RAPD分子標(biāo)記技術(shù)在大豆育種中的應(yīng)用

林文磊 呂美琴 李明松 康蓉蓉 曾紅英 姚文 蔡錦玲 葉玉珍

摘 要： 為了更好地引導(dǎo)分子標(biāo)記技術(shù)應(yīng)用到大豆輔助育種當(dāng)中，綜述了RAPD分子標(biāo)記技術(shù)在大豆遺傳多樣性分析、抗病基因研究、農(nóng)藝性狀研究中的應(yīng)用，旨在為把該技術(shù)應(yīng)用于輔助培育高產(chǎn)、高蛋白質(zhì)含量的大豆新品種提供理論依據(jù)及指導(dǎo)。

關(guān)鍵詞： RAPD分子標(biāo)記;大豆育種;高蛋白

DOI：? 10.13651/j.cnki.fjnykj.2018.09.015

Application of RAPD Molecular Markers on Soybean Breeding

LIN Wen-lei1， LV Mei-qin1， LI Ming-song1， KANG Rong-rong1，ZENG Hong-ying1， YAO Wen1， CAI Jin-ling1， YE Yu-zhen2

（1. Quanzhou Institute of Agricultural Sciences， Quanzhou， Fujian 362212;2. Chengjiao Town Agricultural Technique Extension Station of Mingxi County， Sanming， Fujian 365200）

Abstract：? In order to apply the technique of RAPD molecular markers in assisted breeding of soybean， the paper reviewed the application of RAPD molecular markers technique in genetic diversity analysis， diseases-resistant genes investigation and agronomic characters of soybean so as to provide theoretical basis and guidance for application of RAPD molecular markers in assisted breeding of high yield， high protein content soybean varieties.

Key words：? RAPD molecular markers; soybean breeding; high protein content

大豆Glycine max（L.） Merrill起源于我國(guó)，是重要的糧食和經(jīng)濟(jì)作物，也是重要的飼料和輕工業(yè)原材料。隨著生活水平的不斷提高，人們?cè)絹?lái)越注重飲食健康，大豆成為獲取植物蛋白及食用油的重要來(lái)源之一[1] 。然而，目前我國(guó)的大豆存在產(chǎn)量較低、品質(zhì)較差等缺點(diǎn)，無(wú)法滿足國(guó)內(nèi)逐年增長(zhǎng)的大豆需求，導(dǎo)致大豆進(jìn)口量逐年增加，而進(jìn)口大豆主要為轉(zhuǎn)基因大豆。因此，非常有必要大力發(fā)展國(guó)產(chǎn)的優(yōu)質(zhì)非轉(zhuǎn)基因大豆，主要是在提高大豆產(chǎn)量、改善品質(zhì)、增強(qiáng)抗性、縮短育種年限等方面下功夫[2] 。

育種的本質(zhì)就是將盡量多的優(yōu)良性狀集中于同一個(gè)品種上。傳統(tǒng)的育種依賴(lài)于植株表型的選擇，易受環(huán)境條件影響，具有周期長(zhǎng)、預(yù)見(jiàn)性低等缺點(diǎn)。近年來(lái)，植物生物技術(shù)迅速發(fā)展，分子生物技術(shù)彌補(bǔ)了傳統(tǒng)育種方法的不足，PAPD分子標(biāo)記技術(shù)具有簡(jiǎn)單、便捷等優(yōu)點(diǎn)被廣泛應(yīng)用于大豆輔助育種工作之中，提高了育種效率[3] 。

1 RAPD技術(shù)簡(jiǎn)介

分子標(biāo)記輔助選擇（Molecular-marker Assisted Selection，MAS）是利用分子標(biāo)記與目標(biāo)性狀基因緊密連鎖或共分離的特性，通過(guò)檢測(cè)分子標(biāo)記，間接檢測(cè)目標(biāo)基因的存在，從而達(dá)到選擇有目標(biāo)性狀的個(gè)體，它不受個(gè)體生育期階段、環(huán)境條件、器官組織差異等的影響，也不受基因表達(dá)與否的限制，選擇目標(biāo)個(gè)體更加準(zhǔn)確、可靠[4-6] 。

