Box—Behnken響應(yīng)面法優(yōu)化徐長卿配方顆粒揮發(fā)油—β—CD包合物制備工藝

高杰 李哲 李雪利 高晗 屈云萍 李軍山

摘 要：為了解決徐長卿揮發(fā)油加油難及加入后的穩(wěn)定性問題，采用Box- Behnken響應(yīng)面法，優(yōu)選出徐長卿配方顆粒揮發(fā)油-β-CD包合物的制備工藝。在單因素試驗的基礎(chǔ)上，采用3因素3水平Box-Behnken設(shè)計對徐長卿配方顆粒揮發(fā)油-β-CD包合工藝進行優(yōu)選，以揮發(fā)油包合率及包合物收率為考察指標，考察揮發(fā)油與β-CD比例、包合溫度、包合時間對結(jié)果的影響。結(jié)果表明：優(yōu)選的包合工藝條件為揮發(fā)油與β-CD質(zhì)量比為1∶8.34，包合溫度為50.2 ℃，包合時間為2.17 h。在此條件下，揮發(fā)油包合率為72.19%，包合物收率為75.06%，綜合評分為96.41，RSD值為1.1%。優(yōu)選的包合工藝包合率高，工藝穩(wěn)定可行，可為配方顆粒揮發(fā)油的工業(yè)化生產(chǎn)提供數(shù)據(jù)支持。

關(guān)鍵詞：中藥藥劑學(xué)；徐長卿；配方顆粒；Box-Behnken 響應(yīng)面法；β-CD；包合工藝

中圖分類號：：R284.2 文獻標志碼：A

文章編號：1008-1534（2018）05-0377-06

徐長卿為蘿藦科植物徐長卿Cynanchum paniculatum（Bge.）Kitag的干燥根及根莖，可祛風(fēng)、化濕、止痛、止癢，用于風(fēng)濕痹通、胃痛脹滿、牙痛、腰痛、跌撲傷痛、風(fēng)疹、濕疹等病的治療[1]。徐長卿主要含有甾類化合物及揮發(fā)性成分。有文獻報道，丹皮酚是徐長卿揮發(fā)油的主要成分，占比高達90%[2]。目前，徐長卿配方顆粒生產(chǎn)過程中揮發(fā)油的加入采用手工噴壺方法，存在溶油耗時、加入不均勻及花粒等問題，同時中間產(chǎn)品儲存過程及包裝后隨著儲存時間的延長，揮發(fā)油會因慢慢揮發(fā)而造成損失。為了解決徐長卿揮發(fā)油加油難及加入后的穩(wěn)定性等問題，對徐長卿揮發(fā)油β-CD包合工藝進行了探索研究。近年來中國多采取正交設(shè)計優(yōu)化中藥揮發(fā)油的包合工藝，試驗次數(shù)較少，但精度不高。響應(yīng)面法作為一種新型的試驗設(shè)計方法，具有試驗次數(shù)少、精度高、預(yù)測值接近真實值等優(yōu)點，應(yīng)用范圍愈加廣泛[3-4]。筆者采用響應(yīng)面法，選擇揮發(fā)油包合率及包合物收率為考察指標，以揮發(fā)油與β-CD質(zhì)量比、包合溫度、包合時間為影響因素，確定徐長卿配方顆粒揮發(fā)油的包合工藝[5-8]，為工業(yè)化生產(chǎn)提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料與儀器

1.1 材料

徐長卿揮發(fā)油，批號為16062311，神威藥業(yè)集團有限公司提供；95%（體積分數(shù)，下同）乙醇，分析純，批號為160107，天津市申泰化學(xué)試劑有限公司提供；β-CD（β-環(huán)糊精），批號為160409，安徽山河藥用輔料股份有限公司提供；丹皮酚對照品，批號為110708-201506，中國藥品生物制品檢定所提供。

1.2 儀器

EMS-20磁力攪拌水浴鍋，江蘇金壇市儀都儀器有限公司提供；CPA225D分析天平，賽多利斯公司提供；JM-A5002電子天平，浙江余姚市紀銘稱重校驗設(shè)備有限公司提供；水循環(huán)真空泵，上海申生科技有限公司提供；DHG-9140A熱風(fēng)循環(huán)鼓風(fēng)干燥箱，上海精宏實驗設(shè)備有限公司、太倉精宏儀器設(shè)備有限公司提供；LC-20AT高效液相色譜儀，島津儀器設(shè)備有限公司提供；KH3200E型超聲波清洗器，江蘇昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司提供。

