美洲大蠊提取液對(duì)慢性難愈合創(chuàng)面Ⅰ/Ⅲ型膠原蛋白調(diào)控研究

李文華 伍偉明 劉筱 楊敏 周雯婷 曾娟妮

〔摘要〕 目的 觀察美洲大蠊提取液對(duì)大鼠慢性難愈合創(chuàng)面組織中Ⅰ/Ⅲ型膠原蛋白的表達(dá)，探討其促愈機(jī)制。方法 將48只SPF大鼠隨機(jī)分為急性創(chuàng)面對(duì)照組，慢性創(chuàng)面模型組、貝復(fù)濟(jì)陽(yáng)性組及美洲大蠊實(shí)驗(yàn)組，藥物干預(yù)5、7、11 d后分批留取創(chuàng)面組織并處死，運(yùn)用PCR方法測(cè)定創(chuàng)面組織中Ⅰ/Ⅲ型膠原蛋白mRNA的表達(dá)。結(jié)果 Ⅰ、Ⅲ型膠原在各組中的表達(dá)趨勢(shì)曲線一致，第5天，對(duì)照組表達(dá)最高，模型組最低，從第5天開始，美洲大蠊實(shí)驗(yàn)組中Ⅰ、Ⅲ型膠原中表達(dá)呈上升趨勢(shì)并高于陽(yáng)性組，第7天達(dá)到高峰后逐漸穩(wěn)定下降，第11天略低于陽(yáng)性組（P<0.01）。結(jié)論 美洲大蠊提取液能有效提高大鼠難愈合創(chuàng)面前中期Ⅰ/Ⅲ型膠原蛋白的表達(dá)從而促進(jìn)創(chuàng)面愈合，并在后期能有效降低膠原蛋白的過(guò)度表達(dá)而減少瘢痕形成。

〔關(guān)鍵詞〕 美洲大蠊提取液；慢性難愈合創(chuàng)面；Ⅰ型膠原蛋白；Ⅲ型膠原蛋白

〔中圖分類號(hào)〕R285.5；R393 〔文獻(xiàn)標(biāo)志碼〕A 〔文章編號(hào)〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2018.03.005

Study of American Cockroach Extraction Solution in Regulating the TypeⅠ/Ⅲ

Collagen of Chronic Wound

LI Wenhua1， WU Weiming1， LIU Xiao1， YANG Ming1， ZHOU Wenting1， ZENG Juanni2*

（1. Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410208， China； 2. The Second Affiliated Hospital of Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410005， China）

〔Abstract〕 Objective To observe the effect of American Cockroach extraction solution on the expression of typeⅠ/Ⅲ collagen in tissue of the chronic wound in rats， and to investigate the healing mechanism. Methods The 48 SPF rats were randomly divided into the acute wound control group （control group）， the chronic wound model group （model group）， the positive group and the experimental group. The research group kept a part of wound tissue in batches on 5th， 7th， 11th day after drug intervention and executed the whole rats finally. Expression quantity of type collagenⅠ/Ⅲ mRNA in wound tissue was measured by polymerase chain reaction （PCR）. Results The curves of expression variation of collagen type I and Ⅲ were consistent in each group. On the 5th day， the expression quantity in the control group was highest and the model group's was lowest. Collagen type I/Ⅲ of the experimental group was on the rise from the 5th day and it was higher than that of positive group， it kept steadily after reaching the peak on the 7th day， and it was slightly lower than that of the positive group on 11st day （P<0.01）. Conclusion American cockroach extraction solution could improve the expression of typeⅠ/Ⅲ collagen of skin tissue in the middle time of the chronic wound healing of rats effectively， and it could reduce the excessive expression of collagen effectively so as to reduce the scar formation.

