生物檢測(cè)技術(shù)PCR及其在獸醫(yī)微生物檢測(cè)中的應(yīng)用

何旭 孫代鵬

摘要：目前，在生物檢測(cè)技術(shù)當(dāng)中所采用的PCR技術(shù)，是一種基于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的技術(shù)手段，也被稱為無細(xì)胞分子克隆系統(tǒng)技術(shù)。首先對(duì)現(xiàn)階段PCR生物檢測(cè)技術(shù)的基本原理和特征進(jìn)行簡(jiǎn)述，并以此為基礎(chǔ)，總結(jié)分析了PCR技術(shù)在獸醫(yī)領(lǐng)域微生物檢測(cè)當(dāng)中的應(yīng)用方法，從而探究技術(shù)的發(fā)展方向。

關(guān)鍵詞：微生物檢測(cè);生物檢測(cè)技術(shù);PCR;發(fā)展

中圖分類號(hào)：S852.2

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：B doi： 10.3969/j.issn.2096-3637.2018.08.007

0 前言

PCR技術(shù)最早出現(xiàn)于1985年的美國getus公司，這種技術(shù)檢測(cè)方法在特定的DNA片段當(dāng)中能夠進(jìn)行微量擴(kuò)散，從而達(dá)到檢測(cè)目的。在研究領(lǐng)域，PCR技術(shù)較高的靈敏度和特異性特點(diǎn)。隨著技術(shù)發(fā)展與創(chuàng)新，目前PCR技術(shù)應(yīng)用更加廣泛，除了在基因克隆方面得到長(zhǎng)足應(yīng)用外，在獸醫(yī)領(lǐng)域的治療診斷中，也得到了充分的運(yùn)用。因此，探究PCR技術(shù)，對(duì)實(shí)現(xiàn)微生物的精準(zhǔn)檢測(cè)意義十分重大。

1 PCR技術(shù)的原理與應(yīng)用特征

1.1 PCR技術(shù)原理

在已知技術(shù)的作用下，各種DNA片段序列會(huì)得到有效擴(kuò)增，再加上人工合成DNA片段的相互作用，可以在兩條鏈的末端進(jìn)行互補(bǔ)，從而將核苷酸引物突顯出來，在該種方式的作用之下，待檢DNA序列在酶的作用下會(huì)出現(xiàn)擴(kuò)增，該項(xiàng)技術(shù)也被人們稱之為PCR技術(shù)。通俗意義上來講，PCR就是體外人工選擇性擴(kuò)增DNA的一種方法，它類似于生物體內(nèi)的DNA的復(fù)制。在整個(gè)反應(yīng)過程之中，DNA模板會(huì)經(jīng)歷變性、退火和延伸3個(gè)過程，并由若干個(gè)循環(huán)序列組成。首先，在高溫作用下，DNA模板會(huì)出現(xiàn)變性解鏈，之后在通過降溫，促使寡核苷酸和模板DNA鏈在三端出現(xiàn)退火現(xiàn)象。另外，在聚合酶的作用下，有4種DNTP底物存在，并在模板互補(bǔ)過程中形成新的鏈條。除此之外，在單一拷貝過程中，基因可以將25～ 30作為基數(shù)，最終擴(kuò)展到100萬～200萬之間[1]。在擴(kuò)增后期，由于產(chǎn)物積累，使原來呈指數(shù)擴(kuò)增的反應(yīng)變成平坦的曲線，產(chǎn)物不再隨循環(huán)數(shù)而明顯上升，這稱為平臺(tái)效應(yīng)。平臺(tái)期會(huì)使原先由于錯(cuò)配而產(chǎn)生的低濃度非特異性產(chǎn)物繼續(xù)大量擴(kuò)增，達(dá)到較高水平。因此，應(yīng)適當(dāng)調(diào)節(jié)循環(huán)次數(shù)，在平臺(tái)期前結(jié)束反應(yīng)，減少非特異性產(chǎn)物。到達(dá)平臺(tái)期所需循環(huán)次數(shù)取決于樣品中模板的拷貝[2]。

1.2 PCR技術(shù)特征

在PCR反應(yīng)結(jié)束之后，便會(huì)產(chǎn)生新的引物，這種還包括各種聚合酶及緩沖液，其基本技術(shù)特征主要集中的以下幾方面：首先是引物，在DNA片段擴(kuò)增過程中，主要涉及到寡核苷酸作用下，PCR擴(kuò)展特性中的關(guān)鍵因素得到了有效突顯，在引物設(shè)計(jì)過程中，還能對(duì)PCR擴(kuò)展成效進(jìn)行突顯。一般來說，由于堿基在鏈條之中的不斷重復(fù)，引物間的Tm將會(huì)與標(biāo)準(zhǔn)值更加接近，避免GC含量出現(xiàn)過高情況。其次是DNA聚合物特點(diǎn)，截止到目前，PCR在擴(kuò)展之中可以對(duì)DNA聚合酶進(jìn)行充分應(yīng)用，且應(yīng)用類型為TagDNA，該類型主要在水生棲熱菌作用下產(chǎn)生，具有極強(qiáng)的熱穩(wěn)定性。如果PCR的擴(kuò)展能力較高，便會(huì)對(duì)具體的DNA特性產(chǎn)生影響。一般來說，在100 uL反應(yīng)體系的作用下，2單位的PCR技術(shù)將會(huì)得到有效應(yīng)用。另外，由于耐熱聚合酶在RNA反轉(zhuǎn)錄過程中大量增加，操作程序出現(xiàn)較大簡(jiǎn)化，從而實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄效率的進(jìn)一步提升。最后，為了將檢測(cè)效率進(jìn)行提升，相關(guān)研究人員對(duì)緩沖液進(jìn)行了積極應(yīng)用，在此過程中，緩沖液的主要類型為10～50 mol的HCI體系，切記不能將Tag酶和緩沖液較差使用[3]。

