飲上用坑道儲存水對大鼠胃腸功能的影響

楊 波，吳有軍，王 頤，呂 剛，孫永勝

坑道不僅在戰(zhàn)時可發(fā)揮重要的隱蔽和防御作用，在平時也是某些部隊日常作業(yè)施工乃至飲食起居的場所，由于我國疆域遼闊且山地和海島眾多，因此過去數(shù)十年中我軍在各地修筑了大量此類工事，這些坑道中有相當一部分至今仍在使用[1]。為明確長期坑道生活條件對官兵胃腸道功能和發(fā)病的影響，我們利用大鼠動物模型開展了相關(guān)實驗，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 坑道儲存水 2015-06赴駐京某坑道部隊，將官兵日常飲用水盛放在若干容積約30 L的塑料桶中，敞開放置于坑道內(nèi)，在1、3、6周時分別取出用于喂養(yǎng)大鼠。

1.2 水質(zhì)檢測 由原總參衛(wèi)生防疫隊完成，根據(jù)《GB/T5750-2006生活飲用水標準檢驗方法》檢測水質(zhì)指標30項，檢測結(jié)果根據(jù)《GB5749-2006生活飲用水衛(wèi)生標準》進行判定。

1.3 動物模型 選用雌性Sprague-Dawley大鼠(6～8周齡)40只，隨機分為4組，每組10只，在SPF條件下飼養(yǎng)，飲水使用上述日常飲用水(對照組)和1、3、6周坑道儲存水(實驗組)，均經(jīng)加熱煮沸處理，分別飼喂2周，而后處死進行下一步實驗。

1.4 胃液pH值檢測 SD大鼠禁食48 h，不禁水，頸椎脫臼法處死大鼠，沿腹中線解剖大鼠，充分顯露胃，用血管鉗分別夾閉賁門部及幽門部，用組織剪沿胃小彎側(cè)剪開約1 cm開口，抽取胃液，用廣泛和精密pH試紙(北京化工廠)檢測。

1.5 PGE2檢測 抽取胃液后，楔形切取約0.5 cm×0.5 cm胃壁，剝離黏膜，將其放入勻漿機中勻漿后，按9 ml PBS/g(PBS濃度為0.1 M，PH為7.4)加入PBS，將樣本放入試管進行離心，3000 r/min×5 min，取上清放入EP管后-80 ℃保存?zhèn)溆?。使用PGE2 ELISA試劑盒(YAD9116，北京雅安達生物技術(shù)有限公司)檢測PEGE2濃度。

1.6 糞便球桿比 頸椎脫臼法處死大鼠，沿腹中線解剖大鼠，充分顯露結(jié)直腸，于結(jié)直腸處取少量糞便放于無菌試管中，由我院檢驗科檢測其球桿比。具體步驟：涂片→晾干、固定→龍膽紫液10 s→碘溶液10 s→脫色溶液15 s→沙黃溶液10 s→100倍油鏡下觀察。

1.7 胃黏膜細胞S期和凋亡百分比 (1)單細胞液制備：①將胃黏膜放入0.5%的胰酶溶液試管中；②將試管置入37 ℃恒溫水箱中30～40 min，并不斷吹打，使細胞脫落、分散；③用200目細胞篩收集胃黏膜細胞，每次收集細胞不少于106個，PBS液反復吹打，離心10 min(1000 r/min)，重復3次以去除消化酶液；④加入80%冰乙醇固定，-80 ℃溫度保存留用。(2)PI法(碘化丙啶法)染色：①取標本1000 r/min離心，棄上清；②加入1 ml冰預冷的PBS液，離心，棄上清；③加入細胞周期試劑盒中A試劑(破膜)250 μl，用手輕搖混勻，放置10 min；加入B試劑(固定)250 μl，用手輕搖混勻，放置10 min；加入C試劑(PI)200 μl，用手輕搖混勻，避光放置10 min；④用流式細胞儀檢測。

2 結(jié) 果

2.1 水質(zhì)變化情況 對該部隊日常飲用水和在坑道中分別儲存1、3、6周的水進行水質(zhì)檢測(每組6份水樣)，發(fā)現(xiàn)感官性狀指標、一般化學指標、毒理學指標及細菌學指標中的總大腸菌群均無明顯變化，而細菌總數(shù)隨時間逐漸升高，在飲用水、儲存1、3、6周水組分別為(37.4±12.4) cfu/ml、(83.6±17.3 )cfu/ml、(151.7±25.6) cfu/ml和(242.3±34.3 )cfu/ml，其中儲存3、6周的水明顯超出國家標準范圍(≤100 cfu/ml，表1)。

比較指標飲用水儲存時間1周3周6周胃液pH值3.05±0.183.19±0.313.74±0.772.48±0.57胃黏膜PGE2水平(mg/L)427.04±27.81440.56±25.14437.30±34.07385.43±31.28糞便球桿比1/3.45±2.241/3.05±2.341/3.75±2.071/3.65±2.03S期細胞百分比(%)3.32±0.173.37±0.284.46±0.614.19±0.76胃黏膜凋亡細胞百分比(%)0.17±0.130.28±0.150.41±0.110.59±0.17

2.2 大鼠相關(guān)指標 4組間大鼠糞便球桿比無統(tǒng)計學差異。儲存3周小組胃液pH值高于飲用水組和儲存1周水組，儲存6周水組低于前三組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；儲存6周水組胃黏膜PGE2低于其他三組，差異有統(tǒng)計學意義；儲存3周水組和儲存6周水組胃黏膜S期細胞百分比高于其他兩組，儲存3周水組凋亡細胞百分比高于飲用水組，儲存6周水組高于其他三組，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05，表1。)

