• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    三葉木通微衛(wèi)星分子標(biāo)記開(kāi)發(fā)及評(píng)價(jià)

    2018-09-10 07:22:44李同建董婧廖亮金洪光韓興杰文鋒徐玲玲
    廣西植物 2018年9期

    李同建 董婧 廖亮 金洪光 韓興杰 文鋒 徐玲玲

    摘 要: 為了獲得適于三葉木通遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)研究的微衛(wèi)星分子標(biāo)記,該研究采用磁珠富集法構(gòu)建了三葉木通微衛(wèi)星富集文庫(kù)。結(jié)果表明:在150個(gè)陽(yáng)性克隆中發(fā)現(xiàn)了70個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn),富集效率為46.67%,其中含雙堿基重復(fù)單元的序列占比為79.37%,三堿基和四堿基重復(fù)含有量較少。共設(shè)計(jì)引物63對(duì),其中篩選出16對(duì)高多態(tài)引物,對(duì)1個(gè)三葉木通自然居群48個(gè)個(gè)體進(jìn)行了遺傳分析,結(jié)果顯示位點(diǎn)的等位基因數(shù)為10~22個(gè),觀察雜合度和期望雜合度分別為0.370~0.792和0.724~0.936,多態(tài)性信息指數(shù)為0.725~0.919,表明以上引物均為高多態(tài)性引物。其中,12個(gè)位點(diǎn)偏離哈迪-溫伯格平衡,呈現(xiàn)出純合子過(guò)剩狀態(tài),這可能與啞等位基因和其它因素有關(guān)。綜上結(jié)果表明,該研究所開(kāi)發(fā)的16對(duì)引物能夠用于三葉木通遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)評(píng)價(jià)工作。

    關(guān)鍵詞: 三葉木通, 微衛(wèi)星分子標(biāo)記, 磁珠富集法

    中圖分類(lèi)號(hào): Q943.2, Q75 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼: A 文章編號(hào): 1000-3142(2018)09-1117-08

    Abstract: Akebia trifoliata is perennial, woody vine producing large edible fruits. The high medicinal and nutritional values of A. trifoliata make it worthy of being exploited as a new crop. Wild resources of these species have been se-riously deteriorated due to years of disorder planting and over-harvesting, thus wild germplasm resources protection and evaluation are particularly important. In order to obtain suitable molecular markers for genetic structure and genetic diversity of the existing resources, enriched SSR library was established using the magnetic bead enrichment procedure. Seventy SSR loci were obtained in 150 positive clones, and enrichment efficiency was 46.67%. Thereinto, sequences with two-base repeat unit accounted for 79.37%, far more than sequences with three-base and four-base. Sixteen pairs of high polymorphic primers were chosen in sixty-three pairs primers and characterized by 48 individuals collected in Lushan. The allele numbers per locus ranged from 10 to 22, and the observed and expected heterozygosity ranged from 0.370 to 0.792 and from 0.724 to 0.936, respectively, polymorphisms information content ranged from 0.725 to 0.919, which showed that the above primers were high polymorphic primers. Twelve pairs of primers deviated from Hardy-Weinberg equilibrium, showing excess of homozygotes, which might be related to null genes and other reasons. These molecular markers will contribute to evaluation on genetic diversity and population structure, lay a foundation for conservation and evaluation of A. trifoliata genetic resource.

    Key words: Akebia trifoliata, microsatellite marker, magnetic bead enrichment

    三葉木通(Akebia trifoliata)是木通科(Lardizabalaceae)木通屬(Akebia Decne.)的一種半落葉木質(zhì)藤本纏繞植物,分布于秦嶺以南至南嶺,西至云南,東至浙閩16個(gè)省廣大亞熱帶地區(qū)(萬(wàn)明長(zhǎng)等, 2008)。其種下劃分為三葉木通(A. trifoliata subsp. trifoliata)、白木通(A. trifoliata subsp. australis)、長(zhǎng)萼三葉木通(A. trifoliata subsp. longisepala) 3亞種(中國(guó)植物志編輯委員會(huì), 2001)。木通屬植物具有利尿、鎮(zhèn)痛、祛風(fēng)濕的功效,作為中藥有兩千多年的歷史(馮航, 2010; 李麗等, 2010; 李麗, 2010)。近期研究表明,其還具有抗衰老、提高免疫功能、抑制腫瘤等功效(An et al, 2016)。木通屬植物果實(shí)較大,果肉甜糯,具有極高開(kāi)發(fā)價(jià)值,在湖南、江西、貴州等地已有農(nóng)戶(hù)開(kāi)始種植(羅克明等, 2008)。其種子含油量達(dá)40%,具有較高的食用價(jià)值(仲偉敏和馬玉華, 2016)。與其高開(kāi)發(fā)價(jià)值不匹配的是三葉木通種質(zhì)資源研究較晚,大規(guī)模無(wú)序的種植、開(kāi)發(fā)對(duì)野生種質(zhì)資源造成巨大威脅。因此,有必要深入研究三葉木通種質(zhì)資源,利用現(xiàn)代育種技術(shù)培育栽培品種,為三葉木通資源的可持續(xù)利用和種植產(chǎn)業(yè)起步打下基礎(chǔ)。九江學(xué)院在中國(guó)、日本和韓國(guó)已搜集70余個(gè)不同產(chǎn)地的野生三葉木通資源,建設(shè)了三葉木通種質(zhì)資源圃。但是,由于三葉木通分子生物學(xué)研究起步較晚,GenBank中僅能檢索到440余條DNA序列,可用的分子標(biāo)記較少,嚴(yán)重阻礙了資源的評(píng)價(jià)工作,因此急需開(kāi)發(fā)合適的分子標(biāo)記對(duì)現(xiàn)有資源進(jìn)行遺傳結(jié)構(gòu)和遺傳多樣性評(píng)價(jià)(Li et al, 2009; Sun et al, 2016; 黃佩蓓等, 2016)。

