安全高效紅曲米工程化生產技術開發(fā)

景萬星，張華山，魏 萍，徐 歡，肖啟榮，姚繼承，3*

（1.武漢佳成生物制品有限公司，湖北 武漢 430000；2.湖北工業(yè)大學 生物工程與食品學院,湖北 武漢 430000；3.湖北省食品發(fā)酵技術工程中心，湖北 武漢 430000）

紅曲是我國先民的一項偉大發(fā)明，在我國和世界微生物學開發(fā)與利用發(fā)展史上具有極其重要的意義，是祖國寶貴的科學文化遺產[1]。在我國及東亞地區(qū)一直被用作食品添加劑或調味料，同時還具有防腐功能，已有上千年的發(fā)展歷史[2-3]。紅曲米具有多種生物學和藥理學作用，如抗氧化、抗血脂、抗糖尿病、抗炎、抗阿爾茨海默病、抗高膽固醇、抗高血壓、抗肥胖以及抗癌等[4-9]。部分紅曲霉菌株會產生橘霉素，對人體和動物有毒害作用，橘霉素具有抗菌性、腎臟毒性、細胞毒性、遺傳毒性、免疫毒性，可以引起突變或致畸[10-15]。

REHAB M等[16]通過分離篩選，獲得紅曲霉菌M-92，經培養(yǎng)后，獲得的紅曲米色價達到2 138 U/g，同時對多種細菌和植物病原真菌有抑制作用。劉宏等[17]通過紅光的照射能促進紫色紅曲霉菌M9的生長，提高了紅色素和黃色素的產量，降低了橙色素和橘霉素的產量。楊歡歡[18]采用紫外-氯化鋰復合誘變得到突變菌株M-H4-3，其Monaclin K產量可達5.33 mg/g，是原始菌株的2倍多。鄭春明等[19]通過正交試驗發(fā)現，最佳的250 mL搖瓶培養(yǎng)條件為加水30 mL，大米浸泡24 h，121℃滅菌23 min，最后獲得的紅曲米色價為2 884 U/g。莊曉曉等[20]將N+離子束誘變后的紅曲霉菌株進行了紫外誘變，獲得了一株優(yōu)良菌株，橘霉素產量下降了96.6%。

一直以來，紅曲米以作坊式的生產模式為主，集中化程度不高，色價水平不穩(wěn)定，橘霉素得不到有效的控制，關于紅曲霉菌固體發(fā)酵工程化生產的研究也鮮有報道，工業(yè)化生產安全高效的紅曲米是本行業(yè)亟需解決的問題。本研究希望通過淺盤試驗、中試試驗和工程化生產試驗形成安全高效紅曲米工程化的生產工藝，為紅曲色素產業(yè)的持續(xù)發(fā)展提供可借鑒的經驗。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紅色紅曲霉（Monascus anka）JC-SM12（CCTCCNO：M2014420）：武漢佳成生物制品有限公司自有菌株；大米：益海嘉里（武漢）糧油工業(yè)有限公司；橘霉素標準品（純度98%）：美國Sigma公司；葡萄糖、硝酸鈉、磷酸二氫鉀、硫酸鎂、乙醇（體積分數95%）、甲苯、乙酸乙酯、磷酸、甲醇、乙腈、碳酸鈉：國藥集團化學試劑有限公司。以上試劑除甲醇和乙腈為色譜純外，其余均為分析純。

試管斜面固體培養(yǎng)基：葡萄糖6%，蛋白胨2%，瓊脂3%，pH自然。搖瓶和發(fā)酵罐種子液培養(yǎng)基：可溶性淀粉3%，硝酸鈉0.2%，磷酸二氫鉀0.15%，硫酸鎂0.1%，pH5.5～6.0。固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基：早秈稻大米室溫條件下浸泡4 h，淋清、瀝干水分后放于蒸籠中蒸30 min。以上幾種培養(yǎng)基滅菌條件為：121℃，30 min。

搖瓶種子液制備方法：選取本公司已經優(yōu)化選育的低產橘霉素高產色素的紅色紅曲霉菌株MonascusankaJC-SM12菌株制作試管斜面種子，30℃培養(yǎng)8～10 d。取500 mL搖瓶（裝液量200 mL）制作搖瓶液體種子液，接種量為1～2 cm2的斜面種子中的菌苔，30℃、180 r/min培養(yǎng)48 h。

1.2 儀器與設備

HPLC-16高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）儀（配RF-20A熒光檢測器、島津C18柱（250 mm×4.6 mm，4.5 μm））：日本島津公司；V-1100可見光分光光度計：上海美普達儀器有限公司；YL-060S超聲波清洗機：深圳市語路清洗設備有限公司；3 t液體發(fā)酵罐：無錫市金賽普生物化學裝備廠；不銹鋼淺盤（400 mm×300 mm×70 mm）：市售；紅曲霉發(fā)酵曲池、蒸米車、米飯攤涼機、接種機：自行設計全不銹鋼設備。