〔Keywords〕 American cockroach extraction solution； chronic wound； type I collagen； type Ⅲ collagen

慢性難愈合創(chuàng)面是指創(chuàng)面在各種內(nèi)外因素作用下不能通過(guò)正常的愈合進(jìn)程達(dá)到解剖和功能上的完整，從而進(jìn)入一種病理性炎癥反應(yīng)狀態(tài)，最終導(dǎo)致經(jīng)久難愈[1]。臨床上多指各種原因形成的創(chuàng)面經(jīng)30 d以上治療未能愈合，也無(wú)愈合傾向者[2]。主要見于大面積創(chuàng)面燒傷、糖尿病潰瘍、壓迫性潰瘍等。隨著患病率的逐年上升，皮膚難愈合創(chuàng)面的長(zhǎng)期護(hù)理耗費(fèi)了高昂的治療費(fèi)用及醫(yī)療資源，給患者造成了精神、身體的雙重痛苦。研究者也針對(duì)病因病理展開了大量研究，近年生物分子技術(shù)的快速發(fā)展，使創(chuàng)面愈合的方法在細(xì)胞外基質(zhì)、干細(xì)胞、轉(zhuǎn)基因干細(xì)胞水平等方面的研究取得了一定成果，但其靶向性、高效性及安全性尚未完全解決，在臨床上的應(yīng)用仍需要一定過(guò)程，因此，在外科創(chuàng)面修復(fù)中亟待尋找一種安全、有效、價(jià)廉的方法。已經(jīng)證實(shí)在影響創(chuàng)面愈合的諸多因素中，生長(zhǎng)因子的分泌[3]及細(xì)胞外基質(zhì)成分（extracellular matrix，ECM）的合成/降解[4]在創(chuàng)面愈合過(guò)程中起著至關(guān)重要的作用[5]。ECM對(duì)細(xì)胞的遷徙、增殖、分化和組織的重構(gòu)有著重要作用[6]，而膠原蛋白是ECM的主要組分，在皮膚中主要是Ⅰ、Ⅲ型膠原。美洲大蠊具有養(yǎng)陰生肌、通利血脈等作用，其提取物已經(jīng)逐漸應(yīng)用于臨床慢性皮膚潰瘍并取得了較好的修復(fù)療效，但其促愈機(jī)制的實(shí)驗(yàn)研究報(bào)道仍然很少。課題組在前期實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)美洲大蠊提取液在肉芽生長(zhǎng)期上調(diào)TGF及VEGF表達(dá)來(lái)加速創(chuàng)面愈合[7]，基于此，本實(shí)驗(yàn)利用PCR檢測(cè)肉芽組織膠原蛋白Ⅰ、Ⅲ型膠原，進(jìn)一步研究美洲大蠊的促愈機(jī)制，豐富中醫(yī)外治方法及理論。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

2月齡、體質(zhì)量為200～250 g的SPF級(jí)大鼠48只，雌雄各半，由湖南中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物中心提供（合格證號(hào)：43004700026384），混合飼料單籠飼養(yǎng)，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。

1.2 主要實(shí)驗(yàn)藥物及試劑

美洲大蠊提取液100 mL/瓶（商品名：康復(fù)新，編號(hào)：B14000063390）由四川好醫(yī)生藥業(yè)集團(tuán)生產(chǎn)，貝復(fù)濟(jì)15 mL/瓶（國(guó)藥準(zhǔn)字S10980075）珠海億勝生物制藥有限公司生產(chǎn)。DNA Marker（Fermentas公司 批號(hào)：SM0672）；Trizol（美國(guó)GIBCO公司 批號(hào)：15596-026）；Real-time PCR mix（thermo fisher公司 批號(hào)：4367659）；Gold View核酸染料、瓊脂糖粉、氯仿、引物由上海生物工程有限公司提供。

1.3 主要實(shí)驗(yàn)儀器

F2微量移液器（美國(guó)thermo fisher公司）；ChemiDoc MP凝膠成像分析儀（美國(guó)Bio-Rad公司）；TGradientPCR儀（德國(guó)Biometra公司）；BioPhotometer D30核酸蛋白分析儀、5810R臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（德國(guó)Eppendorf公司）

