新型造模法制備功能性消化不良肝郁脾虛證大鼠模型

朱潔 王葉 郭璇 劉樂(lè)平 韓志飛

〔摘要〕 目的 從病因胃排空延緩、內(nèi)臟高敏性、心理因素等入手改良建立新的功能性消化不良肝郁脾虛證動(dòng)物模型。方法 將SD大鼠隨機(jī)分為5組：高脂組（A組）、大黃組（B組）、復(fù)合組（C組）、夾尾對(duì)照組（D組）、 空白對(duì)照組（E組）。除空白對(duì)照組，其余4組以束縛和游泳為基礎(chǔ)，在A組加入可以導(dǎo)致胃排空延緩的高脂，在B組加入可以導(dǎo)致脾虛的苦寒瀉下藥大黃煎劑，并將A、B進(jìn)行結(jié)合形成復(fù)合組（C組），而D組是國(guó)內(nèi)常用的造模方法即夾尾刺激法，且以D組作為對(duì)照，通過(guò)觀察行為學(xué)狀態(tài)，檢測(cè)胃排空率、小腸推進(jìn)率對(duì)造模結(jié)果進(jìn)行評(píng)價(jià)。結(jié)果 造模結(jié)束后，A、B、C、D組大鼠均出現(xiàn)扎堆、靠邊， 活躍度降低， 攻擊性減少， 易受驚嚇且易怒，毛發(fā)枯亂無(wú)光澤， 糞便變軟等表現(xiàn)；與E組相比，其他4組造模組的胃排空率和小腸推進(jìn)率均有降低，C、D組降低顯著，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。結(jié)論 選用復(fù)合組的造模方法可以使大鼠出現(xiàn)一系列的肝郁脾虛癥狀，并且有效地降低大鼠的胃排空率和小腸推進(jìn)率。

〔關(guān)鍵詞〕 功能性消化不良；肝郁脾虛證；動(dòng)物模型

〔中圖分類號(hào)〕R285.5；R965.1；R57 〔文獻(xiàn)標(biāo)志碼〕A 〔文章編號(hào)〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2018.04.002

〔Abstract〕 Objective From the delay of gastric emptying， visceral hypersensitivity， psychological factors and other causes to improve the establishment of a new animal model of dyspepsia rats with liver depression and spleen deficiency syndrome. Methods The SD rats were randomly divided into five groups： high fat group （group A）， rhubarb group （group B）， combination group （group C）， clip tail control group （group D）， blank control group （group E）. Except for the blank control group （group E）， the remaining four groups were given the basis training of restraint and swimming. In group A， the high fat caused delay of gastric emptying was added. In group B， bitter cold diarrhea decoction caused spleen deficiency was added， and group C was formed by combination of group A and group B. Group D as a control group was given a commonly used modeling method of tailgating stimulation. The modeling results were evaluated by observing behavioral status， gastric emptying rate， small intestine propulsion rate. Results After modeling， rats in group A， B， C and D appeared the behavior of getting together， keeping to the side， decreased activity， reduced aggression， vulnerable to scared and irritable， hair dull and dull， and soft stool. Compared with group E， the gastric empting rate and small intestine advance rate in other four groups decreased， and the decrease degree in group C and D was more obvious， the differences were statistically significant （P<0.01）. Conclusion The compounding method could make rats appear a series of symptoms of liver depression and spleen deficiency， and effectively reduce the gastric emptying rate and intestinal propulsion rate in rats.

〔Keywords〕 functional dyspepsia； liver depression and spleen deficiency； animal models