    微衛(wèi)星分子標(biāo)記具有多態(tài)性高、共顯性、重復(fù)性好、條帶少易識(shí)別等諸多優(yōu)點(diǎn),是目前遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)研究中的首選標(biāo)記之一(Grover & Sharma, 2016),隨著熒光毛細(xì)管電泳技術(shù)在微衛(wèi)星檢測(cè)中的應(yīng)用,微衛(wèi)星標(biāo)記變得更加高效和廉價(jià)(Wenz et al, 1998)。本研究擬采用 三葉木通微衛(wèi)星分子標(biāo)記,并利用7個(gè)不同產(chǎn)地的三葉木通個(gè)體和1個(gè)三葉木通自然居群檢測(cè)引物的穩(wěn)定性和多態(tài)性,以期獲得適于三葉木通遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)研究的微衛(wèi)星分子標(biāo)記。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1 材料采集 在人工種植基地采集栽培三葉木通個(gè)體7個(gè),用于檢測(cè)微衛(wèi)星引物擴(kuò)增穩(wěn)定性和多態(tài)性。在九江廬山采集三葉木通自然居群1個(gè)(n=48),用于微衛(wèi)星文庫(kù)建立和后期引物評(píng)價(jià)(表1)。采集每個(gè)個(gè)體新鮮、健康的幼嫩葉片放入裝有變色硅膠的自封袋中迅速干燥,置于-20 ℃低溫冰箱中保存?zhèn)溆?。憑證標(biāo)本保存于九江學(xué)院藥學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院分子生物學(xué)研究室。

    1.1.2 試劑 10×PCR buffer、25 mmol·L-1 MgCl2、dNTPs、DNA Taq聚合酶(5 U·μL-1)均購(gòu)自上海生工生物(Sangon Biology)工程有限公司;限制性?xún)?nèi)切酶Rsa I(10 U·μL-1)、BstU I(10 U·μL-1)、Xmn I(20 U·μL-1)購(gòu)自New England Biolabs公司;T4 DNA Ligase(400 U·μL-1)購(gòu)自Promega公司; DNA Marker購(gòu)自大連Takara公司; 接頭引物SuperSNX24-F (5′-GTTTAAGGCCTAGCTAGCAGCAGAATC)和Super-SNX24-R (5′-GATTCTGCTAGCTAGGCCTTAAACAAAA)由上海英俊生物技術(shù)有限公司合成。

    1.2 方法

    1.2.1 基因組DNA的提取 已干燥的三葉木通樣本采用改良的CTAB法提取總DNA(Doyle & Doyle, 1987),并利用PEG8000純化,詳細(xì)步驟為將40% PEG8000與5 mol·L-1 NaCl按1∶1比例配置成工作液,與等比例的DNA溶液混合,搖勻并置于37 ℃下靜置15 min,12 000 r·min-1離心16 min,沉淀再由80%乙醇清洗2次,烘干。TE溶解后用Nanodrop檢測(cè)合格后,置于-20 ℃冰箱備用。

    1.2.2 酶切與接頭連接 使用限制性?xún)?nèi)切酶Rsa I或BstU I和Xmn I組合對(duì)三葉木通基因組DNA進(jìn)行酶切,于37 ℃溫浴過(guò)夜。酶切體系為25 μL:2.5 μL 10×T4 ligase buffer(NEB4),0.25 μL 100×BSA,0.25 μL 5 mol·L-1 NaCl,1.0 μL 10 U·μL-1 Rsa I/BstU I,1.0 μL 20 U·μL-1 Xmn I,20 μL 200 ng·μL-1 DNA。取1 μL酶切產(chǎn)物先用1%瓊脂糖膠電泳檢測(cè)酶切片段是否位于200~800 bp范圍內(nèi);然后將SuperSNX24-F和SuperSNX24-R合成接頭置于水浴鍋中95 ℃反應(yīng)5 min,緩慢冷卻至室溫;最后將制備好的接頭與酶切產(chǎn)物連接。反應(yīng)體系如下:7 μL接頭,2.5 μL NEB 10×T4 ligase buffer,2.0 μL 350 U·μL-1 T4 ligase,13 μL酶切產(chǎn)物,加雙蒸水至25 μL,16 ℃連接過(guò)夜。將連接產(chǎn)物作為模板,利用SuperSNX24-F接頭作為引物通過(guò)PCR擴(kuò)增檢測(cè)連接結(jié)果。反應(yīng)體系如下:2.5 μL 10×PCR buffer,0.13 μL 100 μmol·L-1 SuperSNX24-F,1.5 μL 2 mmol·L-1 dNTP,2.0 μL 25 mmol·L-1 MgCl2,2.5 μL BSA,0.2 μL 連接產(chǎn)物DNA,加雙蒸水至25 μL。PCR反應(yīng)程序:95 ℃預(yù)變性2 min;95 ℃變性20 s,60 ℃退火20 s,72 ℃延伸1.5 min,循環(huán)24次;72 ℃延伸10 min。

    1.2.3 雜交與磁珠富集 微衛(wèi)星富集采用Glenn & Schable(2005)的方法,將連接產(chǎn)物與帶生物素的探針混合物(AG)12、(CG)12、(AT)12、(GT)12、(ACT)12、(AAGT)8、(AACT)8、(AGAT)8進(jìn)行雜交。雜交反應(yīng)體系:25 μL 2×Hyb Solution,10 μL 10 μmol·L-1生物素標(biāo)記的探針,10 μL連接產(chǎn)物,加雙蒸水至50 μL。雜交反應(yīng)程序:95 ℃預(yù)變性5 min;70 ℃開(kāi)始,每個(gè)循環(huán)降低0.2 ℃,維持5 s,循環(huán)99次;50 ℃保持5 min;每個(gè)循環(huán)降低0.5 ℃,保持5 s,循環(huán)20次;15 ℃保持。用鏈霉素親和磁珠(Promega Magne Sphere)捕獲結(jié)合了生物素探針的DNA片段,用洗脫液洗脫未結(jié)合的探針。具體操作如下:250 μL TE 洗滌50 μL混勻的磁珠2次,50 μL 1×Hyb Solution平衡磁珠2次;將DNA和生物素探針混合物的雜交體系加入到磁珠中,于16 ℃下150 r·min-1振蕩約1 h雜交;加入400 μL Wash Solution I洗脫2次,且第一次加入400 μL Wash Solution Ⅱ于45~48 ℃下水浴振蕩2 min洗脫2次,再次加入400 μL Wash Solution Ⅱ混勻,于50~53 ℃下水浴振蕩2 min洗脫2次。加入200 μL TE于95 ℃下水浴5 min徹底洗脫富集DNA,向上清液中加入22 μL 3 mol·L-1醋酸鈉和445 μL預(yù)冷的無(wú)水乙醇,沉淀DNA。用80%乙醇洗滌,離心烘干后加入20 μL TE溶解。用接頭SuperSNX24-F作為引物對(duì)富集產(chǎn)物進(jìn)行PCR擴(kuò)增回收,PCR反應(yīng)體系和程序與檢測(cè)時(shí)相同。為增加富集的陽(yáng)性率,重復(fù)以上步驟1次,進(jìn)行2次富集,用PEG8000法純化DNA。