2 方法

2.1 大鼠創(chuàng)面分組與模型的建立

48只大鼠中隨機(jī)取12只建立大鼠急性創(chuàng)面對(duì)照組（簡(jiǎn)稱對(duì)照組），其余36只制備慢性難愈合創(chuàng)面模型，再隨機(jī)均分為美洲蠊實(shí)驗(yàn)組（簡(jiǎn)稱實(shí)驗(yàn)組）、貝復(fù)濟(jì)陽(yáng)性對(duì)照組（簡(jiǎn)稱陽(yáng)性組）、模型組，各組均為12只。急性創(chuàng)面對(duì)照組模型：對(duì)照組大鼠在造模區(qū)常規(guī)備皮，然后行全層皮膚切除，但不使用藥物干預(yù)處理；慢性難愈合創(chuàng)面模型制備：參照付小兵[8]全層皮膚缺損法經(jīng)改進(jìn)制成大鼠慢性難愈合創(chuàng)面模型。大鼠腹腔注射鹽酸胺酮（100 mg/kg）麻醉后，在腰椎正中偏上備皮，用直徑約為2 cm的硬幣標(biāo)記面積造模，無(wú)菌條件下在造模區(qū)用外科方法作兩條深達(dá)筋膜、直徑為2 cm的全層皮膚缺損開放性創(chuàng)面，即刻皮下注射醋酸氫化可的松（6 mg/100 g）。

2.2 創(chuàng)面換藥及取材

各組換藥前均以1/5 000呋喃西林液清潔創(chuàng)面2次，每日換藥2次。實(shí)驗(yàn)組及陽(yáng)性組分別使用美洲大蠊體提取液紗條（0.2 ml/cm2）、貝復(fù)濟(jì)藥物紗條（60 U/cm2），模型組及對(duì)照組外敷兩層生理鹽水紗布（0.2 mL/cm2），然后加蓋紗布并膠布固定。分別在5、7、11 d 3個(gè)時(shí)間點(diǎn)每組隨機(jī)取3只大鼠，均采用相同部位，平行創(chuàng)面剪取0.5 cm×0.5 cm大小深達(dá)真皮層創(chuàng)面組織，質(zhì)量約50 mg，置于10%甲醛溶液進(jìn)行固定中備用。所有大鼠均在第11天取材后統(tǒng)一處死。2.3 指標(biāo)及檢測(cè)方法

2.3.1 RT-PCR檢測(cè)I/III型膠原的引物設(shè)計(jì) 根據(jù)超純RNA提取試劑盒的要求提取樣本的總RNA并按說(shuō)明進(jìn)行操作，Ⅰ型膠原引物序列：上游5-TGAGCCAGCAGATTGAGAAC-3，下游5-CCAGTGTCCATGTCGCAGA-3，PCR擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為470 bp；Ⅲ型膠原引物序列：上游5-TTCCTTTTGTTCTAATCTTGTCA-3，下游5-TAGCACCATTGAGACATTTTGA-3，PCR擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為224 bp；β-actin（內(nèi)參定量）引物序列為：上游5-GCTATTTGGCGCTGGACTT-3，下游5-GCGGCTCGTAGCTCTTCTC-3，PCR擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為495 bp。2.3.2 RNA提取及逆轉(zhuǎn)錄 從固定的肉芽組織中提取RNA并反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，并以該cDNA為模板，用針對(duì)目的基因設(shè)計(jì)合成的PCR引物進(jìn)行real-time PCR，以檢測(cè)組織中目的基因的表達(dá)。1.2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定RNA純度各組樣本總RNA濃度在0.301～0.568 μg/mL，A260/A280在1.821～1.945間，符合實(shí)驗(yàn)要求。第一鏈cDNA合成：取1.0 μg Total RNA加Nuclease-Free Water到無(wú)RNA酶的EP管中，混勻后離心，70 ℃溫浴10 min，立即置于冰上；按一定比例將其他試劑加入反應(yīng)體系中（冰上進(jìn)行），混勻，短暫離心；42 ℃反應(yīng)15 min，然后在70 ℃水浴鍋中水浴10 min使Reverse Transcriptase失活；將得到cDNA置于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3.3 I/III型膠原的PCR檢測(cè) （1）按照一定比例配制反應(yīng)體系20 ？滋L：將12×Real-time PCR mix/2×PCR mix10 ？滋L、cDNA模板1 ？滋L、上下游引物各1 ？滋L、ddH2O 7 ？滋L混勻；（2）擴(kuò)增程序： 94 ℃ 4 min預(yù)變性；94 ℃變性40 s，60 ℃退火30 s，擴(kuò)增40 cycle，72 ℃延伸5 min，4 ℃下保存 。

