微小RNA- 143/145基因多態(tài)性與冠心病危險因素及嚴重程度的相關性

陳 蕓，羅 至，曾 韡，賴飛呀，陳秋宏，呂 湛，宋永硯

川北醫(yī)學院 1附屬醫(yī)院心內(nèi)科 2臨床醫(yī)學系 3基礎醫(yī)學院生化教研室，四川南充 637000

隨著我國人口老齡化及城鎮(zhèn)化進程的加劇，心血管病發(fā)病人數(shù)持續(xù)增加。根據(jù)《中國心血管病報告2016》概要，我國心血管病現(xiàn)患人數(shù)約2.9億，心血管病死亡占城鄉(xiāng)居民總死亡原因的首位[1]。心血管病負擔日漸加重，已成為我國重要的公共衛(wèi)生問題。心血管病包括冠心病(coronary heart disease，CHD)、腦卒中和外周血管疾病等，其病理學基礎是動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)。AS主要由血漿脂質成分伴隨炎性細胞緩慢沉積于血管內(nèi)壁所致。CHD的危險因素包括高血壓、糖尿病、高脂血癥、超敏C反應蛋白(hypersensitive C-reactive protein，hs-CRP)、高尿酸血癥和高同型半胱氨酸血癥等。相關基因變異是導致CHD危險因素聚集的主要原因，除此之外，體力活動減少、高脂高熱量膳食和社會心理因素也是導致CHD危險因素增加的重要原因。微小RNA(microRNA，miR)- 143/145(miR- 143和miR- 145)基因位于人類5號染色體上，因兩個微小基因彼此靠近被認為是在同一啟動子的調控下進行轉錄的。miR- 143和miR- 145基因表達與CHD密切相關[2- 4]。Du等[3]報道早發(fā)性CHD患者血清中miR- 145水平較年齡和性別匹配的健康對照者顯著降低。在CHD患者中，Yu等[4]發(fā)現(xiàn)經(jīng)皮冠狀動脈介入治療術后再狹窄組血清中miR- 143水平較無再狹窄組顯著降低。在miR- 143/145基因的啟動子區(qū)存在兩個單核苷酸變異位點rs353292和rs4705343。幾項病例-對照研究顯示這兩個多態(tài)性位點與結腸癌[5]、宮頸癌[6]和缺血性腦卒中[7]的發(fā)生顯著相關，但這兩個位點是否也與CHD的危險因素及嚴重程度相關報道較少。本研究在我國漢族人群中，分析rs353292和rs4705343位點與CHD的危險因素及嚴重程度的相關性，為CHD的基因診斷和基因治療提供理論基礎。

對象和方法

對象選取2014年4月至2015年10月在川北醫(yī)學院附屬醫(yī)院心內(nèi)科就診或住院治療的無血緣關系的漢族人群。經(jīng)冠狀動脈造影確診為CHD的患者380例，其中男性236例，平均年齡(60.0±9.6)歲；女性144例，平均年齡(64.3±8.1)歲。經(jīng)冠狀動脈造影診斷為非CHD的對照者163例，其中男性90例，平均年齡(59.5±12.7)歲；女性73例，平均年齡(58.7±10.2)歲。

臨床資料收集通過生理生化檢查，獲得高血壓、糖尿病、體質量指數(shù)、三酰甘油(triglycerides，TG)、總膽固醇、低密度脂蛋白膽固醇(low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C)、極低密度脂蛋白膽固醇(very low-density lipoprotein cholesterol，VLDL-C)、高密度脂蛋白膽固醇(high-density lipoprotein cholesterol，HDL-C)、hs-CRP、尿酸和同型半胱氨酸等反映心血管病危險因素的指標。