1.3 方法

1.3.1 固態(tài)培養(yǎng)基最佳pH的選擇

取15個不銹鋼淺盤，洗凈，烘干，分成5組，每組設置3個平行試驗，每盤裝入400 g（以干米計）固體發(fā)酵培養(yǎng)基，用食用醋酸和碳酸鈉把每組培養(yǎng)基的pH分別調成4.5、5.5、6.5、7.5、8.5，121 ℃滅菌30 min，在超凈工作臺內，趁熱打散，冷卻至35℃，接入7%液體種子，36℃高溫養(yǎng)花20 h，然后溫度降為32℃，培養(yǎng)10d，每天翻料一次。培養(yǎng)結束后，70℃烘干，測定其色價和橘霉素的含量，并用色價/橘霉含量的比值考察菌種高產色素和低產橘霉素能力的大小。

1.3.2 固態(tài)發(fā)酵最佳培養(yǎng)時間的選擇

取18個不銹鋼淺盤，洗凈，烘干，分成6組，每組設置3個平行試驗，每盤裝入400g（以干米計）固體發(fā)酵培養(yǎng)基，pH參考步驟1.3.1，121℃滅菌30 min，在超凈工作臺內，趁熱打散，冷卻至35℃，接入7%液體種子，36℃高溫養(yǎng)花20h，然后，溫度降為32 ℃，每組分別培養(yǎng)5 d、6 d、7 d、8 d、9 d、10 d，每天翻料一次。培養(yǎng)結束后，70℃烘干，測定其色價和橘霉素含量。

1.3.3 紅曲米固態(tài)發(fā)酵條件優(yōu)化正交試驗

影響紅曲固態(tài)培養(yǎng)的因素很多，如培養(yǎng)基裝量、接種量、養(yǎng)花溫度、培養(yǎng)溫度（即降溫后的培養(yǎng)溫度）、首次翻曲時間、加水量等。根據實驗室之前的研究結果，選取培養(yǎng)基裝量（A）、培養(yǎng)溫度（B）、接種量（C）和養(yǎng)花溫度（D）4個關鍵因素進行正交試驗，選擇色價/橘霉素含量的比值作為考察指標，選擇L9（34）正交表進行試驗設計，正交試驗因素與水平見表1。

表1 紅曲米固態(tài)培養(yǎng)條件優(yōu)化正交試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments for red kojic rice solid-state fermentation conditions optimization

1.3.4 中試制種試驗

用3t發(fā)酵罐進行液體種子制備，發(fā)酵罐載液量70%。培養(yǎng)基121℃滅菌30 min，冷卻至32℃，接種6.0‰的搖瓶種子液，轉速300 r/min，通氣比1.0 vvm，培養(yǎng)溫度32℃，菌絲體含量達到30 g/L即可接種固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基。連續(xù)進行3批試驗，考察制種工藝的穩(wěn)定性。

1.3.5 中試生產試驗

用發(fā)酵罐制取種子液，進行750 kg級別的固態(tài)發(fā)酵中試生產，設置3個平行試驗。大米浸泡4h，清洗、撈出、瀝干，裝入蒸米車，通蒸汽30min，倒入攤涼機，溫度降至35℃，用接種機進行接種。高溫房內養(yǎng)花20h后，將長滿紅曲霉菌的大米培養(yǎng)基轉運到發(fā)酵池中培養(yǎng)。培養(yǎng)基pH、培養(yǎng)時間、接種量、養(yǎng)花溫度、培養(yǎng)溫度參考前述試驗結果。培養(yǎng)過程中，用溫度傳感器控制鼓風機，對曲池進行恒溫控制和補充氧氣，通過噴淋自來水控制物料的水分，每天早晚各翻料一次。培養(yǎng)結束后，70℃烘干，檢測其色價和橘霉素含量。

1.3.6 工程化生產試驗

根據中試試驗結果，結合所有生產環(huán)節(jié)的最優(yōu)條件，進行生產工藝的貫通性驗證。同時驗證生產工藝的連貫性及各部門的協作性，連續(xù)做100 kg級、400 kg級、1 200 kg級三個級別的生產試驗，每個級分別做3個平行試驗。

1.3.7 測定方法

色價的測定方法：根據GB 1886.19—2015《食品添加劑紅曲米（粉）》中方法進行色價的檢測[21]。橘霉素的檢測方法：根據國標GB/T 5009.222—2016《食品中桔青霉素的測定》中方案進行橘霉素的檢測[22]。紅曲米產率：紅曲霉培養(yǎng)結束后，70℃烘干，稱質量，計算成品紅曲米占初始大米質量的比例，即紅曲米產率。紅曲米的控制標準：色價≥400 U/g，橘霉素≤100 μg/kg。