2.3.4 指標(biāo)測(cè)定 以1.2%瓊脂糖凝膠，在 0.5×TBE緩沖溶液中電泳進(jìn)行PCR產(chǎn)物鑒定，ChemiDoc MP凝膠成像分析儀在反射紫外燈下全自動(dòng)圖像掃描，分析Ⅰ/Ⅲ型膠原蛋白mRNA光密度值結(jié)果。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)分析軟件處理，該計(jì)量資料以“x±s”表示，符合正態(tài)分布，方差齊，則多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)，反之采用Kruskal Wallis H檢驗(yàn)，P<0.05表示有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，P<0.01表示統(tǒng)計(jì)有顯著意義。

3 結(jié)果

3.1 Ⅰ/Ⅲ型膠原蛋白mRNA表達(dá)

從表1、表2可以看出，Ⅰ/Ⅲ型膠原蛋白mRNA表達(dá)趨勢(shì)呈一致，第5～11天，模型組、陽(yáng)性組、實(shí)驗(yàn)組Ⅰ/Ⅲ型膠原蛋白mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著低于對(duì)照組，模型組最低（P<0.01），第5～7天，實(shí)驗(yàn)組Ⅰ/Ⅲ型膠原蛋白mRNA高于陽(yáng)性組（P<0.01），第11天，實(shí)驗(yàn)組Ⅰ/Ⅲ型膠原蛋白mRNA相對(duì)表達(dá)量低于陽(yáng)性組（P<0.01）。

3.2 Ⅰ/Ⅲ型膠原蛋白的比值

各組的I型膠原蛋白在修復(fù)過(guò)程中基本占主體地位，Ⅰ/Ⅲ型膠原蛋白的比值，對(duì)照組最高，陽(yáng)性組最低，模型組的在第7天兩者比值表達(dá)略低于第5、11天；實(shí)驗(yàn)組的Ⅰ/Ⅲ型膠原蛋白比值呈逐漸上升趨勢(shì)。結(jié)果見表3。

各組中，各階段Ⅰ/Ⅲ型膠原蛋白的比值，對(duì)照組最高，陽(yáng)性組最低。對(duì)照組前7天呈上升，而后下降趨勢(shì)，表明前中期Ⅰ型膠原蛋白占主體，后期稍有下降；模型組第5天在修復(fù)過(guò)程中，兩者比值達(dá)到最高，第7天下降，而后又逐漸上升，表明前期Ⅰ型膠原蛋白占主導(dǎo)，中期比率相對(duì)下降，后期Ⅲ型膠原蛋白比率上升；陽(yáng)性組在修復(fù)過(guò)程中的前7天兩者比重相差不大，第7天以Ⅲ型膠原為主體；實(shí)驗(yàn)組中兩者比值呈逐漸上升趨勢(shì)，表明前中期Ⅲ型膠原的比重較大，而后期相對(duì)下降，以Ⅰ型膠原蛋白為主體，見表3。

3.3 PCR檢測(cè)Ⅰ/Ⅲ型膠原蛋白mRNA電泳結(jié)果

Ⅰ/Ⅲ型膠原蛋白mRNA表達(dá)電泳結(jié)果，第1～3泳道是急性創(chuàng)面對(duì)照組，第4～6泳道是慢性創(chuàng)面模型組， 第7～9泳道是貝復(fù)濟(jì)陽(yáng)性組，第10～12泳道是美洲大蠊提取液實(shí)驗(yàn)組，可反映出4組之間Ⅰ/Ⅲ型膠原蛋白基因條帶大小和亮度有一定的差異及趨向性，對(duì)照組條帶大小及亮度明顯高于其余三組；對(duì)照組、模型組、陽(yáng)性組Ⅰ/Ⅲ型膠原蛋白基因條帶第5、7天大體一致，第11天亮度最高，而實(shí)驗(yàn)組呈現(xiàn)一定上升趨勢(shì)，且第7天條帶大小及亮度最高，見圖1-3。

