細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法在納米銀醫(yī)用抗菌敷料評價(jià)中的應(yīng)用

羅洋 袁博 天津市醫(yī)療器械質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心 （天津 300384）

內(nèi)容提要： 依據(jù)《中華人民共和國藥典》（2015年版）四部1143細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法和“YY/T 1295-2015醫(yī)療器械生物學(xué)評價(jià)-納米材料：細(xì)菌內(nèi)毒素試驗(yàn)”，研究浸提時(shí)間對試驗(yàn)結(jié)果的影響，同時(shí)比對凝膠限度試驗(yàn)、凝膠半定量試驗(yàn)和動態(tài)濁度法在該產(chǎn)品細(xì)菌內(nèi)毒素檢測結(jié)果的一致性。以探討納米銀抗菌敷料的細(xì)菌內(nèi)毒素定性與定量檢查方法。結(jié)果表明，該產(chǎn)品在37?C下浸提1～2h細(xì)菌內(nèi)毒素含量不發(fā)生明顯改變；該產(chǎn)品在三種試驗(yàn)條件研究下的結(jié)果具有一致性，其內(nèi)毒素限值符合規(guī)定。

納米銀顆粒由于直徑極其微小、比表面積極大和極易進(jìn)入病原體等特點(diǎn)在抗菌醫(yī)用導(dǎo)管、抗菌敷料、牙科材料和植入材料等方面具有廣闊的應(yīng)用前景[1,2]。目前國內(nèi)已經(jīng)批準(zhǔn)上市的納米銀產(chǎn)品多為抗菌敷料和婦用凝膠，納米銀抗菌敷料具有良好的抗感染作用，毒副作用小且納米銀含量不會產(chǎn)生積累現(xiàn)象[3,4]。

細(xì)菌內(nèi)毒素試驗(yàn)是利用鱟試劑和細(xì)菌內(nèi)毒素產(chǎn)生凝集反應(yīng)來判斷醫(yī)療器械中細(xì)菌內(nèi)毒素限量是否符合規(guī)定，是目前國際上通用的最簡便有效的方法，具有重現(xiàn)性強(qiáng)，靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)。本文依據(jù)《中華人民共和國藥典》（2015年版）四部[5]1143細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法和《YY/T 1295-2015醫(yī)療器械生物學(xué)評價(jià) 納米材料：細(xì)菌內(nèi)毒素試驗(yàn)》[6]，利用凝膠限度試驗(yàn)、凝膠半定量試驗(yàn)和動態(tài)濁度法三種試驗(yàn)方法比較不同浸提時(shí)間對納米銀醫(yī)用抗菌敷料的細(xì)菌內(nèi)毒素含量的影響，同時(shí)從定性、半定量和定量各個(gè)維度考察該產(chǎn)品細(xì)菌內(nèi)毒素含量，為評價(jià)臨床應(yīng)用納米銀抗菌敷料的安全性提供參考。

1.材料與設(shè)備

1.1 材料與試劑

試驗(yàn)材料：納米銀醫(yī)用抗菌敷料（規(guī)格：10cm×15cm，批號：170103，公司：深圳市愛杰特醫(yī)藥科技有限公司）。

試劑：①細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品（效價(jià)：10EU/mL，批號：1603300，公司：湛江安度斯生物有限公司）；②鱟試劑（靈敏度：0.25EU/mL，批號：1701091；靈敏度：0.015EU/mL，批號：1703100，公司：湛江安度斯生物有限公司）；③動態(tài)濁度法鱟試劑（規(guī)格：1.25mL/支，批號：1504230，檢測范圍：10～0.005EU/mL，公司：湛江安度斯生物有限公司）；④細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水（規(guī)格：50mL/瓶，批號：1605180，內(nèi)毒素含量：低于0.003EU/mL，公司：湛江安度斯生物有限公司）。

1.2 設(shè)備

①ET-96內(nèi)毒素凝膠法測定儀（公司：天津天大天發(fā)科技有限公司）；②細(xì)菌內(nèi)毒素檢查-32M細(xì)菌內(nèi)毒素檢測儀（公司：天津天大天發(fā)科技有限公司）。

2.方法與結(jié)果

2.1 樣品溶液的制備

取300cm2敷料，吸飽和后加入50mL細(xì)菌內(nèi)毒素檢查水浸沒樣品置（37±1）?C浸提1h。同法，制備浸提時(shí)間為2h的樣品溶液。

2.2 凝膠法

2.2.1 鱟試劑靈敏度復(fù)核

按《中華人民共和國藥典》（2015年版）四部[5]1143細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法復(fù)核鱟試劑靈敏度。本次試驗(yàn)所用的2批鱟試劑靈敏度分別為0.25EU/mL和0.015EU/mL。結(jié)果顯示，2批鱟試劑靈敏度的測定值分別為0.25EU/mL和0.015EU/mL，均符合規(guī)定，可用于試驗(yàn)。

