清霾飲對細顆粒物PM2.5致大鼠肺損傷的干預(yù)作用研究

田珺 匡驍 趙群菊 劉蓉芳 蔣俊和

〔摘要〕 目的 研究清霾飲對大氣細顆粒物PM2.5所致大鼠肺損傷的干預(yù)作用。方法 健康成年SD大鼠48只隨機分為3組：生理鹽水組、染毒組、清霾飲干預(yù)組。采集造模染毒所需濃度37.5 mg/mL的顆粒物懸液對染毒組和清霾飲干預(yù)組進行氣管滴注，并在染毒后進行灌胃給藥。最后一次染毒48 h 后，收集腹主動脈血和支氣管肺泡灌洗液，測定支氣管肺泡灌洗液（BALF）中的堿性磷酸酶（AKP）、乳酸脫氫酶（LDH）活力及（MDA）含量和血清中的丙二醛（MDA）含量及超氧化物歧化酶（SOD）活力。結(jié)果 （1）PM2.5染毒后，大鼠BALF中AKP、LDH活力及MDA含量均較生理鹽水組升高；清霾飲干預(yù)后，大鼠BALF中AKP、LDH 活力及MDA含量較PM2.5染毒組均降低，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；（2）PM2.5染毒后，大鼠血清中MDA含量升高，SOD活力較生理鹽水組降低；清霾飲干預(yù)后，較PM2.5染毒組血清中MDA含量明顯降低，SOD活力稍降低，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。結(jié)論 細顆粒物PM2.5可以導(dǎo)致大鼠肺部炎性損傷，清霾飲對肺部炎性損傷有拮抗作用。

〔關(guān)鍵詞〕 細顆粒物（PM2.5）；清霾飲；肺組織；支氣管肺泡灌洗液；肺損傷

〔中圖分類號〕R285.5；R256.1 〔文獻標志碼〕A 〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2018.04.009

〔Abstract〕 Objective To study the intervention effect of Qingmai Yin on lung injury induced by atmospheric fine particulate matter PM2.5 in rats. Methods The 48 healthy adult SD rats were randomly divided into three groups： normal saline group， exposure group， and Qingmai Yin intervention group. The concentration of 37.5 mg/mL was collected and the tracheal drip was administered to the exposed group and the Qingmai Yin intervention group. The model rats were given medicine by gavage after the dye dust. After the last exposure for 48 h， the abdominal aorta was given and the alveolar lavage fluid was collected. The activities of AKP， LDH and MDA in bronchocalveolar lavage fluid （BALF）， and MDA content and SOD activity in serum were measured. Results （1） The AKP， LDH activity and MDA content in BALF of PM2.5 poisoning group increased than those in normal saline group. The activity of AKP， LDH and MDA in BALF of rats decreased after the Qingmai Yin intervention， the differences between poisoning group and Qingmai Yin intervention group were statistically significant （P<0.05）； （2） After the PM2.5 exposure， the content of MDA in the serum was higher and the activity of SOD decreased than those in the normal saline group. After Qingmai Yin intervention， the content of MDA in the serum decreased and the activity of SOD decreased slightly， the difference was statistically significant （P<0.05）. Conclusion PM2.5 can lead to lung inflammatory injury in rats， and Qingmai Yin has an antagonistic effect on lung inflammatory injury.

〔Keywords〕 fine particles （PM2.5）； Qingmai Yin； lung tissue； bronchoalveolar lavage fluid； lung injury

霧霾天氣不單給氣候、環(huán)境、經(jīng)濟等方面造成明顯的負面影響[1]，還嚴重影響人們身心健康。其罪魁禍首為大氣細顆粒物PM2.5（particulate matter2.5）[2]。研究顯示PM2.5不僅損害呼吸、心血管、免疫、神經(jīng)等系統(tǒng)，而且導(dǎo)致腫瘤和出生缺陷[3]。2012年《柳葉刀》雜志上發(fā)表的《全球疾病負擔2010年報告》中稱大氣細顆粒物PM2.5是導(dǎo)致中國人口死亡僅次于飲食風險、高血壓和吸煙的第四大危害要素，并揭示2010年中國的室外空氣污染導(dǎo)致120萬人過早死亡，死亡人數(shù)幾乎占全世界死亡總數(shù)的40%[4]。PM2.5對呼吸系統(tǒng)作用機制為顆粒物侵入肺組織，產(chǎn)生局部氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)，氧化應(yīng)激可侵害生物膜脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和DNA，與炎性因子協(xié)同作用損傷呼吸道，造成肺功能下降及呼吸系統(tǒng)疾病發(fā)病率升高[5]。