4 討論

膠原蛋白是一種結(jié)構(gòu)呈三維螺旋狀的纖維蛋白質(zhì)，所形成的螺旋如網(wǎng)狀般相互聚合，能堅(jiān)固地支撐組織結(jié)構(gòu)，使創(chuàng)面富有強(qiáng)韌彈性，占人體蛋白總量的30%，主要分布于皮膚、黏膜等。其在器官的營(yíng)養(yǎng)、組織修復(fù)、細(xì)胞分化等方面發(fā)揮重要作用，促進(jìn)成纖維細(xì)胞的分化及加快新生血管、基質(zhì)的形成，進(jìn)一步激活巨噬細(xì)胞的吞噬功能從而提高機(jī)體免疫力，顯著減少了創(chuàng)面的感染率。此外，膠原蛋白的降解產(chǎn)物—羥基脯氨酸是機(jī)體修復(fù)細(xì)胞所必須的氨基酸，能為創(chuàng)面的修復(fù)提供豐富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)[9]，促進(jìn)肉芽組織生長(zhǎng)。而其中Ⅰ、Ⅲ型膠原在創(chuàng)面修復(fù)過(guò)程與修復(fù)質(zhì)量中起著至關(guān)重要的作用，Ⅰ型膠原粗大且擴(kuò)張能力強(qiáng)，Ⅲ型膠原纖細(xì)且柔韌性好[10]。Ⅰ型膠原占主體，決定組織的高韌性，Ⅲ型膠原包繞于外周，決定組織的柔韌性和彈性，Ⅲ型膠原比Ⅰ型膠原纖維纖細(xì)。Ⅰ型膠原占膠原總量的80%～85%，Ⅲ型膠原占膠原總量的15%～20%，Ⅲ型膠原含量越高，膠原纖維越細(xì)，彈性越好，瘢痕越輕，但膠原過(guò)度沉積也是瘢痕愈合形成的直接原因[11-12]。因此，Ⅰ、Ⅲ型膠原含量的比值關(guān)系決定最終的修復(fù)質(zhì)量。在創(chuàng)面愈合早期，Ⅲ型膠原蛋白對(duì)創(chuàng)面的修復(fù)發(fā)揮著重要的作用，Ⅲ型膠原相對(duì)Ⅰ型膠原相應(yīng)的比率上升，肉芽組織及早期瘢痕富含Ⅲ型膠原而富有彈性；之后，Ⅰ型膠原蛋白比例上升并占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)，組織強(qiáng)度增高使瘢痕明顯。但若是Ⅰ、Ⅲ型膠原含量大量增加，明顯高于正常皮膚組織，則會(huì)造成明顯的瘢痕疙瘩。

美洲大蠊提取液，是基于云南大理白族人民使用蜚蠊治療惡瘡的有效經(jīng)驗(yàn)從蜚蠊藥材中分離、精制而成的生物制劑?，F(xiàn)代藥理研究證明其具有消除炎性水腫、提高機(jī)體免疫力、加快壞死組織脫落、促進(jìn)肉芽組織生長(zhǎng)及血管增生等多種作用，從而可加速各類潰瘍及慢性難愈合創(chuàng)面的修復(fù)進(jìn)程；而在中醫(yī)藥研究中，美洲大蠊提取物具有通利血脈、散瘀活血、養(yǎng)陰生肌的作用，包含著中醫(yī)扶正驅(qū)邪相輔相成的治療法則，其通利、散瘀的成分能有效的祛除局部的瘀血邪毒， 疏通經(jīng)絡(luò)，通利血脈，達(dá)到通則不痛的目的。臨床觀察上已證實(shí)該藥物外用可快速激活局部免疫細(xì)胞，縮短創(chuàng)面愈合時(shí)間[13-14]。此外，筆者在臨床中將美洲大蠊提取物外用于肛管難愈合創(chuàng)面，取得滿意療效[15]。并在前期實(shí)驗(yàn)研究[7]發(fā)現(xiàn)美洲大蠊提取液能提高慢性難愈合創(chuàng)面VEGF的表達(dá)，從而加速創(chuàng)面的修復(fù)。

本實(shí)驗(yàn)顯示，第1～7天美洲大蠊提取液加速Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白mRNA的表達(dá)，第7天達(dá)到峰值，且Ⅰ型膠原占主體、Ⅲ型膠原相對(duì)比值較大，說(shuō)明前中期美洲大蠊提取液能促進(jìn)膠原合成，加速創(chuàng)面愈合；第7～11天，Ⅰ型膠原蛋白比例稍上升，但總膠原mRNA表達(dá)緩慢下降，說(shuō)明美洲大蠊提取液能進(jìn)一步促進(jìn)創(chuàng)面的組織化、且有效降低創(chuàng)面愈合后期膠原含量，從而減少瘢痕形成。

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