2 試驗方法

2.1 徐長卿配方顆粒揮發(fā)油的提取

取徐長卿飲片200 g，加入8倍量的水，保持微沸狀態(tài)水蒸氣蒸餾，提取至揮發(fā)油不再流出，得到油水混合物。將得到的油水混合物放入4 ℃冷藏庫內(nèi)放置24 h，使油水自然分層，分離回收揮發(fā)油層，即得。

2.2 徐長卿配方顆粒揮發(fā)油包合物的制備

2.2.1 徐長卿配方顆粒揮發(fā)油乙醇溶液的制備

取徐長卿配方顆粒揮發(fā)油，加入等量95%的乙醇進行溶解，混合均勻后備用。

2.2.2 β-CD飽和水溶液的制備

稱取各試驗方案中規(guī)定量的β-CD，加入處方量的純化水，在各方案規(guī)定的溫度下制成飽和水溶液，保溫，備用。

2.2.3 徐長卿配方顆粒揮發(fā)油包合物的制備

將制備好的β-CD飽和水溶液置于EMS-20磁力攪拌水浴鍋內(nèi)，按各試驗方案設(shè)定的包合條件進行包合。將徐長卿配方顆粒揮發(fā)油乙醇溶液緩慢滴入β-CD飽和水溶液中，待揮發(fā)油乙醇溶液全部加入后開始計時，繼續(xù)攪拌至規(guī)定時間，放至室溫，于4 ℃冷藏24 h，抽濾，用20 mL無水乙醇洗滌3次，置于熱風(fēng)循環(huán)鼓風(fēng)干燥箱內(nèi)，于45 ℃干燥5 h。

2.3 包合物收率及揮發(fā)油包合率的測定

2.3.1 揮發(fā)油包合率測定

1）丹皮酚含量測定[9-10]

色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗：以十八烷基鍵合硅膠為填充劑，甲醇-水（二者體積比為45∶55）為流動相，檢測波長為274 nm，流速為1.0 mL/min，柱溫為30 ℃，理論板數(shù)按丹皮酚計算應(yīng)不低于3 000。

對照品溶液的制備：精密稱取丹皮酚對照品適量，加入甲醇制成0.1 mg/mL的溶液，作為對照品溶液。

供試品溶液的制備：取本品約0.1 g，置于25 mL量瓶中，加甲醇定容至刻線，超聲30 min，放至室溫，補加甲醇至刻度，過濾，取續(xù)濾液作為供試品溶液，即得。

2）線性關(guān)系考察

精密吸取丹皮酚對照品溶液8，12，20，30，40 μL，按前述色譜條件測定，記錄峰面積，并以峰面積對對照品進樣量作圖，繪制標準曲線，得到回歸方程為y=4 764.9x-62 504，R2=0.999 9。結(jié)果表明，丹皮酚在844.8～4 224 μL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。線性關(guān)系如圖1所示。

3）精密度試驗

精密吸取同一對照品溶液10 μL，按前述色譜條件重復(fù)進樣6次，丹皮酚對照品峰面積值的RSD值為0.4%（n=6），表明儀器的精密度良好。

4）重現(xiàn)性試驗

取同一包合物，按前述方法制備供試品溶液，平行操作6次，測定丹皮酚峰面積，計算平均含量為104.7 mg/g，含油率為12.35%，RSD值為0.2%。

5）穩(wěn)定性試驗

取同一包合物，按前述方法制備供試品溶液，分別于室溫下0，2，4，8，12 h進樣，測定丹皮酚峰面積，結(jié)果得到RSD值為0.28%，說明供試品溶液在室溫下12 h內(nèi)穩(wěn)定。

6）回收率試驗

取同一批已知含量的樣品6份，各0.1 g，采用加樣回收法，精密加入一定量的丹皮酚對照品，按照供試品溶液的制備方法和色譜條件進行含量測定，并計算加樣回收率。結(jié)果得到平均回收率為99.97%，RSD值為0.36%。