    1.2.4 克隆與陽(yáng)性篩選 將純化后的富集產(chǎn)物克隆到pEGM-T載體中,連接反應(yīng)在PCR儀上16 ℃過(guò)夜,將重組子轉(zhuǎn)入大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中培養(yǎng)24 h。每板挑取50~100個(gè)白色單菌落,在另一含Amp的LB固體培養(yǎng)基平板上劃線,并接種于菌落PCR反應(yīng)液中,通過(guò)菌落PCR(M13F和M13R為引物)篩選出陽(yáng)性克隆,把劃線的平板置于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過(guò)夜。取3 μL擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)其是否為含有目的片段的陽(yáng)性菌落。選擇PCR檢測(cè)為陽(yáng)性的菌落接種至500 μL含Amp的LB液體培養(yǎng)基中,于37 ℃下200 r·min-1振蕩培養(yǎng)過(guò)夜,將培養(yǎng)菌液送往上海生工生物工程技術(shù)有限公司測(cè)序。

    1.2.5 序列分析與引物設(shè)計(jì) 首先,將測(cè)序結(jié)果導(dǎo)入Geneious 4.8軟件中進(jìn)行檢測(cè),使用Trim-ends和Search for the motifs工具去除載體和接頭序列,對(duì)有疊峰的序列進(jìn)行反向測(cè)序。然后,將經(jīng)過(guò)處理的序列通過(guò)Tandem Repeats Finder version 4確定SSR位點(diǎn),并分析位點(diǎn)的堿基重復(fù)序列和重復(fù)次數(shù)、查看序列長(zhǎng)度及微衛(wèi)星位點(diǎn)兩端側(cè)翼序列是否符合引物設(shè)計(jì)的要求(Benson, 1999)。使用Geneious 4.8內(nèi)嵌的引物設(shè)計(jì)功能進(jìn)行引物設(shè)計(jì)。所設(shè)計(jì)引物送于上海生工生物工程有限責(zé)任公司合成。

    1.2.6 引物穩(wěn)定性、多態(tài)性篩選及評(píng)價(jià) 為了篩選擴(kuò)增穩(wěn)定性好、多態(tài)性高的引物和其最佳PCR條件,我們用設(shè)計(jì)的引物對(duì)7個(gè)不同地區(qū)采集的三葉木通進(jìn)行PCR擴(kuò)增,PCR產(chǎn)物經(jīng)8%聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)。

    將篩選出的高多態(tài)性SSR引物合成5′端熒光標(biāo)記引物,其熒光基團(tuán)為FAM(藍(lán)色),HEX(綠色)。選取采集于九江廬山的48個(gè)樣本進(jìn)行PCR擴(kuò)增,送往北京閱微基因有限公司使用ABI3730遺傳分析儀進(jìn)行STR分型,內(nèi)標(biāo)均為ROX500。

    1.2.7 數(shù)據(jù)分析 首先,使用Genemapper 4.1軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì),通過(guò)Micro-Checker 2.2.3檢測(cè)啞等位基因(Van Oosterhout et al, 2004)。然后,用Genalex 6.5(Peakall & Smouse, 2010) 計(jì)算出每個(gè)位點(diǎn)的等位基因數(shù)(Na)、 有效等位基因數(shù) (effective number of alleles,Ne)、觀察雜合度(observed heterozygosity,Ho)、期望雜合度(expected heterozygosity,He)及哈迪-溫伯格平衡(Hardy-Weinberg equilibrium,HWE)。最后,使用PowerMaker (Liu & Muse, 2005)計(jì)算多態(tài)性信息指數(shù)(polymorphic information content,PIC)和連鎖遺傳不平衡(linkage disequilibrium, LD)。所有P值均經(jīng)Bonferroni法校正。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 微衛(wèi)星富集

    選擇2個(gè)限制性?xún)?nèi)切酶組合(Rsa I和Xmn I、BstU I和Xmn I)對(duì)三葉木通基因組進(jìn)行酶切,Rsa I和Xmn I的組合酶切后基因組小片段電泳條帶彌散,大小分布在100~1 500 bp之間,為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的連接和雜交富集打好基礎(chǔ)。BstU I和Xmn I的組合酶切片段較長(zhǎng),片段長(zhǎng)度集中在100~200 bp、300~500 bp及大于1 500 bp,這些酶切產(chǎn)物不利于后續(xù)磁珠富集操作。本研究用金屬浴加熱進(jìn)行漂洗,先在16 ℃下用Washing Solution I漂洗1次;再用Washing Solution Ⅱ分別在45 ℃和50 ℃下漂洗2次,結(jié)果富集率太低。然后調(diào)整漂洗溫度,用Washing Solution Ⅱ分別在46 ℃和51 ℃下漂洗2次,獲得所需目的片段,且大大提高了陽(yáng)性克隆率。

    共挑取230個(gè)陽(yáng)性克隆進(jìn)行PCR檢測(cè),大小在300~1 000 bp之間,其中約有40個(gè)未擴(kuò)增出目的片段,部分菌落空載。在190個(gè)陽(yáng)性克隆中挑選出片段長(zhǎng)度不同的150個(gè)單菌落送往公司測(cè)序,148個(gè)測(cè)序成功。其中,70個(gè)含有微衛(wèi)星序列,富集率為46.67%;可設(shè)計(jì)引物的序列有57條,占SSR序列的81.43%。57條可設(shè)計(jì)引物的序列共設(shè)計(jì)引物63對(duì),其中含雙堿基重復(fù)單元的序列占SSR序列的79.37%,高于三堿基重復(fù)單元的序列占SSR序列的20.63%。