有效干預(yù)PM2.5構(gòu)成的健康風險已成為我國醫(yī)藥研究范疇亟需解決的重大科學問題[6]。依據(jù)中醫(yī)傳統(tǒng)“藥食同源”的理論，選用藥食兩用的紅景天、桔梗、野菊花、山銀花、魚腥草、荷葉、甘草，研制出益肺、利咽解毒的清霾飲并探究其對PM2.5致大鼠肺損傷的拮抗作用。本實驗采集長沙市PM2.5，制備PM2.5懸液，以大氣PM2.5氣管滴注大鼠染毒構(gòu)成肺損傷為模型，給予最高劑量清霾飲進行干預(yù)，測定支氣管肺泡灌洗液（BALF）及血清中生化指標變化，探討清霾飲對大氣PM2.5致肺損傷的干預(yù)作用及可能機制。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

自擬方清霾飲藥材（紅景天9 g，桔梗6 g，野菊花6 g，山銀花6 g，魚腥草10 g，荷葉10 g，甘草3 g）購自老百姓大藥房連鎖股份有限公司，按中藥常規(guī)煎法進行煎煮，將以上飲片以500 mL水浸泡30 min，加熱至沸騰，后保持微沸30 min，濾過；殘渣加300 mL水，進行二次煎煮，保持微沸30 min，過濾，合并兩次的過濾藥液，將藥液濃縮至生藥量0.0625 g/mL；AKP試劑盒（批號：20170308），LDH 試劑盒（批號：20170310），MDA試劑盒（批號：20170310），SOD試劑盒（批號：20170306），均為南京建成生物公司；嶗應(yīng)2020型空氣采樣器、玻璃纖維濾膜（青島嶗山應(yīng)用技術(shù)研究所）；MK3酶標儀（Thermo公司）；H1850型臺式高速離心機（湖南湘儀實驗儀器開發(fā)有限公司）。

1.2 PM2.5懸液配制

PM2.5由湖南農(nóng)業(yè)大學于2016年11月-2016年12月在湖南農(nóng)業(yè)大學的八教前坪和長沙縣規(guī)模化養(yǎng)殖場幾個污染程度不同的采樣點連續(xù)采樣，用嶗應(yīng)2020型空氣采樣器（電子流量計）收集，記錄氣溫、氣壓。把濾膜剪成小塊，折半后投入超純水，超聲低溫震動30 min，紗布過濾洗脫液后，濾液用4 ℃、10 000 r/min、15 min離心3次，棄上清液，稱量后-20 ℃冰箱保存，用生理鹽水配成造模染毒所需濃度 37.5 mg/mL的顆粒物懸液，超聲震蕩15 min后混勻，4 ℃冰箱存好備用[7]。

1.3 實驗動物分組及給藥方法

48只雌雄參半SD大鼠（湖南中醫(yī)藥大學實驗動物中心供應(yīng)），體質(zhì)量180～220 g，許可證號：SCXK（湘）2013-0004，SPF 實驗室適應(yīng)性喂養(yǎng)1月半。采用隨機數(shù)字表法分為3組，分別為生理鹽水組、PM2.5染毒組、清霾飲干預(yù)組，每組16只。生理鹽水組大鼠用氣管滴注0.9%氯化鈉溶液（1.5 mg/kg），染毒組用設(shè)定濃度的PM2.5生理鹽水混懸液（1.5 mL/kg）進行氣管滴注，清霾飲干預(yù)組首次染毒后即給以清霾飲（37.5 mg/kg）進行干預(yù)。染毒每周1次，共4次。

1.4 標本采集

在最后一次染毒48 h后，對大鼠用10%水合氯醛進行腹腔注射麻醉。先取腹主動脈血5 mL，3 000 r/min分離血清15 min（離心半徑8 cm）。然后在大鼠主支氣管處剪成小“V”形狀，插入16號的灌胃針頭，結(jié)扎固定，用PBS緩沖液3.5 mL反復(fù)灌洗2次肺部，共收集支氣管肺泡灌洗液（BALF）10 mL，1 000 r/min離心10 min（離心半徑8 cm），收取上清液放于-80 ℃冰箱保存。