2 PCR技術(shù)在曾醫(yī)微生物檢測(cè)中的應(yīng)用

通過對(duì)獸醫(yī)微生物檢測(cè)工作的分析可知，傳統(tǒng)方法用于微生物監(jiān)測(cè)，步驟十分繁瑣，且局限性較強(qiáng)，具體表現(xiàn)為：這種檢測(cè)方法要求待測(cè)樣品經(jīng)被檢測(cè)微生物富集培養(yǎng)一段時(shí)間后，直至微生物數(shù)量達(dá)到既定的相應(yīng)水平，方可分離并進(jìn)行檢測(cè)。相比之下，PCR技術(shù)則可有效避免上述弊端，在獸醫(yī)微生物檢測(cè)中，這種檢測(cè)技術(shù)僅需通過特定的核苷酸引物，快速分析并確定樣本中的微生物種類[4]。

在實(shí)際檢驗(yàn)過程中，具體檢測(cè)流程為：提取細(xì)菌靶DNA，采用過濾處理方法或離心處理方法，從待檢樣品中分離出細(xì)菌細(xì)胞;對(duì)細(xì)菌細(xì)胞進(jìn)行裂解處理，經(jīng)過核酸純化處理后，為后續(xù)檢驗(yàn)奠定基礎(chǔ)。除了這種方法，出于便捷性目的，還可以通過直接裂解待檢樣品中細(xì)菌細(xì)胞的方式，抽提其中所在的核酸。以大腸桿菌檢測(cè)為例，在傳統(tǒng)檢測(cè)模式下，需將待檢牲畜樣品、細(xì)菌置于含乳糖的革蘭陰性菌環(huán)境下，持續(xù)培養(yǎng)一段時(shí)間后，再進(jìn)行分離，最后進(jìn)行檢測(cè)。整個(gè)大腸桿菌檢測(cè)耗時(shí)3～5d，甚至更長(zhǎng)，且檢測(cè)方法相對(duì)繁瑣，一旦其中一個(gè)環(huán)節(jié)出現(xiàn)問題，可能導(dǎo)致最終檢測(cè)結(jié)果受到影響。而在獸醫(yī)大腸桿菌檢測(cè)中引入PCR技術(shù)后，整個(gè)檢測(cè)流程被簡(jiǎn)化為：根據(jù)大腸桿菌類，設(shè)計(jì)適宜的PCR反應(yīng)序列，利用PCR、擴(kuò)增樣本中的uidA基因、lacZ基因，此時(shí)，即可檢出樣本中的大腸桿菌以及大腸桿菌類[5]。

雞養(yǎng)殖是我國養(yǎng)殖行業(yè)的主要構(gòu)成。隨著養(yǎng)殖業(yè)的不斷發(fā)展，雞病問題逐漸受到人們的重視。為了保障養(yǎng)殖行業(yè)的良性發(fā)展，可引入PT-PCR技術(shù)，具體檢測(cè)流程如下：為雞胚接種病毒，制取適量雞胚尿囊液標(biāo)本，從其中提純RNA，按照規(guī)范流程完成CDNA的制備，建立PCR反應(yīng)序列并進(jìn)行反應(yīng)，再次進(jìn)行雞胚接種后，可獲取充足的雙股RNA片段，且該RNA片段特征具有可克隆特征，為病雞死亡率的控制提供良好的技術(shù)支持。

目前，PCR技術(shù)已經(jīng)在各個(gè)生物領(lǐng)域得到初步的應(yīng)用，從而衍生出比較新穎的技術(shù)形式。通過PCR與其他技術(shù)的聯(lián)用還可以解決生產(chǎn)技術(shù)的難題。但在實(shí)際操作與運(yùn)用過程中還存在一些問題。例如：水產(chǎn)動(dòng)物養(yǎng)殖生產(chǎn)者缺乏實(shí)驗(yàn)設(shè)備或?qū)嶒?yàn)設(shè)備不夠先進(jìn)、DNA萃取過程不當(dāng)、實(shí)驗(yàn)試劑上的問題等，這些情況容易使檢測(cè)的結(jié)果不夠理想，失去生物檢測(cè)原有的意義[6]?？焖?、簡(jiǎn)便、靈敏的PCR檢測(cè)方法為水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物的疾病診斷帶來希望。隨著PCR技術(shù)的不斷完善以及與其他新技術(shù)的聯(lián)合應(yīng)用，將會(huì)極大地推動(dòng)畜牧及水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的有效發(fā)展[7]。

3 結(jié)束語

綜上所述，在目前的生物檢測(cè)技術(shù)手段當(dāng)中，PCR技術(shù)以其獨(dú)特的精準(zhǔn)度優(yōu)勢(shì)在獸醫(yī)微生物檢測(cè)領(lǐng)域得到了充分的運(yùn)用。而技術(shù)手段方面，檢測(cè)人員中需要將多試劑進(jìn)行試管液相雜交，就可以完成較高靈敏度的快速診斷，最終提升檢測(cè)診斷效率。

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