2 結果與分析

2.1 固態(tài)發(fā)酵最佳pH試驗結果

對培養(yǎng)10 d的紅曲米取樣、烘干，測定色素和橘霉素的含量，結果如表2所示。含量僅為1.36 μg/kg，但第8 d之后，橘霉素的合成速度迅速提高，當培養(yǎng)時間達到10d時，橘霉素的含量達到了最大值，平均值為35.51 μg/kg。由色價和橘霉素的比值來看，培養(yǎng)時間越久，比值越小，在培養(yǎng)8 d之前，比值很大，但是色價都小于4 000 U/g，不滿足控制要求，當培養(yǎng)時間≥8 d時，色價都大于4 000 U/g，且在培養(yǎng)8 d時，色價和橘霉素的比值最大。因此，培養(yǎng)8 d比較合適。

表2 pH值對紅曲米色價和橘霉素的影響Table 2 Effect of pH value on color value and citrinin content ofred kojic rice

表3 培養(yǎng)時間對紅曲米色價和橘霉素的影響Table 3 Effects of culture time on color value and citrinin content in red kojic rice

2.3 紅曲米固態(tài)發(fā)酵條件優(yōu)化正交試驗結果

根據實驗室之前的研究結果，選擇培養(yǎng)基裝量、培養(yǎng)溫度、接種量和養(yǎng)花溫度4個因素進行正交試驗，試驗結果如表4所示。

從表2可知，pH 5.5時，紅曲米的色價最高，平均值達5 072 U/g，橘霉素含量的平均值為77.93 μg/kg，色價/橘霉素含量的比值為65.08。pH 7.5時，紅曲米的色價最低，平均值為3 796U/g，橘霉素含量的平均值為61.33 μg/kg，色價/橘霉素含量的比值為61.89。pH 6.5時，紅曲米的色價平均值為4 623 U/g，橘霉素的含量最低，平均值為36.28 μg/kg，色價/橘霉素含量的比值最高，平均值為127.43?？梢妏H 6.5時，紅曲米的色價高，橘霉素含量低，由色價/橘霉素含量的比值可知，在此條件下，菌種高產色素和低產橘霉素的能力最大，其安全高效的性能最佳，最能滿足安全高效的要求。因此選擇最佳培養(yǎng)基pH值為6.5。

2.2 固態(tài)發(fā)酵最佳培養(yǎng)時間試驗結果

紅曲的色素和橘霉素合成不同步，橘霉素總是在色素合成后期快速積累，合適的發(fā)酵周期能有效地降低橘霉素的產生。試驗過程中，分別對培養(yǎng)5 d、6 d、7 d、8 d、9 d、10 d的試驗組進行取樣和檢測，測定結果如表3所示。

由表3可知，隨著培養(yǎng)時間的延長，色素和橘霉素的含量逐漸上升。當培養(yǎng)6 d時，色素的合成速度加快，到第8 d時，色素的合成速度變慢，此時，色價的平均值已經達到4 319 U/g，滿足了控制標準（色價≥4 000 U/g），培養(yǎng)第10 d時，色價達到最大值，平均值為4 654 U/g。在培養(yǎng)第8 d之前，橘霉素的合成速度很慢，在培養(yǎng)第8 d時，橘霉素的平均

表4 紅曲米固態(tài)培養(yǎng)條件優(yōu)化正交試驗結果與分析Table 4 Results and analysis of orthogonal experiments for solid-state fermentation conditions of red kojic rice optimization

由表4可知，培養(yǎng)基裝量、培養(yǎng)溫度、接種量和養(yǎng)花溫度4個因素的極差分別為22.8、37.2、22、49，養(yǎng)花溫度對紅曲米的色價/橘霉素含量的比值影響最大，其次為培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)基裝量、接種量，即養(yǎng)花溫度＞培養(yǎng)溫度＞培養(yǎng)基裝量＞接種量。由k值來看，培養(yǎng)基裝量、培養(yǎng)溫度、接種量和養(yǎng)花溫度最優(yōu)水平組合為A3B1C3D2，即培養(yǎng)基裝量500 g/淺盤、培養(yǎng)溫度32℃、接種量9%和養(yǎng)花溫度40℃，在此條件下，色價/橘霉素含量最大為195.12，能獲得高色價低橘霉素的安全高效產品。