    2.2 引物篩選與分析

    54對(duì)引物擴(kuò)增產(chǎn)物大小在100~300 bp之間。先用7個(gè)DNA樣本為模板初次篩選出條帶清晰、有多態(tài)性的引物33對(duì);再用48個(gè)DNA樣本為模板進(jìn)一步對(duì)33對(duì)引物進(jìn)行篩選,選出條帶清晰、非特異性條帶少、多態(tài)性較高及擴(kuò)增效率穩(wěn)定的引物16對(duì),可以用于SSR位點(diǎn)分析。

    48個(gè)樣品的三葉木通居群中共檢測(cè)到220個(gè)等位基因,每個(gè)位點(diǎn)的等位基因數(shù)為10~22個(gè),平均等位基因數(shù)為15.938個(gè),觀察雜合度為0.370~0.792,期望雜合度為0.724~0.936,多態(tài)性信息指數(shù)為0.725~0.919(均值為0.861),其中12個(gè)位點(diǎn)經(jīng)Bonferroni校正后仍然偏離哈迪-溫伯格平衡,呈現(xiàn)純合子過(guò)剩狀態(tài),檢測(cè)到14個(gè)位點(diǎn)存在大小不等的啞等位基因頻率。發(fā)現(xiàn)了3個(gè)引物對(duì)(MT33-MT45,MT15-MT56和MT35-MT62)存在連鎖不平衡(表2)。

    3 討論與結(jié)論

    隨著高通量測(cè)序技術(shù)的發(fā)展,使得SSR位點(diǎn)獲得更加低廉、高效,越來(lái)越多的研究利用簡(jiǎn)化基因組測(cè)序和轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)進(jìn)行高效的微衛(wèi)星開(kāi)發(fā)(萬(wàn)冬梅等,2016)。在群體遺傳和進(jìn)化研究中需要的微衛(wèi)星位點(diǎn)數(shù)量較少,磁珠富集法可在1周內(nèi)完成微衛(wèi)星富集文庫(kù)構(gòu)建工作,其高效、快捷的特點(diǎn)更適合少量微衛(wèi)星引物的開(kāi)發(fā)(王靜等, 2015)。在本研究中,因?qū)嶒?yàn)室熟練掌握了磁珠富集法,故選用該方法構(gòu)建三葉木通的微衛(wèi)星富集文庫(kù),在148個(gè)成功測(cè)序的陽(yáng)性克隆中獲得70個(gè)富含微衛(wèi)星的序列,富集效率較高,達(dá)到46.67%。雖然本研究使用了8種不同的探針,包括雙堿基重復(fù)、三堿基重復(fù)和四堿基重復(fù),但富集的微衛(wèi)星序列主要以雙堿基重復(fù)為主(79.37%),三堿基和四堿基重復(fù)含有量較少。開(kāi)發(fā)的16對(duì)引物中僅有2對(duì)引物為三堿基重復(fù)(MT27,MT33)。這與前人報(bào)道的植物中微衛(wèi)星序列主要以雙堿基重復(fù)為主一致(Morgante & Olivieri, 1993)。

    利用篩選到的16對(duì)引物對(duì)采自廬山的三葉木通居群進(jìn)行遺傳分析,共擴(kuò)增出220個(gè)多態(tài)性條帶,發(fā)現(xiàn)以上引物的平均等位基因數(shù)為15.938個(gè),觀察雜合度為0.370~0.792,期望雜合度為0.724~0.936,這與李麗(2010)的研究結(jié)果相近。多態(tài)性信息指數(shù)(PIC)是評(píng)估微衛(wèi)星引物多態(tài)性水平的重要參數(shù),普遍認(rèn)為PIC>0.5為高多態(tài)引物,0.25綜上所述,本研究開(kāi)發(fā)的16對(duì)SSR多態(tài)性引物可用于三葉木通遺傳分析,進(jìn)一步補(bǔ)充和完善了木通微衛(wèi)星分子標(biāo)記工具,為三葉木通種質(zhì)資源評(píng)價(jià)和開(kāi)發(fā)等后續(xù)研究打下了堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。

    參考文獻(xiàn):

    AN JP, HA TKQ, KIM JW, et al, 2016. Protein tyrosine phosphatase 1B inhibitors from the stems of Akebia quinata [J]. Molecules, 21(8):1091.

    GROVER A, SHARMA PC, 2016. Development and use of molecular markers: past and present [J]. Crit Rev Biotechnol, 36(2):290-302.

    BENSON G, 1999. Tandem repeats finder: A program to analyze DNA sequences [J]. Nucl Acids Res, 27(2):573.

    BOTSTEIN D, WHITE RL, SKOLNICK M, et al, 1980. Construction of a genetic linkage map in man using restriction fragment length polymorphisms [J]. Am J Hum Genet, 32(3):314.

    DOYLE JJ, DOYLE JL, 1987. A rapid procedure for DNA purification from small quantities of fresh leaf tissue [J]. Phytochem Bull, 19(1):11-15.

    FENG H, 2010. On current research of chemical compositions and pharmacological action of Akebia trifoliate [J]. J Xian Univ Arts Sci (Nat Sci Ed), 13(4):16-18. [馮航, 2010. 三葉木通化學(xué)成分和藥理作用研究進(jìn)展 [J]. 西安文理學(xué)院學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版), 13(4):16-18.]

    Flora of China Editorial Committee, 2001. Flora Reipublicae Popularis Sinicae [M]. Beijing: Science Press, 29: 4. [中國(guó)植物志編輯委員會(huì), 2001. 中國(guó)植物志 [M]. 北京: 科學(xué)出版社, 29: 4.]

    GLENN TC, SCHABLE NA, 2005. Isolating microsatellite DNA loci [J]. Method Enzymol, 395:202-222.

    HUANG PB, CHEN SH, WANG F, et al, 2016. SRAP analysis on Akebia Decne. germplasm resources [J]. Hubei Agric Sci, 55(7):1747-1750. [黃佩蓓, 陳世華, 王飛, 等, 2016. 木通屬植物種質(zhì)資源的SRAP分析 [J]. 湖北農(nóng)業(yè)科學(xué), 55(7):1747-1750.]