3 討 論

坑道具有陰暗、潮濕、低溫，以及空氣流通差的特點，長期在此種環(huán)境下工作生活可危害身心健康，包括引發(fā)一些消化系統(tǒng)疾病[2]，但是關(guān)于儲存水在其中所發(fā)揮的作用尚不明確，既往已有研究表明水在坑道中儲存可發(fā)生細菌學和真菌學方面的改變[3]，考慮到坑道作業(yè)官兵通常需要較長時間飲用這種儲存水，特別是在戰(zhàn)時，因此我們推測飲用坑道儲存水可能是影響官兵胃腸道疾病發(fā)生的重要因素之一。

坑道駐訓官兵飲水來源根據(jù)坑道類型和規(guī)模不同差異較大，某些大型坑道系統(tǒng)可采集地下水或建有大容量蓄水池，根據(jù)該坑道部隊實際情況，本研究中我們使用日常飲用水作為儲存水的來源。另外從理論上說盛水容器應該嚴格密閉，這樣可以防止污染保證水質(zhì)，但實際由于使用人數(shù)較多，很難做到這一點，因此本研究中我們將水敞開放置于坑道中。基于上述考慮本研究結(jié)果能夠較好地用于指導此類坑道部隊的衛(wèi)生防病工作。

我們發(fā)現(xiàn)儲存水對大鼠胃液pH值具有顯著影響，表現(xiàn)為飲用儲存3周水的大鼠胃液pH值明顯上升，而飲用儲存6周水的大鼠胃液pH值明顯下降，反映出胃黏膜壁細胞的泌酸功能紊亂，分析原因pH值上升可能是壁細胞受有害因素損傷導致細胞數(shù)量或泌酸量減少，pH值下降則可能與細胞代償性增生或功能增強有關(guān)。胃液pH值變化可進一步產(chǎn)生以下效應：一是影響食物消化吸收；二是胃內(nèi)某些細菌如革蘭陰性桿菌和幽門螺旋桿菌含量發(fā)生改變[4]，繼而促進胃腸道疾病的發(fā)生；三是直接對胃黏膜造成損害。我們還測定了飲用不同時長坑道儲存水的大鼠胃黏膜組織PGE2含量，結(jié)果顯示PGE2水平在飲用儲存6周水的大鼠顯著降低，而PGE2是胃黏膜的重要保護因子，說明飲用儲存水可能通過降低PGE2進而造成胃黏膜損害，導致相關(guān)疾病例如胃功能障礙、消化性潰瘍等的發(fā)生。當然我們也注意到，具有統(tǒng)計學差異的PGE2降低僅在大鼠飲用儲存6周的水時才出現(xiàn)，這在平時或一般情況下雖然不太可能發(fā)生，但是在戰(zhàn)時或一些特殊情況下是有可能出現(xiàn)的，我軍許多坑道也建有可容納數(shù)噸乃至數(shù)十噸水的大型儲水池以備人員長期飲用[5]。

與上述發(fā)現(xiàn)一致的是在飲用儲存3周和儲存6周水的大鼠中，胃黏膜S期和凋亡細胞比例均出現(xiàn)了明顯上升，S期是細胞合成DNA為下一步分裂做準備，從一定程度上反映細胞的增殖狀態(tài)，這說明飲用儲存水后，胃黏膜細胞在有害因素作用下同時發(fā)生了過度增生和死亡，這種情況長期持續(xù)將為細胞癌變創(chuàng)造有利條件[6]。另外我們注意到糞便球桿比在各組間無統(tǒng)計學差異，說明飲用坑道儲存水對腸道菌群可能沒有顯著影響。

我們檢測了不同時長的坑道儲存水的水質(zhì)以明確胃腸功能損害的可能因素，發(fā)現(xiàn)隨著儲存時間延長，坑道儲存水的變化主要是細菌總數(shù)升高，而在感官性狀、化學物質(zhì)和毒理學指標方面無明顯改變，但在本研究中，為盡可能模擬實際情況，我們對所有水樣均進行了煮沸殺菌處理，因而可以排除微生物本身造成的胃黏膜損害，說明在坑道環(huán)境下還存在其他能夠污染飲水并造成胃黏膜損傷的因子，根據(jù)文獻報道，真菌及其毒素對坑道儲存水的危害也不容忽視[7]，已知多種真菌毒素對人體有致病作用，且相當一部分具有較強的耐熱特性，一般的烹調(diào)過程均不能將其破壞[8]，例如黃曲霉素需加熱到280 ℃才發(fā)生裂解，赭曲霉素為134 ℃，單端孢霉烯族類化合物在200 ℃以上。此外，本研究僅對水質(zhì)的常規(guī)指標進行了檢測，而重金屬等非常規(guī)指標由于條件所限未有涉及，這部分可在未來的研究中加以完善。

以上結(jié)果說明坑道儲存水即使經(jīng)過煮沸殺菌處理仍然能夠?qū)ξ葛つぴ斐蓳p害，這或許是由于其中存在某些耐熱的細菌或真菌毒素[3，8]，當然也不排除坑道內(nèi)一些特殊物質(zhì)包括重金屬、礦物質(zhì)等隨施工粉塵進入水中[9]，對此一方面有必要繼續(xù)進行深入研究，另一方面也提示我們應盡可能采取其他有效措施，例如盛水容器嚴格密封防止水受污染、勤于更換新鮮飲用水、加強水質(zhì)凈化處理、盡量不飲用儲存時間較長的水，以保障官兵飲水安全和部隊戰(zhàn)斗力。