital of Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410007， China；

2. Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410208， China）

〔Abstract〕 Objective To investigate the effects of Buyang Huanwu ultra-fine powder on apoptosis protein of Bcl-2 and Bax in transplanted neural stem cells in rats with focal cerebral ischemia. Methods Eighty Sprague-Dawley rats， half male and half female， were copyed the focal cerebral ischemia models， which were randomly divided into five groups， 15 rats in each group. The model rats were intervened by using Buyang Huanwu ultra-fine powder and traditional decoction. At 7 d， 14 d and 28 d of post-tansport， the neural function defect scale was measured. The rats were sacrified at according time. Bcl-2 and Bax were detected by immunohistochemical staining. Results Buyang Huanwu decoction could improve the neurological defect. Compared with model group， the expression of Bcl-2 and Bax increased obviously at different time points （7 d， 14 d， 28 d）， the differnces were statistically significant （P<0.05）. The model-transplantation-Buyang Huanwu ultra-fine powder group in increasing Bcl-2 and decreasing Bax was better than the model-transplantation-traditional Buyang Huanwu decoction， the difference was statistically significant （P<0.05）. Conclusion Buyang Huanwu decoction could regulate the expression of Bcl-2 and Bax protein after cerebral ischemia， which may be one of mechnisms of promoting the recovery of neural function. The effect of Buyang Huanwu ultra-fine powder was better than traditional decoction.

〔Keywords〕 Buyang Huanwu decoction； cerebral ischemia； neural stem cell； cell transplantation； Bcl-2； Bax

缺血性腦血管?。╥schemic cerebral vascular dis

ease，ICVD）以其高發(fā)病率、高致殘率和高死亡率嚴重危害著人們的身體健康，已成為現(xiàn)代醫(yī)學研究的熱點問題[1]。補陽還五湯是中醫(yī)治療缺血性腦損傷的有效經(jīng)典方，能夠降低患者的致殘率[2]。Bcl-2和Bax基因是細胞凋亡過程中重要的調節(jié)基因，研究表明腦缺血后神經(jīng)功能恢復重建的機制可能與神經(jīng)干細胞凋亡的相關調控基因密切相關，本試驗擬探討超微補陽還五湯對局灶性腦缺血大鼠神經(jīng)干細胞移植后Bcl-2、Bax表達的影響及其作用特點，以更好地應用于臨床。現(xiàn)報道如下。

1 材料

1.1 藥物

補陽還五湯傳統(tǒng)飲片：處方來源于《醫(yī)林改錯》，組成如下：黃芪120 g，赤芍10 g，川芎10 g，全當歸10 g，干地龍10 g，紅花10 g，桃仁10 g，藥材購自我院藥劑科，經(jīng)鑒定均為道地藥材，符合《藥典》規(guī)定，一煎加水500 mL，煎汁150 mL，二煎加水300 mL，煎汁150 mL，兩煎混合，文火煎成膏狀（每mL含生藥1.5 g），4 ℃冷藏備用。補陽還五湯超微飲片：取傳統(tǒng)補陽還五湯劑量的1/3并混合，采用震動粉粹技術（用貝利粉碎機），將黃芪、赤芍、川芎、全當歸、干地龍、紅花粉碎至1～75微米，桃仁粉碎至200～400微米（40～80目），收集微粉，一煎加水500 mL，煎汁150 mL，二煎加水300 mL，煎汁150 mL，兩煎混合，文火煎成膏狀（每mL含生藥0.5 g），4 ℃冷藏備用。

1.2 試劑

DMEM/F12粉由Hyclon公司提供；bFGF由R&D公司提供；B27添加物、EGF由GLBCO公司提供；胰酶、EDTA、Qtracker Cell Labeling Kit Protocol、 Rabbit Anti-Bcl-2抗體，產品批號：BA0412、Rabbit Anti-Bax抗體，產品批號：BA0315，均由武漢博士德生物工程公司提供；細胞凋亡檢測試劑盒，產品批號：MK1022，由長沙麗欣生物公司提供；水合氯醛、0.01MPBS、Triton-X100、雙氧水、甲醇、無水甘油由長沙麗欣生物公司提供；SABC試劑盒、AEC顯色劑、多聚賴氨酸包埋玻片、水溶性封片劑由北京中杉生物公司提供。

1.3 動物

SD大鼠80只，清潔級，體質量（280±20） g，雌雄各半，由上海西普爾-必凱實驗動物有限公司提供，動物合格證號：004535，實驗動物生產許可證為SCXK（滬）2003-0002。

1.4 儀器與器械

BX-51光學顯微鏡、AlphaImager顯微圖像分析系統(tǒng)、IX71倒置顯微鏡、CCD攝像頭（日本Olympus公司）；Galaxy 170R CO2培養(yǎng)箱（shell lab 公司）；WP8025鼠腦立體定位儀（美國WPI公司）；TDZS-WS臺式離心機（湘儀）；Pureloab Classic UVF 超純水儀（Millopor 公司）；E60冰凍切片機（英國shamton公司）；BFM-T6B2微粉機（濟南貝利公司）。