7）揮發(fā)油包合率

分別精密吸取對照品溶液與徐長卿配方顆粒揮發(fā)油各10 μL，注入液相色譜儀測定，得到空白回收率為83.64%。再分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液各10 μL，注入液相色譜儀測定，得到樣品的實際含油量。揮發(fā)油包合率=包合物實際含油量/（揮發(fā)油空白回收率×投油量）×100%[8]。

2.3.2 包合物收率測定

包合物收率=包合物質(zhì)量/（β-CD質(zhì)量+投油量）×100%[8]。

2.3.3 評價指標

以揮發(fā)油包合率和包合物收率的綜合評分為考察指標，2個指標的權(quán)重為6∶4，綜合評分=（揮發(fā)油包合率/揮發(fā)油包合率最高值）×60+（包合物收率/包合物收率最高值）×40[9]。

3 結(jié)果與分析

3.1 單因素考察試驗

3.1.1 β-CD與純化水比例的影響

稱取β-環(huán)糊精3份，各20 g，分別加入120，160，200 g的純化水，置于磁力攪拌水浴鍋內(nèi)，于60 ℃制成飽和水溶液。將徐長卿配方顆粒揮發(fā)油1 g與乙醇溶液1 mL混合均勻，緩慢滴入β-CD飽和水溶液中，攪拌2 h，放冷，放入冰箱中冷藏24 h，抽濾，用20 mL無水乙醇洗滌3次，于45 ℃干燥5 h。測定揮發(fā)油包合率及包合物收率，結(jié)果如圖2所示，可以看出，β-CD與純化水質(zhì)量比為1∶8時綜合評分最高。

3.1.2 揮發(fā)油與β-CD比例的影響

稱取β-環(huán)糊精4份，各12 g，加入96 g純化水，置于磁力攪拌水浴鍋內(nèi)，于60 ℃制成飽和水溶液。分別將徐長卿配方顆粒揮發(fā)油2，1.5，1.2，1 g與等量乙醇溶液混合均勻，緩慢滴入β-CD飽和水溶液中，攪拌2 h，放冷，放入冰箱中冷藏24 h，抽濾，用20 mL無水乙醇洗滌3次，于45 ℃干燥5 h。測定揮發(fā)油包合率及包合物收率，結(jié)果如圖3所示，可以看出，β-CD與揮發(fā)油質(zhì)量比為8∶1時綜合評分最高。

3.1.3 包合時間的影響

稱取β-環(huán)糊精4份，各12 g，加入96 g純化水，置于磁力攪拌水浴鍋內(nèi)，于60 ℃制成飽和水溶液。將徐長卿配方顆粒揮發(fā)油1.5 g與等量乙醇溶液混合均勻，緩慢滴入β-CD飽和水溶液中，分別攪拌1，2，3，4 h，放冷，于冰箱中冷藏24 h，抽濾，用20 mL無水乙醇洗滌3次，于45 ℃干燥5 h。測定揮發(fā)油包合率及包合物收率，結(jié)果如圖4所示，可以看出，包合時間為2 h時綜合評分最高。

3.1.4 包合溫度的影響

稱取β-CD 4份，各12 g，加入96 g純化水，置于磁力攪拌水浴鍋內(nèi)，分別于40，50，60，70 ℃制成飽和水溶液。將徐長卿配方顆粒揮發(fā)油1.5 g與等量乙醇溶液混合均勻，緩慢滴入β-CD飽和水溶液中，攪拌2 h，放冷，放入冰箱冷藏24 h，抽濾，用20 mL無水乙醇洗滌3次，于45 ℃干燥5 h。測定揮發(fā)油包合率及包合物收率，結(jié)果如圖5所示，可以看出，包合溫度為50 ℃時綜合評分最高。

3.2 響應(yīng)面優(yōu)化法試驗設(shè)計及結(jié)果分析

依據(jù)Box-Behnken的中心組合設(shè)計原理，考慮單因素試驗的結(jié)果設(shè)計自變量，以揮發(fā)油包合率和包合物收率的綜合評分為響應(yīng)值，通過響應(yīng)面分析進行徐長卿配方顆粒揮發(fā)油β-CD包合工藝條件的優(yōu)化。