功能性消化不良（functional dyspepsia，F(xiàn)D）是一種常見(jiàn)的功能性胃腸病，且尚無(wú)器質(zhì)性原因可究，在全球范圍內(nèi)總患病率約為11.5%～14.5%[1]，在流行病學(xué)調(diào)查顯示國(guó)內(nèi)功能性消化不良的患病率為23.5%[2]。臨床表現(xiàn)主要為食欲不振、腹脹、腹痛、早飽、噯氣、惡心嘔吐等，其發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，目前以胃容受性受損、內(nèi)臟敏感性增高、胃腸動(dòng)力障礙為主要病理生理改變[3]。功能性消化不良動(dòng)物模型是進(jìn)行功能性消化不良相關(guān)研究的重要基礎(chǔ)，目前國(guó)內(nèi)外已建立多種FD動(dòng)物模型，常用的有郭氏夾尾應(yīng)激法[4]即用夾鼠尾的方法來(lái)激怒大鼠；碘乙酰胺灌胃法則是根據(jù)炎癥后內(nèi)臟敏感性增高的機(jī)制設(shè)計(jì)的，剛剛出生10 d的大鼠用0.1%的碘乙酰胺蔗糖溶液進(jìn)行灌胃，等到大鼠成熟期即可成為功能性消化不良大鼠模型[5]等單因素造模方法；也有復(fù)合因素造模方法，碘乙酰胺聯(lián)合夾尾刺激造模[6]；如韓秋艷等用慢性?shī)A尾激怒加高濃度大黃灌胃法造模[7]。但是單因素造模法存在刺激因素過(guò)于單一，存在與臨床實(shí)際情況相差太大的問(wèn)題，而復(fù)合因素的造模方法則能夠更為全面地模擬FD發(fā)病因素的多樣化、復(fù)雜化。研究人員從功能性消化不良的主要病因即胃排空延緩、內(nèi)臟高敏感、肝郁脾虛以及外邪致?。ㄈ顼嬍巢还?jié)、藥物所傷）入手，將已有的造模方法進(jìn)行組合改良，建立復(fù)合因素動(dòng)物模型，試圖探索出一種在造模過(guò)程中能降低動(dòng)物死亡率、更貼近自然發(fā)病情況的造模方法，為功能性消化不良的造模提供更好的思路及方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SD大鼠，SPF級(jí)，雌性，體質(zhì)量180～220 g，許可證號(hào)：SCXK（湘）20110003，由湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供。

1.1.2 藥物制備 生大黃（湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院）、碘酒、高脂飼料（湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司）[8]；生大黃，煎煮，濃縮成0.5 g/mL，備用。高脂飼料：84%玉米粉+15.5%豬油+0.5%膽固醇。半固體糊：取5 g羧甲基纖維素溶于100 mL蒸餾水中，分別加入奶粉8 g，糖4 g，淀粉4 g，2 mL碳素墨水，配成半固體糊[9]，置冰箱中冷藏保存，臨用前兩小時(shí)取出恢復(fù)至常溫。

1.1.3 主要器材 自制束縛架、夾尾器；AR2140電子天平（梅特勒托利多儀器上海有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 分組與造模 將30只大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)編號(hào)分組，即分為高脂組（A）、大黃組（B）、復(fù)合組（C）、夾尾對(duì)照組（D）及空白對(duì)照組（E）?？瞻讓?duì)照組正常喂養(yǎng)，其余四組均進(jìn)行束縛和游泳，每天早8：00-11：00將大鼠束縛于束縛架[10]上進(jìn)行固定，放入飼養(yǎng)箱中，每日3 h，連續(xù)21 d；另實(shí)驗(yàn)大鼠于每日14：00游泳12 min，持續(xù)3周。在上述造模方法基礎(chǔ)上在A組大鼠食用高脂飼料2周；B組采用灌胃的方式給予大黃煎劑10 g/（kg·d）連續(xù)給藥14 d；C組的造模方法為大黃煎劑+高脂飼料喂養(yǎng)+束縛+游泳；D組為國(guó)內(nèi)較常用夾尾刺激法，將該組3只大鼠同籠，用長(zhǎng)海綿鉗夾大鼠尾巴遠(yuǎn)端1/3處，以不破皮為度，令其暴怒，尋釁與其他大鼠撕打，以激怒全籠大鼠。每次刺激30 min，每日1次，連續(xù)刺激21 d。1.2.2 行為學(xué)狀態(tài)觀察 實(shí)驗(yàn)過(guò)程中通過(guò)肉眼觀察大鼠的皮膚毛發(fā)、行為狀態(tài)、活躍程度、情緒反應(yīng)、興奮程度、睡眠狀態(tài)及大便狀態(tài)，記錄大鼠的體質(zhì)量變化。

1.2.3 胃腸動(dòng)力檢測(cè) （1）胃排空率的測(cè)定：造模結(jié)束后禁食不禁水24 h，給予半固體糊2 mL灌胃[9]，30 min后處死，迅速打開(kāi)腹腔，剪取胃及全小腸，由吸水紙吸干胃外壁，稱取質(zhì)量后沿胃大彎剪開(kāi)，用生理鹽水沖洗，再吸干水分后稱量，胃排空率=1-[（胃全重-胃凈重）/灌胃量]×100%；（2）小腸推進(jìn)率的測(cè)定：分離腸系膜， 剪取幽門(mén)至回盲部的腸管[11]， 置于白紙上， 輕輕拉成直線， 測(cè)量腸管長(zhǎng)度為小腸總長(zhǎng)度， 從幽門(mén)至碳墨前沿的距離為碳墨在小腸內(nèi)推進(jìn)的距離。小腸推進(jìn)率=碳墨在小腸推進(jìn)的距離/小腸總長(zhǎng)度×100%[11]。