2 方法與結果

2.1 方法

2.1.1 神經(jīng)干細胞的分離、培養(yǎng)、傳代 參考本研究團隊建立的方法[3]從新生3～5 d SD大鼠腦內分離純化。

2.1.2 模型制備 參考文獻[3]采用大腦中動脈線栓法復制局灶性腦缺血大鼠模型，造模后有5只SD大鼠死亡。待動物清醒24 h后，參考文獻[3]采用Zea Longa神經(jīng)功能缺失評分標準初步評價動物造模情況。

2.1.3 細胞標記 參考文獻[4]采用量子點的標記方法。

2.1.4 細胞移植 參考文獻[5]采用側腦室細胞移植的方法。

2.1.5 動物分組與給藥 將造模后的SD大鼠按神經(jīng)功能缺損評分進行分層，隨機分為5組：模型組（A組）、模型+空白移植組（B組），模型+移植組（C組），模型+移植+補陽傳統(tǒng)飲片組（4.57 g/kg，D組），模型+移植+補陽超微飲片組（1.52 g/kg，E組），每組各15只。動物手術后分別觀察存活7、14和28 d，每組每個時間點各5只。各組分別灌胃給藥，A組和B組給予等體積生理鹽水，給藥體積均為10 mL/kg，每天給藥1次。

2.1.6 神經(jīng)功能評價 參照文獻[3]分別于處死前進行神經(jīng)功能評分。

2.1.7 動物處理 動物注射細胞后分別存活7、14、28 d，參考文獻[3]進行組織處理。

2.1.8 存活細胞檢測 采用免疫組化法檢測Bcl-2、Bax，嚴格按照試劑說明書完成，每只動物隨機取海馬部位切片5張，置于100倍物鏡下，每張切片隨機選3個視野，用 Olympus Micro Image 4.0圖像處理系統(tǒng)自動計數(shù)免疫陽性細胞數(shù)。

2.1.9 統(tǒng)計學方法 所有數(shù)據(jù)應用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件進行處理，計量資料以“x±s”表示。多組間均數(shù)比較用方差分析，方差分析前先進行正態(tài)性、方差齊性檢驗，滿足條件者用F檢驗，F(xiàn)檢驗有統(tǒng)計學意義者，再進行兩兩比較；兩兩比較方差齊者用SNK法，方差不齊者用Tamhane′s T2法。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2.2 結果

2.2.1 細胞標記情況 在神經(jīng)干細胞液中加入量子點標記液后，絕大多數(shù)神經(jīng)干細胞被標記，而且由其傳代分化的細胞亦被標記。

2.2.2 補陽還五湯超微飲片對局灶性腦缺血大鼠神經(jīng)干細胞移植后Bcl-2表達的影響 C組Bcl-2表達水平較A、B組增加，D、E組Bcl-2表達水平較C組增加，E組上調Bcl-2表達較D組明顯，組間比較差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。組內比較：三組在7、14、28 d Bcl-2表達差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。見表1，圖1-3。

2.2.3 補陽還五湯超微飲片對局灶性腦缺血大鼠神經(jīng)干細胞移植后Bax表達的影響 C組Bax表達水平較A、B組增加，D、E組Bax表達水平較C組減少，說明D、E組均能下調Bax表達，E組下調Bax表達較D組明顯，組間比較差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。組內比較三組在7、14、28 d Bax表達差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。見表2，圖4-6。

3 討論

缺血性腦血管疾病是目前嚴重危害人類生命健康的主要疾病之一，其高發(fā)病率和致殘率使得對該病的研究成為熱點。腦組織受損后，構成神經(jīng)系統(tǒng)結構和功能的基本單位——神經(jīng)元大量丟失導致腦功能缺失，而定向誘導可促進神經(jīng)干細胞向神經(jīng)元分化[6]，且神經(jīng)干細胞在體外無限增殖，可促使神經(jīng)受損后神經(jīng)功能的恢復[7]，是治療神經(jīng)系統(tǒng)退行性病變或缺失疾病的有效途徑之一。Bcl-2和Bax基因是細胞凋亡過程中重要的調節(jié)基因，Bcl-2和Bax可通過形成同源或異源二聚體來調節(jié)細胞凋亡，也可獨立地調節(jié)細胞凋亡[8]。

補陽還五湯是治療缺血性腦損傷的經(jīng)典方，能夠降低患者的致殘率，提高生存質量[9]。本研究團隊前期結果表明補陽還五湯能促進缺血后腦內神經(jīng)干細胞增殖、遷移、分化[10]，可調節(jié)腦缺血后caveolin1、2的表達[11]，這可能是其促進缺血后神經(jīng)功能恢復機制之一[12-13]。

本研究采用導師多年的研究成果補陽還五湯超微飲片進行觀察，實驗結果表明，補陽還五湯能促進神經(jīng)功能恢復，腦缺血損傷神經(jīng)干細胞移植后Bcl-2表達上調，Bax表達下調，其量效關系體現(xiàn)在腦缺血后模型加移植加補陽還五湯超微飲片1.52 g/kg對腦缺血后大鼠Bcl-2、Bax表達的影響作用優(yōu)于模型加移植加補陽還五湯傳統(tǒng)飲片4.57 g/kg；提示補陽還五湯超微飲片的臨床用藥劑量可采用其傳統(tǒng)飲片臨床等效劑量的1/3。

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