2.4 中試制種試驗結果

為了滿足工程化生產過程對大量液體種子的需求，進行了3 t發(fā)酵罐種子擴培試驗，試驗結果見表5。

表5 液體種子擴培試驗結果Table 5 Results of scale-up tests of liquid seed

由表5可知，按照此方法培養(yǎng)的種子生長周期比較短，菌種的生長狀態(tài)比較好，感官特征和形態(tài)特征都很好，生長旺盛，菌絲比較濃，培養(yǎng)工藝穩(wěn)定，達到了理想的結果。在連續(xù)3批次試驗中，種子液都在30 h左右達到30 g/L以上的鮮質量，菌絲深紅色、比較豐富黏稠、氣味正常，pH 5.0～5.5，完全滿足生產菌種的需要。

2.5 中試生產試驗結果

連續(xù)3批750 kg級別的中試試驗結果如表6。

由表6可知，紅曲米的產率都達到了40%左右；色價分別為4 898 U/g、4 992 U/g、5 088 U/g；橘霉素含量分別為37 μg/kg、42 μg/kg、35 μg/kg，均低于國家標準及國際標準的要求；色價、橘霉素含量和產率均滿足公司工程化生產的要求。在連續(xù)3批次中試試驗過程中，結合中試車間的實際情況，最終形成了穩(wěn)定的中試生產工藝，即首先將大米浸泡4 h、清洗、瀝干，裝入蒸米車，通蒸汽30 min，倒入攤涼機，通風攤涼，含水量控制在35%左右；當溫度降至35℃左右時，用接種機接種9%的液體種子；然后，將培養(yǎng)基轉入40℃的恒溫間打堆養(yǎng)花20 h；之后，將長滿紅曲霉菌的大米培養(yǎng)基轉運到發(fā)酵池中32℃培養(yǎng)8 d，通過鼓風機自動控溫和補充氧氣。培養(yǎng)過程中，每12 h翻料一次。當物料的濕度＜35%時，通過噴淋自來水為發(fā)酵物料補充水分，水分控制在35%～45%之間。收料后，在烘干池內70℃干燥，得到紅曲米。

表6 固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)中試試驗結果Table 6 Results of pilot tests of solid-state fermentation

2.6 工程化生產試驗結果

在工程化試驗中，貫通了所有生產環(huán)節(jié)，進一步優(yōu)化了每個環(huán)節(jié)的連貫性，從低到高、循序漸進地進行了100kg、400 kg及1 200 kg級別的生產試驗，同時每個級別都設置了3個平行試驗，試驗結果見表7。

表7 固態(tài)培養(yǎng)工程化生產試驗結果Table 7 Results of solid-state fermentation engineering production tests

由表7可知，連續(xù)3個等級的9個試驗中，色價都在5000U/g左右；橘霉素含量為31～42 μg/kg，低于國家標準和國際標準；產率都＞40%。在1 200 kg級別的試驗中最高色價達到5 111 U/g，且橘霉素含量僅35 μg/kg，達到較好的水平。整體來看，生產工藝比較穩(wěn)定，能夠穩(wěn)定地生產出符合標準的安全高效紅曲米，實現了高品質紅曲米的工程化生產。

3 結論

在固態(tài)發(fā)酵最佳pH的試驗中，pH6.5時，紅曲米的平均色價為4 623 U/g，平均橘霉素含量為36.28 μg/kg，色價/橘霉素含量的平均比值為127.43。菌種高產色素和低產橘霉素的能力最大，其安全高效的性能最佳，最能滿足安全高效的要求。在固態(tài)發(fā)酵最佳培養(yǎng)時間試驗中，培養(yǎng)8d時，紅曲米的平均色價為4654U/g，平均橘霉素含量僅為1.36μg/kg，效果最好。在正交試驗中，發(fā)現4因素對紅曲米的色價/橘霉素含量的比值影響大小的順序為：養(yǎng)花溫度＞培養(yǎng)溫度＞培養(yǎng)基裝量＞接種量，各因素的最優(yōu)水平組合為A3B1C3D2，即裝量500g/淺盤、培養(yǎng)溫度32℃、接種量9%和養(yǎng)花溫度40℃。

在中試制種試驗中，菌種在30 h左右達到30 g/L以上的鮮質量，菌絲深紅色、比較豐富黏稠、氣味正常，pH5.0～5.5，完全滿足生產菌種的需要。在中試生產試驗找中，紅曲米的產率都達到了40%左右，色價均在5 000 U/g左右，橘霉素含量都≤42 μg/kg，并形成了穩(wěn)定的中試生產工藝。在工程化生產試驗中，整合了生產的所有環(huán)節(jié)，形成了連貫的生產工藝，產出的紅曲米各項指標保持了中試生產的水平，均符合國家標準和國際標準。

本研究為我國安全型高效價紅曲米的大規(guī)模工程化生產提供了可借鑒的經驗，改善了紅曲米產品的品質，使紅曲米在食用色素產品中更具競爭力，希望能推動紅曲色素產業(yè)的持續(xù)發(fā)展。