1.3 統(tǒng)計(jì)方法

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理實(shí)驗(yàn)所有數(shù)據(jù)用“x±s”表示， 均用SPSS 17.0軟件處理， 滿足方差齊性采用單因素方差分析，反之則使用非參數(shù)檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠一般狀態(tài)

實(shí)驗(yàn)期間空白對(duì)照組無(wú)異常情況，隨著造模時(shí)間的增加，四組模型組均出現(xiàn)皮膚毛發(fā)干枯少澤，少動(dòng)扎堆，活躍度降低，情緒反應(yīng)大、易怒或?qū)ν饨绱碳し磻?yīng)較少興奮，淡漠，體質(zhì)量減輕，倦怠嗜睡，便溏，肛門(mén)污穢等肝郁脾虛之相似癥狀。

造模第21天時(shí)，四組模型組大鼠體質(zhì)量與空白組相比雖有下降，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見(jiàn)表1。

2.2 胃腸動(dòng)力檢測(cè)

A、C、D三組胃排空率低于空白對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；B組胃排空率雖有下降，但差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；A、B組小腸推進(jìn)率低于空白對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；C、D組小腸推進(jìn)率低于空白對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；C、D組相比，沒(méi)有顯著差異性，不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，復(fù)合組大鼠的胃排空率和小腸推進(jìn)率降低顯著，從胃腸動(dòng)力障礙這個(gè)角度看采用新型造模方法可以有效制備肝郁脾虛證動(dòng)物模型，且實(shí)驗(yàn)中選用的復(fù)合因素造模法在理論上可以較全面地模擬FD患者的復(fù)雜發(fā)病機(jī)制及臨床表現(xiàn)。見(jiàn)表2。因此可以認(rèn)為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)新型造模方法是必要且有意義的。

2.3 動(dòng)物死亡率情況統(tǒng)計(jì)

在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，實(shí)驗(yàn)人員嚴(yán)格參照實(shí)驗(yàn)步驟與要求進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作，盡量減少因?qū)嶒?yàn)技術(shù)造成的死亡，在此條件下，夾尾組出現(xiàn)1例死亡，經(jīng)分析，可能與長(zhǎng)期接受夾尾刺激，在飲食飲水減少，便溏等情況下造成免疫力降低有關(guān)，而其余模型組在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中均未出現(xiàn)死亡。

3 討論

中醫(yī)學(xué)運(yùn)用五行學(xué)說(shuō)解釋臟腑的生理及相互關(guān)系，曰肝屬木，主疏泄，脾屬土，為氣血生化之源，五行相克理論說(shuō)明肝木克脾土。隨著中醫(yī)學(xué)的發(fā)展，衍生出“顛倒五行”學(xué)說(shuō)以便于更加合理的解釋五臟之間的相互作用，由此可知土亦克木，清·程芝田也曾提到“木可克土，土也可克木，脾土健旺則肝木自平也”。肝與脾之間相互制約、相互依賴的關(guān)系稱為肝脾調(diào)和，高月香等指出若肝脾任何一方偏盛偏衰，則出現(xiàn)肝脾不調(diào)[12]，而肝郁脾虛證的病機(jī)便在于肝脾不調(diào)。在西醫(yī)學(xué)研究中FD是一種常見(jiàn)的功能性胃腸病，且尚無(wú)器質(zhì)性原因可究。