    LI L, YAO X, CHEN X, et al, 2009. Development and characterization of microsatellite loci in Chinese medicinal plant Akebia trifoliate ssp. australis and cross-species amplification in closely related taxa [J]. Conserv Genet, 10(4): 959-962.

    LI L, CHEN XZ, YAO XH, et al, 2010. Geographic distribution and resource status of three important Akebia species [J]. J Wuhan Bot Res, 28(4): 497-506. [李麗, 陳緒中, 姚小洪, 等, 2010. 三種木通屬植物的地理分布與資源調(diào)查 [J]. 武漢植物學(xué)研究, 28(4):497-506.]

    LI L, 2010. Population genetics of three medicinal Akebia species [D]. Beijing: Graduate University of Chinese Academy of Science:48-51. [李麗, 2010. 三種藥用木通屬植物的居群遺傳學(xué)研究 [D]. 北京: 中國(guó)科學(xué)院研究生院: 48-51.]

    LIU K, MUSE SV, 2005. Power marker: An integrated analysis environment for genetic marker analysis [J]. Bioinformatics, 21(9):2128-2129.

    LUO KM, LIU XW, YANG YY, et al, 2008. The growth and fruiting habit of Akebia trifoliata (Thunb.) Koidz under the cultivation condition [J]. Guizhou Agric Sci,36(3):123-124. [羅克明, 劉學(xué)武, 楊永英, 等, 2008. 三葉木通栽培條件下的生長(zhǎng)結(jié)果習(xí)性 [J]. 貴州農(nóng)業(yè)科學(xué), 36(3):123-124.]

    MORGANTE M, OLIVIERI AM, 1993. PCR-amplified microsatellites as markers in plant genetics [J]. Plant J, 3(1):175-182.

    PEAKALL R, SMOUSE PE, 2010. Genalex 6: genetic analysis in Excel. population genetic software for teaching and research [J]. Mol Ecol Notes, 6(1):288-295.

    SUN Z, YE LJ, ZHANG F, et al, 2016. Development of microsatellite markers for Sargentodoxa cuneata (Lardizabalaceae) using next-generation sequencing technology [J]. Appl Plant Sci, 4(5):1600003.

    VAN OOSTERHOUT C, HUTCHINSON WF, WILLS DP, et al, 2004. Micro-checker: Software for identifying and correcting genotyping errors in microsatellite data [J]. Mol Ecol Resour, 4(3):535-538.

    WAN DM, HAN M, LI CA, et al, 2016. Development of microsatellite in marsh tit Parus palustris using illumina miseq [J]. J Liaoning Univ (Nat Sci Ed), 43(3):252-257. [萬(wàn)冬梅, 韓梅, 李成安, 等, 2016. 基于高通量測(cè)序的沼澤山雀簡(jiǎn)化基因組微衛(wèi)星位點(diǎn)的開(kāi)發(fā) [J]. 遼寧大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版), 43(3):252-257.]

    WAN MC, LIU XW, BAN XZ, et al, 2008. The fruit character and nutrition composition of Akebia trifoliata (Thunb.) Koidz under the cultivation condition [J]. Guizhou Agric Sci, 36(3):121-122. [萬(wàn)明長(zhǎng), 劉學(xué)武, 班小重, 等, 2008. 三葉木通栽培條件下果實(shí)性狀及營(yíng)養(yǎng)成分分析 [J]. 貴州農(nóng)業(yè)科學(xué), 36(3):121-122.]

    WANG J, HU W, YANG Y, et al, 2015. Isolation and characterization of microsatellite markers for Eomecon chionantha, a monotypic sepecies endemic to China [J]. Plant Sci J, 33(6):855-860. [王靜, 胡菀, 陽(yáng)億, 等, 2015. 中國(guó)特有單種屬血水草的微衛(wèi)星分子標(biāo)記開(kāi)發(fā)與評(píng)價(jià) [J]. 植物科學(xué)學(xué)報(bào), 33(6):855-860.]

    WENZ H, ROBERTSON JM, MENCHEN S, et al, 1998. High-precision genotyping by denaturing capillary electrophoresis [J]. Genome Res, 8(1):69-80.

    ZHONG WM, MA YH, 2016. Analysis and evaluation of nutritional components in Akebia trifoliate seeds [J]. SW Chin J Agric Sci, 29(1):169-173. [仲偉敏, 馬玉華, 2016. 三葉木通種子的營(yíng)養(yǎng)成分分析與評(píng)價(jià) [J]. 西南農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào), 29(1):169-173.]