1.5 指標檢測

支氣管肺泡灌洗液和血清中生化指標的測定：測定支氣管肺泡灌洗液中的堿性磷酸酶（AKP）、乳酸脫氫酶（LDH）的活力及丙二醛（MDA）的含量，測定血清中的超氧化物歧化酶（SOD）活力及丙二醛（MDA）的含量測定，采用南京建成生物制品研究所提供的測定試劑盒。按試劑盒說明書要求嚴格操作。

1.6 統(tǒng)計學分析

全部數(shù)據(jù)均采用SPSS 21.0軟件包進行統(tǒng)計分析。實驗結(jié)果所有數(shù)據(jù)均采用“x±s”表示，多組間均數(shù)比較用單因素方差分析，組間兩兩比較方差齊者用LSD檢驗，方差不齊者用DunnettT3檢驗。P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠支氣管肺泡灌洗液中AKP、LDH、MDA的變化

各組大鼠支氣管肺泡灌洗液中AKP、LDH活力及MDA含量與生理鹽水組BALF比較，PM2.5染毒組大鼠AKP、LDH活力及MDA含量均升高，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。與染毒組比較，給予清霾飲灌藥后，干預(yù)組大鼠BALF中AKP、LDH活力及MDA含量均降低，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。結(jié)果如表1所示。

2.2 各組大鼠血清中MDA、SOD的變化

與生理鹽水組血清比較，PM2.5染毒組大鼠血清中MDA含量明顯升高（P<0.01），與染毒組相比，其干預(yù)組大鼠血清中MDA含量明顯降低（P<0.01）。與生理鹽水組相比，染毒組中SOD活力低于生理鹽水組（P<0.01），與染毒組相比，干預(yù)組大鼠血清中SOD活力稍降低，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。結(jié)果如表2所示。

3 討論

近年來，人們?nèi)找嬷匾暣髿釶M2.5對健康的危害，許多科學家都專研大氣顆粒物對機體的毒害機制，但是迄今為止仍不清楚確切的損傷機制。大氣顆粒物對肺組織的損傷機制主要包括氧化損傷和炎性損傷這兩大類。大氣PM2.5進入機體后直接作用于呼吸道，損壞肺泡腔毛細血管膜、血管基底膜，變換或破損肺泡Ⅰ型、Ⅱ型細胞形態(tài)，改變細胞通透性，致使細胞內(nèi)容物如各種蛋白、AKP、LDH等漏出[8]。AKP是反映肺泡Ⅰ型和Ⅱ型細胞受損程度的特異標志物[9]。LDH歸屬胞漿酶，來源于血液或肺損傷后組織滲漏，是細胞膜損傷的早期敏感指標，為細胞毒性標志物[10]。SOD能夠抵制機體內(nèi)的超氧陰離子損傷，MDA是細胞發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的代表性產(chǎn)物[11]，機體的抗氧化應(yīng)激水平增加后，會增加體內(nèi)的氧自由基，脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA的含量也會增加，而超氧化物歧化酶SOD屬于體內(nèi)防止氧化自由基重要酶類，能制止脂質(zhì)過氧化從而保護機體和組織，脂質(zhì)過氧化物能夠不可逆地損害細胞膜結(jié)構(gòu)和功能，體內(nèi)MDA的含量能反映機體的氧化應(yīng)激水平，SOD反映機體抗氧化水平[12]。本研究顯示，染毒組大鼠BALF中的AKP、LDH活力及MDA含量均高于生理鹽水組，闡明PM2.5經(jīng)過氣管滴注的染毒形式能加大細胞通透性而使細胞酶滲出增多，并對肺泡上皮-毛細血管發(fā)生毒性作用，導(dǎo)致肺損傷，與劉平安等[7]研究結(jié)果一致。干預(yù)組大鼠BALF中的AKP、LDH活力及MDA含量比染毒組明顯下降，干預(yù)組大鼠血清中MDA含量明顯降低（P<0.05），揭示清霾飲干預(yù)對PM2.5引起的肺應(yīng)激損傷有減輕作用。清霾飲干預(yù)組大鼠血清中SOD活力稍降低，考慮清霾飲只能輕量提高機體的抗過氧化水平（P<0.05）。這些結(jié)果都提示清霾飲干預(yù)對PM2.5引起的肺損傷有一定減輕作用。