RAPD（Random Amplified Polymorphic DNA，隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA）是一種在PCR（Polymerase Chain Reaction，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)）技術(shù)的基礎(chǔ)之上，以不同個(gè)體基因組DNA作為模板，以一系列隨機(jī)排列的十堿基寡脫氧核苷酸單鏈為引物，在特定的條件下進(jìn)行擴(kuò)增，經(jīng)凝膠電泳獲得多態(tài)性譜帶，進(jìn)而分析不同個(gè)體間的差異的分子技術(shù)[7] 。該技術(shù)可對(duì)完全未知任何分子生物學(xué)資料的物種基因組DNA進(jìn)行分析，一套引物可用于不同生物的研究，具有簡(jiǎn)便、快速、成本低、靈敏度高、所需DNA模板量少等優(yōu)點(diǎn)，對(duì)于研究親本材料的遺傳背景、選配雜交親本具有較高的可靠性[8] 。

2 RAPD技術(shù)在大豆研究中的應(yīng)用

2.1 遺傳多樣性分析

生物遺傳多樣性是生物多樣性的重要組成部分，是生物遺傳信息的總和。對(duì)遺傳多樣性的研究可以了解物種的起源、種源的適應(yīng)性、基因資源分布等問(wèn)題[9] 。豐富的大豆種質(zhì)資源是選育優(yōu)良大豆品種的物質(zhì)基礎(chǔ)，研究大豆種質(zhì)資源的遺傳多樣性，可為大豆選育工作提供理論依據(jù)。

張志永等[10] 對(duì)28份栽培大豆種質(zhì)資源進(jìn)行RAPD分析，結(jié)果表明聚類(lèi)分析結(jié)果與種質(zhì)資源間的親緣關(guān)系、地理分布相吻合。陳艷秋等[11] 對(duì)146份大豆材料進(jìn)行RAPD分析，結(jié)果表明供試大豆材料相互間的遺傳距離介于0.703～0.959，可聚成3類(lèi)。周延清等[12] 對(duì)10份河南栽培大豆品種進(jìn)行RAPD分析，結(jié)果表明這些品種間的遺傳相似系數(shù)介于0.528～0.776，可聚成3類(lèi)。王振東等[13] 對(duì)45份不同抗旱程度的大豆種質(zhì)資源進(jìn)行RAPD分析，研究表明45份大豆種質(zhì)間的遺傳相似系數(shù)介于0.381 8～ 0.903 8 ，在遺傳距離為0.38處，可聚為3大類(lèi)，聚類(lèi)結(jié)果表明品種間關(guān)系與表型形態(tài)、地理起源等具有一定的相關(guān)性。

2.2 抗病基因研究

大豆病害往往會(huì)嚴(yán)重影響大豆產(chǎn)量和品質(zhì)，有些病害甚至?xí)斐纱蠖菇^產(chǎn)，而培育和種植抗病大豆品種是預(yù)防大豆病害最安全、經(jīng)濟(jì)、有效的途徑[14-15] 。隨著分子標(biāo)記技術(shù)的快速發(fā)展，已經(jīng)鑒定出很多與大豆抗某種病害的基因緊密連鎖的標(biāo)記。