2.2.2 干擾預(yù)實(shí)驗(yàn)

有文獻(xiàn)表明，該類產(chǎn)品的細(xì)菌內(nèi)毒素限值為0.5EU/mL，目前市售鱟試劑的最高靈敏度為0.015EU/mL，因此該樣品溶液最大有效稀釋倍數(shù)MVD為33倍[7]。將樣品溶液用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查水進(jìn)行一系列倍比稀釋，最大稀釋倍數(shù)不超過MVD。每一稀釋倍數(shù)下制成含細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品2λ濃度的樣品溶液陽性對照，用標(biāo)示靈敏度為0.25EU/mL的鱟試劑進(jìn)行試驗(yàn)。同時(shí)，設(shè)置陽性和陰性對照。結(jié)果表明（表1），浸提1h和2h的樣品溶液在2倍稀釋后有可能排除干擾。

2.2.3 干擾試驗(yàn)

按《中華人民共和國藥典》（2015年版）四部[5]1143細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法進(jìn)行干擾試驗(yàn)。用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查水及樣品溶液2倍稀釋液將內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品稀釋成所需濃度，選用標(biāo)示靈敏度為0.25EU/mL的鱟試劑進(jìn)行試驗(yàn)[5]。結(jié)果表明，2λ/樣品溶液的結(jié)果均在0.5～2λ，說明樣品溶液2倍稀釋液對細(xì)菌內(nèi)毒素試驗(yàn)無干擾作用。見表2。

2.2.4 凝膠限度試驗(yàn)

取樣品溶液2倍稀釋液為供試液，用靈敏度為0.25EU/mL的鱟試劑進(jìn)行細(xì)菌內(nèi)毒素檢查。結(jié)果表明，該產(chǎn)品的細(xì)菌內(nèi)毒素檢查符合規(guī)定，即樣品中的細(xì)菌內(nèi)毒素含量小于0.5EU/mL。見表3。

2.2.5 凝膠半定量試驗(yàn)

用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查水將樣品溶液2倍稀釋液稀釋2、4、8倍，最大稀釋倍數(shù)不超過MVD。使用靈敏度為0.015EU/mL的鱟試劑檢測樣品溶液中的內(nèi)毒素含量。見表4。供試品系列的反應(yīng)終點(diǎn)濃度均為0.24EU/mL，終點(diǎn)濃度乘以初始稀釋倍數(shù)2，得到1h樣品溶液和2h樣品溶液的內(nèi)毒素濃度均為0.48EU/mL，低于規(guī)定的限值0.5 EU/mL。

2.3 動態(tài)濁度法

2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的可靠性試驗(yàn)

用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查水將內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品制成濃度分別為5EU/mL、1EU/mL、0.2EU/mL和0.04EU/mL的稀釋液，各取0.2mL加入預(yù)先加入0.1mL動態(tài)濁度法鱟試劑的玻璃管內(nèi)，混合均勻后插入儀器內(nèi)進(jìn)行檢測，每一濃度做3支平行管，同時(shí)用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查水做2支陰性對照。見表5。陰性對照的反應(yīng)時(shí)間大于標(biāo)準(zhǔn)曲線最低點(diǎn)的反應(yīng)時(shí)間，回歸方程為LgT=2.82283+(-0.22808LgC)，其中相關(guān)系數(shù)r=-0.9977，故標(biāo)準(zhǔn)曲線成立。

表1. 干擾預(yù)試驗(yàn)結(jié)果

表2. 干擾試驗(yàn)結(jié)果

表3. 凝膠限度試驗(yàn)結(jié)果

表4. 凝膠半定量試驗(yàn)結(jié)果

表5. 標(biāo)準(zhǔn)曲線可靠性試驗(yàn)結(jié)果(n=3)

2.3.2 干擾試驗(yàn)