    亚洲五月色婷婷综合| 日韩免费av在线播放| 神马国产精品三级电影在线观看 | 国产在线观看jvid| 欧美黑人精品巨大| 免费高清在线观看日韩| 久久久国产成人免费| 婷婷丁香在线五月| 欧美日本视频| 女性被躁到高潮视频| 亚洲国产精品合色在线| 91麻豆av在线| 国产区一区二久久| 色综合欧美亚洲国产小说| 国产视频内射| 午夜老司机福利片| 在线观看免费午夜福利视频| 久久久久九九精品影院| 亚洲七黄色美女视频| 亚洲av电影在线进入| 老汉色av国产亚洲站长工具| 大型黄色视频在线免费观看| 国产高清视频在线播放一区| 一区二区三区高清视频在线| 99久久久亚洲精品蜜臀av| 日本成人三级电影网站| 婷婷精品国产亚洲av| 亚洲专区国产一区二区| 亚洲自偷自拍图片 自拍| 国产亚洲精品综合一区在线观看 | 亚洲欧美激情综合另类| 国产精华一区二区三区| av有码第一页| 91麻豆精品激情在线观看国产| 国产主播在线观看一区二区| 99re在线观看精品视频| 亚洲精品在线观看二区| 日韩精品青青久久久久久| 好男人电影高清在线观看| 男人舔奶头视频| 自线自在国产av| 亚洲五月色婷婷综合| 欧美日韩精品网址| 色老头精品视频在线观看| 国产精品亚洲一级av第二区| 日本成人三级电影网站| 一区二区三区激情视频| 91字幕亚洲| 波多野结衣高清无吗| 搡老岳熟女国产| 制服人妻中文乱码| 国产精品亚洲一级av第二区| 午夜福利免费观看在线| 欧美亚洲日本最大视频资源| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看 | 成人亚洲精品一区在线观看| 久久精品夜夜夜夜夜久久蜜豆 | 老司机午夜十八禁免费视频| 成人手机av| 免费高清视频大片| 在线永久观看黄色视频| 他把我摸到了高潮在线观看| 19禁男女啪啪无遮挡网站| 国产私拍福利视频在线观看| 亚洲人成77777在线视频| 久久久久久大精品| 久久精品影院6| 精品人妻1区二区| 特大巨黑吊av在线直播 | 制服人妻中文乱码| 99国产精品99久久久久| 国产亚洲精品一区二区www| 国产99久久九九免费精品| 不卡av一区二区三区| 亚洲成人免费电影在线观看| 99国产综合亚洲精品| 久久狼人影院| 午夜亚洲福利在线播放| 欧美日韩中文字幕国产精品一区二区三区| 国产成年人精品一区二区| 久久久久精品国产欧美久久久| 桃色一区二区三区在线观看| 99精品久久久久人妻精品| 国产色视频综合| 十八禁人妻一区二区| a级毛片在线看网站| 一夜夜www| 国产精品日韩av在线免费观看| 久久久久久大精品| 丝袜美腿诱惑在线| 久久久久久久午夜电影| 久久久国产精品麻豆| 久久久国产欧美日韩av| www国产在线视频色| 在线av久久热| 亚洲第一电影网av| 国产激情欧美一区二区| 亚洲avbb在线观看| 在线av久久热| 黄色a级毛片大全视频| 国产伦一二天堂av在线观看| 亚洲午夜理论影院| 婷婷精品国产亚洲av| 欧美日韩黄片免| 亚洲第一av免费看| 长腿黑丝高跟| 啪啪无遮挡十八禁网站| 欧美激情高清一区二区三区| 国产成人精品久久二区二区91| 大型av网站在线播放| 国产精品 国内视频| 亚洲黑人精品在线| 一个人观看的视频www高清免费观看 | av福利片在线| 在线观看免费午夜福利视频| 美女 人体艺术 gogo| 久久久久国产一级毛片高清牌| 97超级碰碰碰精品色视频在线观看| 精品无人区乱码1区二区| 一级作爱视频免费观看| 亚洲五月婷婷丁香| 成年人黄色毛片网站| 十八禁人妻一区二区| www.www免费av| aaaaa片日本免费| 久久香蕉激情| 一本久久中文字幕| 叶爱在线成人免费视频播放| 女警被强在线播放| 国产又色又爽无遮挡免费看| 久热这里只有精品99| 亚洲片人在线观看| 最好的美女福利视频网| 韩国精品一区二区三区| 男人舔女人的私密视频| 身体一侧抽搐| 亚洲精品一区av在线观看| 色综合亚洲欧美另类图片| 露出奶头的视频| 两个人免费观看高清视频| 亚洲,欧美精品.| 嫩草影院精品99| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片 | 满18在线观看网站| 免费在线观看完整版高清| a级毛片a级免费在线| 大型av网站在线播放| 一级作爱视频免费观看| 中出人妻视频一区二区| 国产激情久久老熟女| 精品国产乱子伦一区二区三区| 国产片内射在线| 天堂影院成人在线观看| 免费观看人在逋| av视频在线观看入口| 精品欧美国产一区二区三| 亚洲第一欧美日韩一区二区三区| 制服丝袜大香蕉在线| 麻豆av在线久日| 一本久久中文字幕| 精品无人区乱码1区二区| √禁漫天堂资源中文www| 真人做人爱边吃奶动态| 又黄又粗又硬又大视频| 天天一区二区日本电影三级| 国产精品久久久久久亚洲av鲁大| 99re在线观看精品视频| 午夜免费观看网址| 成人亚洲精品一区在线观看| 午夜福利在线观看吧| 热99re8久久精品国产| 日本在线视频免费播放| 国产av一区在线观看免费| 国产激情欧美一区二区| 精品少妇一区二区三区视频日本电影| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡| 色哟哟哟哟哟哟| 久久久久亚洲av毛片大全| 美女免费视频网站| 国产野战对白在线观看| 成人亚洲精品一区在线观看| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放 | 他把我摸到了高潮在线观看| 欧美黄色片欧美黄色片| 亚洲精品色激情综合| 国产精品日韩av在线免费观看| 久久久精品国产亚洲av高清涩受| 天天一区二区日本电影三级| 免费av毛片视频| 久久性视频一级片| 99精品在免费线老司机午夜| 亚洲精品在线观看二区| 搡老妇女老女人老熟妇| 亚洲精品国产一区二区精华液| 国产精品国产高清国产av| 午夜影院日韩av| 亚洲一码二码三码区别大吗| 黄色a级毛片大全视频| 免费在线观看影片大全网站| 免费观看人在逋| 国产精品亚洲av一区麻豆| 天天一区二区日本电影三级| 国产精品久久久久久精品电影 | 国产精品一区二区精品视频观看| 久久亚洲精品不卡| 后天国语完整版免费观看| 搡老熟女国产l中国老女人| 久久久久国内视频| 欧美中文综合在线视频| 国产高清视频在线播放一区| 一夜夜www| 久久国产精品人妻蜜桃| 搡老岳熟女国产| 嫁个100分男人电影在线观看| 久久 成人 亚洲| 最好的美女福利视频网| 亚洲精品久久国产高清桃花| 国产精品亚洲美女久久久| 国产精品久久久久久精品电影 | 18禁美女被吸乳视频| 亚洲精品国产一区二区精华液| 999久久久精品免费观看国产| 90打野战视频偷拍视频| www.