如何利用中醫(yī)藥特有的優(yōu)勢有效防控PM2.5對大眾健康的潛在影響已開始成為國民基本的民生需求之一。黃耀生[13]稱霧霾的病性可解釋為濕、濁，通常與風、寒、熱之邪聯(lián)合隨口鼻侵犯身體。肺處上焦，為華蓋，霧霾濕濁之邪侵入，首先侵襲肺系，肺失宣降發(fā)為咳嗽。中醫(yī)認為霧霾傷肺的防治除了“避之有時”，做好防御措施外，更應(yīng)提高機體抵抗能力，使“正氣存內(nèi)，邪不可干”。程丑夫[1]認為霧霾病機是寒熱轉(zhuǎn)化和損傷正氣。清霾飲主要藥理作用體現(xiàn)了“未病先防”和“已病防變”的思想，具有益肺、解毒利咽、抗炎、抑制肺損傷、調(diào)節(jié)免疫作用，對霧霾所致的肺系病有著防治和改善作用。清霾飲主要成分為紅景天、桔梗、甘草、野菊花、山銀花、魚腥草、荷葉，本方由張仲景《傷寒論》“桔梗湯”加味而來。桔梗湯最早源于張仲景《傷寒論》311條：“少陰病，二三日，咽痛者，可用甘草湯。不瘥者，給桔梗湯”，后世又稱“甘桔湯”（《小兒藥證直訣》卷下）。桔梗辛苦且平，辛則散，苦則降，直入肺臟，宣肺止咳、祛痰排膿，故為君藥；甘草甘平，瀉火解毒、潤肺化痰。二藥合用，標本兼顧，能加強宣肺止咳、利咽解毒、祛痰排膿之功[14]。魚腥草味辛而寒，專入肺經(jīng)，具有清熱解毒、消癰排膿、利尿通淋的功能，主要用于肺癰吐膿、痰熱喘咳[15]，以助君力，故為臣藥。紅景天，其“味甘性寒、歸脾肺經(jīng)，有潤肺、清肺止咳、健脾益氣之效”，拮抗長期活動引起的LDH活性升高，還可提高小鼠血漿中SOD活性和顯著降低小鼠血漿中MDA含量，紅景天有抑制肺組織中炎癥因子表達，抗肺損傷作用，具有祛邪扶正之功[16-17]，故為佐助藥。野菊花和山銀花屬花類，且苦辛性寒，具有涼散風熱、清熱解毒功效，其黃酮類成分是目前國內(nèi)外公認的具有抗氧化活性的成分之一，具有抗炎癥、抗病毒、抗腫瘤、抗衰老、增強免疫及對內(nèi)皮細胞和心肌細胞的抗氧化保護作用，減少氧化應(yīng)激等多種藥理活性[18-21]，故為佐助藥。荷葉苦澀性平，歸肝、脾、胃經(jīng)，具有清暑利濕、涼血止血等功效，用于暑熱煩渴，脾虛泄瀉，主要活性成分為黃酮類，具有抗氧化活性和抗炎性、抗衰老、抑菌等藥理活性[22-23]，有“善治痰者治其生痰之源”之意，亦為佐助藥。生甘草其性甘寒，既可清熱解毒、利咽祛痰以助君力而寓“甘桔湯”之意，又可調(diào)和諸藥，故為佐使藥。諸藥合用，切合病機，隨證加減，療效顯著[24]。

綜上所述，本實驗證明，清霾飲可拮抗細顆粒物PM2.5造成的呼吸道損傷，其保護性機制與其抗氧化性和抗炎性有關(guān)聯(lián)，為清霾系列藥膳產(chǎn)品的開發(fā)提供了新思路，可產(chǎn)生一定的社會和經(jīng)濟效益，對促進中醫(yī)藥膳事業(yè)發(fā)展有著重要意義，也是中醫(yī)藥現(xiàn)代化與標準化發(fā)展的需要。

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