大豆花葉病毒病（Soybean mosaic virus，SMV）是大豆的一種世界性病害，會(huì)導(dǎo)致減產(chǎn)及種子質(zhì)量退化。目前，關(guān)于大豆抗SMV是由幾對(duì)基因控制的，是顯性基因還是隱性基因，亦或是顯性基因和隱性基因共同控制的，這些問(wèn)題尚無(wú)定論[14，16-19] 。國(guó)外學(xué)者已命名了4個(gè)抗SMV基因位點(diǎn)：Rsv1[20] 、Rsv2[21] 、Rsv3[22] 和Rsv4[18] 。通過(guò)分子標(biāo)記技術(shù)已經(jīng)發(fā)現(xiàn)很多與抗SMV基因連鎖的標(biāo)記，包括與Rsv1緊密連鎖的RFLP、SSR、AFLP標(biāo)記[23] ，與Rsv3緊密連鎖的RFLP標(biāo)記[24] ，與Rsv4緊密連鎖的RFLP、SSR標(biāo)記。張志永等[25] 研究表明，對(duì)大豆SMV強(qiáng)毒株系Sa的抗性由單顯性基因Rsa控制，并獲得2個(gè)重復(fù)性較好的RAPD標(biāo)記OPW05 660bp? 和OPAS06 1800bp? ，它們與該基因的連鎖距離分別為22.2 cM和10.1 cM。東方陽(yáng)[26] 的研究結(jié)果表明，特異RAPD標(biāo)記與抗SMV毒株系Sa、Sc有關(guān)的抗性基因的連鎖距離分別為16.1 cM和9.7 cM。吳俊江等[27] 的研究獲得8個(gè)可能與抗SMV1號(hào)株系的抗性基因連鎖的RAPD標(biāo)記。鄭翠明等[19] 的研究獲得與抗SMV3號(hào)株系的基因緊密連鎖的共顯性RAPD標(biāo)記OPN11 980bp/1070bp? ，遺傳距離為2.1 cM。劉麗君等[28] 對(duì)黑農(nóng)39（高抗）×合豐25（高感）的F 2群體進(jìn)行RAPD分析，獲得與抗病基因連鎖的共顯性標(biāo)記OPN 1400bp/1300bp? ，連鎖距離為8.2 cM。

大豆孢囊線蟲(chóng)?。℉eterodera glycines Ichinohe，SCN）又稱(chēng)大豆根線蟲(chóng)病、黃萎癥，目前，在我國(guó)主要有1、2、3、4、5、6、7、9和14號(hào)生理小種[29-30] 。章彥等[31] 的研究獲得5個(gè)與SCN抗性密切相關(guān)的特異RAPD片段，分別為BRC173 1600bp? 、BRC182 900bp?? 、BRC185 800bp? 、BRC 185 850bp? 、BRC190 1300bp? 。 王慧等[32] 的研究獲得1個(gè)與SCN抗性有關(guān)的RAPD標(biāo)記S11 700bp? 。王永軍等[33] 以經(jīng)過(guò)抗性遺傳分析的BC 1F 2分離群體為材料，發(fā)現(xiàn)1個(gè)與SCN1號(hào)生理小種抗性基因連鎖的RAPD標(biāo)記OPA19 1200bp? 。Skorup ska[34] 和Mahalingam[35] 的研究分別獲得17個(gè)和4個(gè)與抗SCN3號(hào)生理小種的基因緊密連鎖的RAPD標(biāo)記。顏清上等[36] 以6份高抗SCN和2個(gè)高感SCN的大豆種質(zhì)資源為材料，進(jìn)行RAPD分析，引物OPG04擴(kuò)增出1條只有抗病資源特有的特異DNA條帶，推測(cè)這段DNA可能與抗SCN4號(hào)生理小種的抗性有關(guān)。Choi等[37] 的研究獲得抗SCN3、5、14號(hào)生理小種的RAPD標(biāo)記。