熟女人妻精品国产| 亚洲成人精品中文字幕电影| 午夜免费激情av| 韩国av一区二区三区四区| 精品午夜福利视频在线观看一区| 国产亚洲精品久久久久久毛片| 国产三级黄色录像| www.熟女人妻精品国产| 男人舔奶头视频| 欧美黑人巨大hd| 看免费av毛片| 他把我摸到了高潮在线观看| bbb黄色大片| 亚洲色图av天堂| 国产精品一区二区三区四区久久 | 男人舔女人的私密视频| 日韩高清综合在线| 又黄又爽又免费观看的视频| 亚洲国产欧洲综合997久久, | 国产蜜桃级精品一区二区三区| 国产av又大| 欧美乱色亚洲激情| 天堂√8在线中文| 国产单亲对白刺激| 日韩精品青青久久久久久| 老鸭窝网址在线观看| 99国产精品99久久久久| 久久亚洲精品不卡| 老司机午夜福利在线观看视频| 精品国产超薄肉色丝袜足j| 极品教师在线免费播放| 成人一区二区视频在线观看| 午夜福利一区二区在线看| 非洲黑人性xxxx精品又粗又长| 欧美不卡视频在线免费观看 | 国产极品粉嫩免费观看在线| 精品国产超薄肉色丝袜足j| 制服丝袜大香蕉在线| 国产在线精品亚洲第一网站| 久久精品aⅴ一区二区三区四区| 无人区码免费观看不卡| 国产99白浆流出| 精品免费久久久久久久清纯| 久久久久免费精品人妻一区二区 | 欧美中文综合在线视频| 91字幕亚洲| 丝袜人妻中文字幕| 不卡av一区二区三区| 在线天堂中文资源库| 高清在线国产一区| 亚洲精品久久成人aⅴ小说| xxxwww97欧美| 久久精品人妻少妇| 久久香蕉激情| 亚洲精品国产区一区二| 日韩大码丰满熟妇| 国产精品免费视频内射| 欧美zozozo另类| 久久久久免费精品人妻一区二区 | 国产又黄又爽又无遮挡在线| av欧美777| 99久久精品国产亚洲精品| 国产午夜福利久久久久久| 人成视频在线观看免费观看| 熟妇人妻久久中文字幕3abv| 欧美性猛交╳xxx乱大交人| 国内精品久久久久精免费| 久久狼人影院| 人妻久久中文字幕网| 精品人妻1区二区| 国产精华一区二区三区| 国产乱人伦免费视频| 国产亚洲精品久久久久5区| 久久久久久久久免费视频了| 久久天堂一区二区三区四区| 日韩欧美在线二视频| 色在线成人网| 日韩一卡2卡3卡4卡2021年| 老司机靠b影院| 高清毛片免费观看视频网站| 精品不卡国产一区二区三区| 啪啪无遮挡十八禁网站| 亚洲色图av天堂| 51午夜福利影视在线观看| 看黄色毛片网站| 亚洲av成人av| 成人18禁在线播放| 男女做爰动态图高潮gif福利片| 可以免费在线观看a视频的电影网站| 91字幕亚洲| 一区二区三区精品91| 老熟妇乱子伦视频在线观看| 国产成人精品久久二区二区91| 女人爽到高潮嗷嗷叫在线视频| av有码第一页| 一级毛片精品| 国产三级黄色录像| 国产精品野战在线观看| 亚洲精品美女久久av网站| 国产片内射在线| 亚洲国产看品久久| 国产精品久久电影中文字幕| 精品国产一区二区三区四区第35| 亚洲成a人片在线一区二区| 欧美一区二区精品小视频在线| www.www免费av| 国产精品一区二区精品视频观看| 国产高清有码在线观看视频 | 成人国产综合亚洲| 男女床上黄色一级片免费看| 久久午夜亚洲精品久久| 狠狠狠狠99中文字幕| 精品日产1卡2卡| 一级a爱视频在线免费观看| 一a级毛片在线观看| 嫁个100分男人电影在线观看| 国产激情偷乱视频一区二区| 村上凉子中文字幕在线| 又大又爽又粗| 免费在线观看日本一区| 99国产极品粉嫩在线观看| 日韩av在线大香蕉| 最近最新中文字幕大全电影3 | 国内少妇人妻偷人精品xxx网站 | 777久久人妻少妇嫩草av网站| av欧美777| 日韩高清综合在线| 人人澡人人妻人| 自线自在国产av| 90打野战视频偷拍视频| 欧美黄色淫秽网站| 日韩国内少妇激情av| 国产av一区二区精品久久| 高清毛片免费观看视频网站| 看免费av毛片| 人人妻,人人澡人人爽秒播| 国产高清有码在线观看视频 | 黄片大片在线免费观看| 熟女少妇亚洲综合色aaa.| 精品不卡国产一区二区三区| 啦啦啦 在线观看视频| 99精品久久久久人妻精品| 男男h啪啪无遮挡| 久久婷婷成人综合色麻豆| 最近最新中文字幕大全免费视频| 我的亚洲天堂| 精华霜和精华液先用哪个| 久久九九热精品免费| 超碰成人久久| 国产精品久久久久久精品电影 | 午夜视频精品福利| 麻豆av在线久日| 韩国av一区二区三区四区| 中文字幕人妻丝袜一区二区| 无人区码免费观看不卡| 日本成人三级电影网站| 操出白浆在线播放| 国产乱人伦免费视频| 久久久国产精品麻豆| 国产人伦9x9x在线观看| 神马国产精品三级电影在线观看 | 午夜老司机福利片| 中文亚洲av片在线观看爽| 免费看美女性在线毛片视频| 免费观看精品视频网站| av欧美777| 国内精品久久久久久久电影| 国产99白浆流出| 男女视频在线观看网站免费 | 亚洲专区字幕在线| avwww免费| 久久这里只有精品19| av免费在线观看网站| 久久久水蜜桃国产精品网| 精品日产1卡2卡| 亚洲国产欧美日韩在线播放| 亚洲国产精品成人综合色| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看 | 黑人巨大精品欧美一区二区mp4| 一级片免费观看大全| 美女国产高潮福利片在线看| 亚洲精品中文字幕一二三四区| 亚洲va日本ⅴa欧美va伊人久久| 狠狠狠狠99中文字幕| 白带黄色成豆腐渣| 桃红色精品国产亚洲av| 999精品在线视频| 久99久视频精品免费| 婷婷精品国产亚洲av在线| 