3.2.1 因素選擇

在單因素試驗基礎(chǔ)上，選取對揮發(fā)油包合率和包合物收率的綜合評分影響顯著的3個因素（揮發(fā)油與β-CD比例（A）、包合時間（B）、包合溫度（C）），采用3水平的響應(yīng)面分析法進行試驗設(shè)計，因素水平編碼見表1。

3.2.2 響應(yīng)面試驗

利用Design-Expert8.0.5軟件進行試驗設(shè)計，本試驗共含有17個試驗點，其中12個為析因點，5個為零點。Box-Behnken試驗方案及結(jié)果見表2。

3.2.3 模型的建立及方差分析

采用Design-Expert8.0.5軟件對綜合評分結(jié)果進行二次多元回歸擬合，回歸方程為

Y=95.53+2.59A+0.16B+1.62C+1.10AB+0.82AC-0.27BC-7.95A2-9.70B2-5.09C2，相關(guān)系數(shù)R2=0.990 5。對該模型進行方差分析，結(jié)果見表3。

表3方差分析結(jié)果表明，該模型具有極顯著水平，足以擬合試驗數(shù)據(jù)。失擬項不顯著（P>0.05），說明試驗誤差小，可信度高，因此可以用于徐長卿配方顆粒揮發(fā)油β-CD包合工藝的分析和預(yù)測。

3.2.4 響應(yīng)面分析

由方差分析結(jié)果可以看出，AB交互效應(yīng)顯著，AC和BC交互效應(yīng)不顯著，等高線圖及效應(yīng)面圖見圖6。從綜合評分考慮各個因素的影響程度大小為因素A（揮發(fā)油與β-CD質(zhì)量比）>因素C（包合時間）>因素B（包合溫度）。

3.3 響應(yīng)面優(yōu)化徐長卿配方顆粒揮發(fā)油β-CD包合工藝條件

利用Design-Expert 8.0.5軟件分析給出的最優(yōu)干燥工藝為揮發(fā)油與β-CD質(zhì)量比為1∶8.34，包合溫度為50.2 ℃，包合時間為2.17 h。在此工藝條件下，綜合得分為95.899。

3.4 最佳工藝參數(shù)的驗證

在優(yōu)選出的最佳工藝條件下進行驗證試驗（n=3），得到包合物收率為75.06%，揮發(fā)油包合率為72.19%，綜合得分為96.41，RSD值為1.1%。因此，試驗結(jié)果與模型預(yù)測值基本一致。

4 結(jié) 論

1） 揮發(fā)油性質(zhì)不穩(wěn)定、易揮發(fā)，具有刺激性，溶解性差，故成藥性差。將環(huán)糊精與揮發(fā)油包合后，可增加藥物的穩(wěn)定性及揮發(fā)油的溶解度[11]，減少了揮發(fā)油的揮發(fā)，還可掩蓋不良氣味[12]。因此，環(huán)糊精包合技術(shù)被廣泛用于揮發(fā)油的制劑過程。

2） 通過單因素試驗和響應(yīng)面分析，對徐長卿配方顆粒揮發(fā)油β-CD包合工藝進行了優(yōu)化，打破了中藥配方顆粒制備過程中揮發(fā)油的傳統(tǒng)加入方式，增強了藥物的穩(wěn)定性及服藥適應(yīng)性[13]，得到了揮發(fā)油與β-CD比例、包合溫度、包合時間對包合物收率、揮發(fā)油包合率的回歸模型，通過分析證明所建模型有效。

3）響應(yīng)面法通過試驗數(shù)據(jù)模擬出非線性的曲面模型，預(yù)測試驗最優(yōu)方案[14-15]。利用Box-Behnken的中心組合設(shè)計原理，可使工作量大為減少，快速準確地優(yōu)化出最佳包合工藝。

4）客觀評價了徐長卿配方顆粒揮發(fā)油β-CD的包合過程，避免了因主觀因素對試驗結(jié)果造成的誤差，但關(guān)于揮發(fā)油加入方式對產(chǎn)品藥理作用產(chǎn)生的影響尚待今后作進一步的研究。

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