將制備好的1h樣品溶液和2h樣品溶液各稀釋8倍，并分別在稀釋液里加入λm為0.5EU/mL的內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液。各取上述4種溶液0.2mL分別加入預(yù)先加入0.1mL動態(tài)濁度法鱟試劑的玻璃管內(nèi)，每種溶液做2支平行管。標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備同2.3.1，每一濃度做2支平行管。同時(shí)用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查水做2支陰性對照。結(jié)果顯示，標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程為LgT=2.73639+(-0.5965LgC)，其中相關(guān)系數(shù)r=-0.9991，1h供試品溶液8倍稀釋液的回收率為148%，2h供試品溶液8倍稀釋液的回收率為123%，因此認(rèn)為1h供試品溶液8倍稀釋液和2h供試品溶液8倍稀釋液在本試驗(yàn)條件下均不存在干擾作用。

2.3.3 樣品溶液內(nèi)毒素含量測定

1h供試品溶液8倍稀釋液和2h供試品溶液8倍稀釋液的內(nèi)毒素實(shí)測值分別為0.0583EU/mL和0.0558EU/mL。乘以稀釋倍數(shù)8后，1h樣品原液和2h樣品原液的細(xì)菌內(nèi)毒素含量分別為0.4664EU/mL和0.4464EU/mL，均小于0.5EU/mL的限值。

3.討論

YY/T 1295-2015[6]制備供試品溶液的浸提時(shí)間未定，而一般情況下醫(yī)療器械浸提時(shí)間為不少于1h[8]。而查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，醫(yī)用敷料細(xì)菌內(nèi)毒素試驗(yàn)中的浸提時(shí)間均為2h[7-9]。本文對納米銀抗菌敷料分別浸提1mL和2h后的樣品溶液進(jìn)行了定性到定量的一系列試驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，浸提時(shí)間為1h或2h對檢測結(jié)果均無影響，該產(chǎn)品的細(xì)菌內(nèi)毒素含量不發(fā)生明顯改變。查閱文獻(xiàn)還發(fā)現(xiàn)，制備樣品溶液時(shí)浸提比例有3cm2/mL、4cm2/mL和6cm2/mL，YY/T 1295-2015[6]中規(guī)定供試品濃度在必要時(shí)選擇體外細(xì)胞試驗(yàn)中確定的最高濃度，因此，本次試驗(yàn)的浸提比例選擇更為嚴(yán)格的6cm2/mL[7-9]。試驗(yàn)結(jié)果顯示，按此比例得到的浸提液內(nèi)毒素濃度小于0.5EU/mL。

細(xì)菌內(nèi)毒素檢查包括凝膠法和光度測定法，凝膠法又分凝膠限度試驗(yàn)和凝膠半定量試驗(yàn)。光度測定法比較常用的是動態(tài)濁度法。本文利用凝膠法考察納米銀抗菌敷料的細(xì)菌內(nèi)毒素含量時(shí)，首先進(jìn)行干擾試驗(yàn)預(yù)試驗(yàn)推測排除干擾的稀釋倍數(shù)，再通過正式干擾試進(jìn)一步確認(rèn)樣品原液稀釋2倍后即可消除干擾。干擾試驗(yàn)結(jié)果說明凝膠法對于納米銀抗菌敷料的細(xì)菌內(nèi)毒素檢查是可行的。凝膠限度試驗(yàn)和半定量試驗(yàn)結(jié)果顯示該產(chǎn)品細(xì)菌內(nèi)毒素含量均小于0.5EU/mL。利用動態(tài)濁度法考察納米銀抗菌敷料的細(xì)菌內(nèi)毒素含量時(shí)首先也是進(jìn)行干擾試驗(yàn)，樣品原液稀釋8倍后其內(nèi)毒素回收率在50%～200%范圍內(nèi)，表明樣品原液的8倍稀釋液不存在干擾作用，可以用動態(tài)濁度法定量檢測納米銀抗菌敷料的細(xì)菌內(nèi)毒素含量，檢測結(jié)果顯示該產(chǎn)品的內(nèi)毒素含量同樣符合規(guī)定。綜上結(jié)果發(fā)現(xiàn)納米銀抗菌敷料利用凝膠限度試驗(yàn)、凝膠半定量試驗(yàn)和動態(tài)濁度法測得細(xì)菌內(nèi)毒素含量的結(jié)果具有高度一致性。

細(xì)菌內(nèi)毒素試驗(yàn)作為納米材料生物學(xué)評價(jià)體外試驗(yàn)的重要指標(biāo)，對于評價(jià)納米材料的生物安全非常重要。本文通過供試品的稀釋成功地克服了干擾，從凝膠法和動態(tài)濁度法兩個(gè)方面較深入全面的評價(jià)了納米銀敷料細(xì)菌內(nèi)毒素的情況，為納米銀產(chǎn)品建立高質(zhì)量的檢測和評價(jià)方法提供了依據(jù)。