性欧美人与动物交配| 国产一区在线观看成人免费| 午夜久久久久精精品| 国产精品二区激情视频| 波多野结衣巨乳人妻| 欧美性猛交╳xxx乱大交人| 好看av亚洲va欧美ⅴa在| 日本免费a在线| av电影中文网址| 一夜夜www| 国产精品98久久久久久宅男小说| 91国产中文字幕| 亚洲成人久久性| 国产精品久久视频播放| 亚洲一区中文字幕在线| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片 | 一个人观看的视频www高清免费观看 | 亚洲无线在线观看| 中文字幕精品免费在线观看视频| av视频在线观看入口| 在线观看66精品国产| 欧美成狂野欧美在线观看| 久久久久久人人人人人| 成年免费大片在线观看| 日韩精品免费视频一区二区三区| 久久人妻av系列| 日韩三级视频一区二区三区| 欧美日本视频| 亚洲欧美一区二区三区黑人| 熟女电影av网| 中文字幕人妻熟女乱码| 午夜福利18| 99热这里只有精品一区 | 日本黄色视频三级网站网址| 亚洲人成电影免费在线| 2021天堂中文幕一二区在线观 | 99精品欧美一区二区三区四区| 高潮久久久久久久久久久不卡| 国产精品一区二区三区四区久久 | 亚洲第一青青草原| 精品高清国产在线一区| 午夜亚洲福利在线播放| 国产亚洲欧美精品永久| 草草在线视频免费看| 最新美女视频免费是黄的| 久久久水蜜桃国产精品网| 女人爽到高潮嗷嗷叫在线视频| 国产成人精品无人区| 一区二区三区激情视频| 亚洲人成伊人成综合网2020| 巨乳人妻的诱惑在线观看| 欧洲精品卡2卡3卡4卡5卡区| 亚洲精品美女久久久久99蜜臀| 成人精品一区二区免费| 两个人视频免费观看高清| 午夜两性在线视频| 国产国语露脸激情在线看| 久久久国产欧美日韩av| 黄色丝袜av网址大全| 在线天堂中文资源库| 91九色精品人成在线观看| 欧美zozozo另类| 亚洲成人免费电影在线观看| 人人妻人人澡人人看| 无遮挡黄片免费观看| 国产av一区在线观看免费| 亚洲熟妇熟女久久| 国产成+人综合+亚洲专区| 夜夜爽天天搞| 亚洲精品中文字幕在线视频| 首页视频小说图片口味搜索| 宅男免费午夜| 亚洲av成人一区二区三| 母亲3免费完整高清在线观看| 老汉色∧v一级毛片| 亚洲免费av在线视频| 久久亚洲精品不卡| 日日摸夜夜添夜夜添小说| 亚洲精品中文字幕一二三四区| 亚洲成人免费电影在线观看| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 日本 av在线| 精品国内亚洲2022精品成人| 日韩欧美免费精品| 午夜两性在线视频| e午夜精品久久久久久久| 在线永久观看黄色视频| 国产成人精品久久二区二区免费| 一级片免费观看大全| 欧美一区二区精品小视频在线| 老司机午夜福利在线观看视频| 精品乱码久久久久久99久播| 91在线观看av| 日韩大码丰满熟妇| 亚洲精品一区av在线观看| 高清在线国产一区| or卡值多少钱| 在线观看66精品国产| 黄色片一级片一级黄色片| 日韩精品免费视频一区二区三区| 亚洲精品av麻豆狂野| av视频在线观看入口| 亚洲精品国产区一区二| 中出人妻视频一区二区| 一二三四社区在线视频社区8| 亚洲自偷自拍图片 自拍| 国产亚洲av嫩草精品影院| 久久久久亚洲av毛片大全| 丰满人妻熟妇乱又伦精品不卡| 国产av不卡久久| 女性被躁到高潮视频| 国产熟女午夜一区二区三区| 99re在线观看精品视频| 99精品在免费线老司机午夜| 欧美在线一区亚洲| 午夜视频精品福利| www.精华液| 色综合站精品国产| 一级a爱视频在线免费观看| 无人区码免费观看不卡| 国产精品久久久人人做人人爽| 看黄色毛片网站| 久久精品91无色码中文字幕| av天堂在线播放| 91大片在线观看| 成在线人永久免费视频| 黄网站色视频无遮挡免费观看| 国产97色在线日韩免费| 国产精品,欧美在线| 9191精品国产免费久久| 国产成人影院久久av| 国产亚洲精品第一综合不卡| 人人澡人人妻人| 性色av乱码一区二区三区2| 999精品在线视频| 精品日产1卡2卡| 亚洲精品国产精品久久久不卡| 老司机在亚洲福利影院| 精品一区二区三区四区五区乱码| 国产私拍福利视频在线观看| 国产成+人综合+亚洲专区| 一本一本综合久久| 搡老岳熟女国产| 成人一区二区视频在线观看| 母亲3免费完整高清在线观看| 韩国精品一区二区三区| 91大片在线观看| 免费观看人在逋| 麻豆久久精品国产亚洲av| 91麻豆av在线| 国产精品日韩av在线免费观看| 一级a爱视频在线免费观看| 欧美色欧美亚洲另类二区| 亚洲av美国av| 色老头精品视频在线观看| 人人妻人人澡人人看| 久久天堂一区二区三区四区| 国产成+人综合+亚洲专区| 国产欧美日韩一区二区精品| av在线播放免费不卡| 久久久久久久久中文| 嫁个100分男人电影在线观看| 美女大奶头视频| 成人欧美大片| 亚洲精品久久国产高清桃花| 色在线成人网| 国产激情欧美一区二区| 国产精品久久视频播放| 亚洲美女黄片视频| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 女人被狂操c到高潮| 变态另类丝袜制服| 亚洲专区国产一区二区| 首页视频小说图片口味搜索| АⅤ资源中文在线天堂| 亚洲色图av天堂| 国产视频内射| www.999成人在线观看| 久久久久国产精品人妻aⅴ院| 免费在线观看黄色视频的| 国产欧美日韩一区二区三| av电影中文网址| 久久香蕉激情| 国产精品久久久久久精品电影 | 久久久久九九精品影院| 亚洲第一av免费看| 精品久久久久久久人妻蜜臀av| 一本久久中文字幕| 精品国产一区二区三区四区第35| 国产成人精品久久二区二区免费| 国产精华一区二区三区| 一a级毛片在线观看| 9191精品国产免费久久| 1024手机看黄色片| 日韩欧美一区视频在线观看| 91在线观看av| 欧美人与性动交α欧美精品济南到| 国产蜜桃级精品一区二区三区| 熟妇人妻久久中文字幕3abv| 18禁黄网站禁片午夜丰满| 亚洲av美国av| 国产精品99久久99久久久不卡| 国产区一区二久久|