CHD診斷及嚴重程度分型CHD組及對照組所有成員均接受冠狀動脈造影檢查。CHD的診斷標準：至少有1支冠狀動脈或其主要分支的管腔狹窄程度在50%以上者診斷為CHD。對照者的診斷標準：正常冠狀動脈或輕微狹窄者(小于50%狹窄)，同時排除無狀性心肌缺血、血管痙攣性心絞痛、心電圖動態(tài)或負荷試驗有ST段壓低、T波倒置等患者。由兩名經(jīng)驗豐富的心內(nèi)科醫(yī)生在對受試者病史和生理生化指標不知情的情況下行冠脈造影術。按Judkins法進行，在左冠脈系統(tǒng)設定至少4個觀測點，右冠狀動脈至少2個觀測點。冠脈造影使用荷蘭飛利浦的數(shù)字減影血管造影X線機(Allura Xper FD10)。CHD患者按嚴重程度分為心絞痛組和心肌梗死組，穩(wěn)定型心絞痛、不穩(wěn)定型心絞痛和急性心肌梗死的診斷采用中華醫(yī)學會心血管病學分會制定的相關指南[8- 10]進行。

miR-143/145基因rs353292和rs4705343多態(tài)性分型基因組DNA從外周血白細胞中提取，采用TIANGEN公司的血液基因組提取試劑盒，操作過程按試劑盒說明書進行。PCR擴增含有miR- 143/145基因rs353292和rs4705343多態(tài)性位點的DNA片段。引物序列由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。PCR反應體系為25 μl，其中DNA模板1 μl，上游和下游引物各1 μl，2×PCR TaqMix 12.5 μl，ddH2O 9.5 μl。rs353292位點的正向引物為5’-CTTTCTTCTGCCACTCCTCCT- 3’，反向引物為5’-GAAGGGCTTCAGAATTCCG- 3’；rs4705343位點的正向引物為5’-TCCATGTATTGAAATATCCAGAAAGTA- 3’，反向引物為5’-TGTGCAAACAATGGCACAAT- 3’。PCR擴增程序：95℃ 5 min；95℃ 40 s，56.5℃(rs353292)或60.0℃(rs4705343)40 s，72℃ 60 s，循環(huán)35次；72℃ 5 min。酶切反應體系(10 μl)：PCR產(chǎn)物3 μl，BslI(rs353292)或AccI(rs4705343)內(nèi)切酶1.5 U，10×NEB緩沖液1 μl，ddH2O補至10 μl。37℃酶切過夜，2.5%瓊脂糖凝膠電泳和GoldViewⅠ型核酸染色劑-紫外顯色鑒定基因型。

統(tǒng)計學處理使用SPSS 13.0軟件進行統(tǒng)計分析。連續(xù)性變量采用均數(shù)±標準差表示。不符合正態(tài)分布的計量資料(如TG)進行對數(shù)轉換后納入統(tǒng)計分析。采用χ2檢驗比較CHD患者與對照者之間、不同基因型者之間各種計數(shù)指標的差異。采用單因素方差分析(one-way ANOVA)比較CHD患者與對照者之間、不同基因型者之間各種計量指標的差異，兩兩比較用LSD法，組內(nèi)多重兩兩比較時作Bonferroni校正。采用χ2檢驗比較rs353292位點不同基因型者之間心絞痛和心肌梗死發(fā)生率的差異。通過檢驗Hardy-Weinberg平衡，評價樣本的代表性。P≤0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

臨床資料CHD組年齡(F=28.54，P<0.001)、患高血壓的比例(χ2=12.72，P<0.001)、患糖尿病的比例(χ2=4.71，P=0.03)、TG(F=7.41，P=0.01)、總膽固醇(F=4.00，P=0.05)、載脂蛋白(apolipoprotein，APO)B100(F=7.70，P<0.01)、脂蛋白(a)(F=4.29，P=0.04)、血糖(F=4.14，P=0.04)和hs-CRP(F=9.11，P<0.01)水平顯著高于對照組，HDL-C(F=8.39，P<0.01)和APO AI(F=9.76，P<0.01)水平顯著低于對照組，差異均有統(tǒng)計學意義。體質量、體質量指數(shù)、LDL-C、VLDL-C、尿酸和同型半胱氨酸水平兩組比較差異均無統(tǒng)計學意義(P均>0.05)(表1)。