大豆灰斑?。‵rog-eye leaf spot，F(xiàn)LS）是一種由大豆灰斑病菌Cercospora sojina引起的世界性病害，在我國(guó)黑龍江省發(fā)生最為嚴(yán)重。現(xiàn)已確定3個(gè)顯性抗病基因Rcs1、Rcs2、Rcs3。目前，我國(guó)已鑒定的大豆灰斑病菌生理小種有11個(gè)[38] 。鄒繼軍等[39-40] 通過(guò)研究東農(nóng)91212（感C.sojina 7號(hào)生理小種）×東農(nóng)9674（抗所有生理小種）的抗性遺傳分析，表明對(duì)7號(hào)小種的抗性由單顯性基因控制，并命名為Rcsc7，研究獲得3個(gè)RAPD標(biāo)記OPQ12 500bp? 、OPS03 620bp? 、OPA04 1100bp? ，與該抗病基因的連鎖順序?yàn)镺PQ12 500bp? Rcsc7 OPS03 620bp?? OPA04 1100bp ，遺傳距離分別為17.3、8.7、33.2 cM。武小霞[41] 的研究獲得1個(gè)顯性RAPD標(biāo)記OPC08 831bp? ，該標(biāo)記與Rcsc7基因的遺傳距離為25.59cM。董偉等[42] 對(duì)東農(nóng)87 104（高感品種）× 東農(nóng)9674（高抗品種）的F 2群體進(jìn)行RAPD分析，研究結(jié)果獲得與C.sojina 1號(hào)生理小種緊密連鎖的3個(gè)特異標(biāo)記：OPK03 840bp? 、OPM17 1700bp? 、OPO10 950bp? ，與抗病基因Rf1的連鎖順序?yàn)镺PK03 840bp??? Rf1 OPM17 1700bp?? OPO10 950bp? ，遺傳距離分別為：10.4、13.8、26.1 cM。

大豆疫霉根腐病（Phytophthora Root Rot，PPR）是由大豆疫霉菌（Phytophthora sojae）引起的一種土壤性病害，在大豆整個(gè)生育期中都能侵染并造成大幅度減產(chǎn)?，F(xiàn)已報(bào)道的16個(gè)抗大豆PPR的基因，分布于9個(gè)不同的位點(diǎn)上，9個(gè)不同的連鎖群上[43-47] 。Bhattacharyya等[48] 對(duì)近等基因系（Willoams和William82）進(jìn)行RAPD分析，結(jié)果表明，特異引物OPRK15與大豆PPR抗性基因Rps1 k緊密連鎖。曲娟娟等[49-51] 以大豆PPR（Phytophthora megasperma）2對(duì)近等基因系（Williams與Williams79、Williams與Williams82）為材料，對(duì)其基因組DNA進(jìn)行RAPD分析，研究結(jié)果推測(cè)，顯性RAPD標(biāo)記OPQ04 700bp? 、OPH05 1600bp/640bp? 分別與大豆PPR抗性基因Rps1 c 、Rps1 k 連鎖。Byrum等[52] 的研究結(jié)果表明，特異RAPD標(biāo)記OPB11 861bp? 與抗性基因Rps4緊密連鎖。

2.3 農(nóng)藝性狀研究

一個(gè)優(yōu)良的大豆品種除了應(yīng)該具備抗病性，還應(yīng)該同時(shí)有一些好的農(nóng)藝性狀，例如產(chǎn)量高、油脂含量高、分支數(shù)多、單株莢數(shù)多、抗干旱、耐鹽等。