胃排空延緩是造成FD的重要發(fā)病機(jī)制之一，早期的Meta分析納入了17項(xiàng)研究包含868名FD患者和397例對(duì)照，結(jié)果顯示40%的FD患者存在胃排空的延緩[13]；近年來(lái)隨著人們工作生活壓力的增大，發(fā)病率逐漸增高，臨床表現(xiàn)主要為食欲不振、腹脹、腹痛、早飽、噯氣、惡心嘔吐等[14]，歐洲的相關(guān)研究認(rèn)為餐后不適、惡心、嘔吐的癥狀與胃排空延緩相關(guān)[15]；Tack等對(duì)連續(xù)入組的800例FD患者的研究發(fā)現(xiàn)：胃排空功能障礙與早飽、惡心、嘔吐及飽脹感相關(guān)。由此表明胃排空延緩可能與功能性消化不良有一定的關(guān)系[16]。長(zhǎng)期的高脂飼料喂養(yǎng)能夠上調(diào)位于胃腸道的nNOS以及TGR5的表達(dá)，影響非腎上腺能非膽堿能，最終造成胃排空延緩[8]；相關(guān)研究顯示高脂飼料可以造成大鼠胃腸動(dòng)力異常，如胃排空率的降低、胃節(jié)律的障礙等[17]；但是食用高脂飼料的大鼠血脂變化有一定的影響，給實(shí)驗(yàn)增添了不確定因素[18]，且長(zhǎng)期喂養(yǎng)高脂飼料導(dǎo)致胃排空延緩的機(jī)制尚未清晰，有待進(jìn)一步的研究。大黃性味苦寒，有“傷元?dú)猓年幯?，損脾胃以致虛的性質(zhì)”，其作用于健康機(jī)體的主要病理改變?yōu)閾p傷正氣，會(huì)出現(xiàn)耗傷津液，丟失離子，降低體溫，減緩代謝等不良反應(yīng)[19]。基于現(xiàn)有研究現(xiàn)狀，高脂是造成胃排空延緩的有效方法，而大黃是脾虛證造模的經(jīng)典方法，但將兩者結(jié)合進(jìn)行造模卻不曾見(jiàn)，本實(shí)驗(yàn)將這兩者有機(jī)結(jié)合，以期制備出合理有效的動(dòng)物模型。

本實(shí)驗(yàn)中A、B、C、D四組均能有效降低大鼠小腸推進(jìn)率，其差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但A、B組對(duì)大鼠小腸推進(jìn)率降低的影響不及C、D組，C、D組降低胃排空率效果明顯，而A、B組不明顯。通過(guò)對(duì)大鼠的胃排空率檢測(cè)與行為狀態(tài)學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)，在所有實(shí)驗(yàn)組中，C組對(duì)大鼠胃排空率以及小腸推進(jìn)率影響最大，其一般狀態(tài)也更接近于FD的臨床特征。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，C組復(fù)合組作為本實(shí)驗(yàn)創(chuàng)新的造模方法，該法不但能夠有效造出FD模型，并且具有一定優(yōu)勢(shì)。高脂與大黃的組合不僅實(shí)現(xiàn)了多種致病因素的結(jié)合，還有效地實(shí)現(xiàn)了中西醫(yī)的有機(jī)結(jié)合，與夾尾組相比，減少了對(duì)實(shí)驗(yàn)人員造成傷害的可能性，降低了大鼠死亡率，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中該組無(wú)大鼠死亡；與其他各組相比，該組多種單一因素的結(jié)合與該病臨床發(fā)病機(jī)制更為切合。但本實(shí)驗(yàn)依然存在一定的缺陷，實(shí)驗(yàn)中對(duì)FD模型大鼠胃收縮頻率、胃內(nèi)壓、胃電圖以及其它胃腸激素的影響均未涉及，有待于進(jìn)一步的深入研究。本文認(rèn)為實(shí)驗(yàn)造模方法更側(cè)重于造成大鼠脾虛證，對(duì)大鼠肝郁證卻有所忽略；功能性消化不良肝郁脾虛證的發(fā)病率逐漸增高，生理因素作為其主要因素值得深究，但心理因素對(duì)該病也有著了不可忽略的影響。臨床實(shí)踐發(fā)現(xiàn)，心理壓力大、心情抑郁確實(shí)是造成機(jī)體發(fā)病不可忽視的因素，且精神心理因素既是致病因素，同時(shí)FD患者病情反復(fù)發(fā)作也會(huì)加重患者的抑郁情緒。在FD患者與正常人的心理調(diào)查中發(fā)現(xiàn)FD患者多伴有抑郁焦慮等負(fù)面情緒，F(xiàn)D患者的心理健康水平顯著低于正常人[20]。部分學(xué)者針對(duì)FD患者采用抗抑郁藥物治療，能有效改善臨床癥狀，也提示心理因素在FD的發(fā)病機(jī)制種占據(jù)重要地位[21]?！秲?nèi)經(jīng)》中也有提及：“怒傷肝，久則郁……病多發(fā)于肝，三日而之脾”，肝郁則橫逆犯脾，脾失健運(yùn)。由此看來(lái)，F(xiàn)D與情志抑郁心理因素密切相關(guān)?；谇拔乃觯P者認(rèn)為實(shí)驗(yàn)有待進(jìn)一步的研究改進(jìn)。

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