劉昭君等[53] 對(duì)黑農(nóng)小粒豆（低油）與墾農(nóng)18（高油）的雜交F 2、F 3群體進(jìn)行RAPD分析，找到4個(gè)與高油含量相關(guān)的特異DNA標(biāo)記S56 900bp? 、S61 600bp? 、S107 600bp/450bp/370bp 、S134 450bp/500bp ，這些標(biāo)記的重復(fù)性好，可用作鑒定大豆高油含量的分子標(biāo)記。王慧等[54] 對(duì)12份黃色種皮和11份黑色種皮的大豆種質(zhì)資源進(jìn)行RAPD分析，發(fā)現(xiàn)了一個(gè)與大豆黃色種皮相關(guān)的特異DNA片段S79 500bp? ，而且該標(biāo)記具有較高的重復(fù)性和穩(wěn)定性，可用于輔助選擇優(yōu)良的黃色種皮大豆新品種。黃方等[55-56] 的研究表明RAPD標(biāo)記S1 1900bp? 與控制大豆短葉柄的基因的遺傳距離為14.36 cM，標(biāo)記S506 1500bp? 與控制大豆曲徑的基因的遺傳距離為6.94cM。朱保葛等[57] 對(duì)經(jīng)過(guò)烷化劑EMS誘變處理得到的4粒莢和窄葉穩(wěn)定突變系E182進(jìn)行RAPD分析，研究結(jié)果表明，特異標(biāo)記OPY5 1300bp? 與窄葉突變基因的遺傳距離為8 cM。黃福龍[58] 以62對(duì)大豆細(xì)胞質(zhì)雄性不育系及相應(yīng)保持系為材料，用11個(gè)隨機(jī)引物對(duì)其mtDNA進(jìn)行RAPD分析，通過(guò)對(duì)特異片段的分析推斷，大豆細(xì)胞質(zhì)雄性不育可能與Cox I基因及其上游調(diào)控序列的插入和缺失有關(guān)。

3 存在的問(wèn)題及展望

我國(guó)大豆種質(zhì)資源極其豐富，栽培地區(qū)遍布全國(guó)各地。大豆栽培種的形態(tài)與經(jīng)濟(jì)性狀受地理位置、地域氣候、土壤、光照等自然條件的影響，僅僅根據(jù)大豆的經(jīng)濟(jì)性狀與形態(tài)進(jìn)行分類(lèi)，有可能造成將不同基因型誤歸為同一品種，或?qū)⑼换蛐驼`歸為不同品種的結(jié)果。與傳統(tǒng)育種方法相比，RAPD分子標(biāo)記技術(shù)具有簡(jiǎn)單、便捷等優(yōu)點(diǎn)，在保證DNA純度，并嚴(yán)格控制PCR反應(yīng)條件的前提下，其重復(fù)性高，可獲得清晰穩(wěn)定的電泳條帶，可用于大豆分子研究分析，這為輔助挑選優(yōu)質(zhì)的大豆親本提供理論依據(jù)，可大大縮短育種年限并提高選擇準(zhǔn)確率。

目前，我國(guó)在生產(chǎn)上缺乏高蛋白含量的大豆品種，迫切需要利用分子輔助育種技術(shù)改良現(xiàn)有的大豆品種，以期選育出高產(chǎn)、高蛋白的優(yōu)良大豆新品種。關(guān)于大豆蛋白質(zhì)方面的研究主要集中在蛋白質(zhì)品質(zhì)、結(jié)構(gòu)、含量等[59-60] 方面，而應(yīng)用于大豆蛋白研究中的分子標(biāo)記技術(shù)，主要有利用SSR[60-65] 、RFLP[66-67] 、SNP[68-69] 技術(shù)進(jìn)行分析，RAPD在蛋白質(zhì)含量方面的研究仍未見(jiàn)報(bào)道。

RAPD分子標(biāo)記技術(shù)是一種顯性標(biāo)記，無(wú)法確定所研究的個(gè)體是純合體還是雜合體，同時(shí)，由于引物序列短，退火溫度較低，該標(biāo)記容易受PCR擴(kuò)增時(shí)的溫度影響，可將其轉(zhuǎn)化為SCAR（Sequence Characterized amplified regions，特定序列擴(kuò)增）標(biāo)記，克服RAPD標(biāo)記的缺陷，提高目標(biāo)性狀基因檢測(cè)的準(zhǔn)確性，從而達(dá)到高效地輔助選擇育種的目的。

后續(xù)將挑選高蛋白含量與低蛋白含量的大豆種質(zhì)資源，利用RAPD技術(shù)進(jìn)行分析，期望能找到與大豆蛋白質(zhì)含量相關(guān)的特異RAPD標(biāo)記，以輔助選擇高蛋白含量的大豆種質(zhì)，縮短育種年限。

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