基因型及等位基因分布頻率rs353292和rs4705343位于miR- 143/145基因的啟動子區(qū)，含有rs353292位點的PCR擴增片段長度為140 bp；含有rs4705343位點的PCR擴增片段長度為147 bp。rs353292位點由胞嘧啶(C)變異成胸腺嘧啶(T)生成，變異后限制酶BslI的識別序列(5’-CCNNNNN↓NNGG- 3’)和切割位點消失。在酶切后的電泳圖譜上，TT基因型僅含有140 bp的1個片段；CT基因型含有140、120和20 bp的3個片段；CC基因型含有120和20 bp的兩個片段。在電泳圖譜上，20 bp的DNA片段因太小而檢測不到(圖1A)。rs4705343位點由T變異成C生成，變異后產(chǎn)生限制酶AccI的識別序列(5’-GT↓MKAC- 3’)和切割位點。在酶切后的電泳圖譜上，TT基因型僅含有147 bp的1個片段；CT基因型含有147、121和26 bp的3個片段；CC基因型含有121和26 bp的兩個片段。在電泳圖譜上，26 bp的DNA片段因太小而檢測不到(圖1B)。miR- 143/145基因rs353292和rs4705343位點基因型及等位基因頻率在CHD組與對照組之間差異均無統(tǒng)計學意義(P均>0.05)(表2)。CHD組(χ2=27.89，P<0.05)和對照組(χ2=11.65，P<0.05)中rs353292位點基因型的分布頻率的比較顯示，變異純合子(TT)比例增高，雜合子(CT)比例減低，差異具有統(tǒng)計學意義，但尚未達到Hardy-Weinberg平衡。CHD組(χ2=47.19，P<0.05)和對照組(χ2=9.33，P<0.05)中rs4705343位點基因型的分布頻率的比較顯示，變異純合子(CC)比例減低，雜合子(CT)比例增高，差異具有統(tǒng)計學意義，但尚未達到Hardy-Weinberg平衡。

表 1 研究人群的臨床特征Table 1 Clinical characteristics of the study population

CHD：冠心??；LDL-C：低密度脂蛋白膽固醇；VLDL-C：極低密度脂蛋白膽固醇；HDL-C：高密度脂蛋白膽固醇；hs-CRP：超敏C反應蛋白

CHD： coronary heart disease；LDL-C： low-density lipoprotein cholesterol；VLDL-C： very low-density lipoprotein cholesterol；HDL-C： high-density lipoprotein cholesterol；hs-CRP： hypersensitive C-reactive protein

M：DNA分子量標記；A：rs353292位點：1、2、3、4、5和8泳道為CC基因型，7泳道為CT基因型，6泳道為TT基因型；B：rs4705343位點：2和7泳道為TT基因型，1、3、4、5和6泳道為CT基因型，8泳道為CC基因型

M： DNA marker；A： rs353292 site： lanes 1，2，3，4，5 and 8 are CC genotype，lane 7 is CT genotype，and lane 6 is TT genotype；B： rs4705343 site： lanes 2 and 7 are TT genotype，lanes 1，3，4，5 and 6 are CT genotype，and lane 8 is CC genotype

圖1含miR- 143/145 rs353292(A)和rs4705343(B)位點的DNA限制性內(nèi)切酶譜

Fig1Gel electrophoresis map of the PCR products containing the rs353292(A) and rs4705343(B) polymorphisms of miR- 143/145 after digested by restriction endonucleases

表 2 對照組及CHD組中rs353292和rs4705343位點基因型及等位基因分布頻率Table 2 The genotype and allele frequencies of the rs353292 and rs4705343 polymorphisms in the control group or CHD group

miR-143/145基因rs353292位點不同基因型之間臨床資料比較在對照組中，TT基因型者TG(F=3.00，P=0.05)和血糖水平(F=9.91，P<0.001)高于C等位基因攜帶者，差異均有統(tǒng)計學意義。在CHD組中，TT基因型者hs-CRP(F=8.43，P<0.001)水平高于C等位基因攜帶者，差異有統(tǒng)計學意義(表3)。其他指標在rs353292位點不同基因型者之間的差異無統(tǒng)計學意義(P均>0.05)。

miR-143/145基因rs4705343位點不同基因型者之間臨床資料比較在對照組中，TT基因型者患高血壓的比例高于C等位基因攜帶者(χ2=6.35，P=0.04)，差異有統(tǒng)計學意義。其他指標在rs4705343位點不同基因型者之間差異均無統(tǒng)計學意義(P均>0.05)(表4)。

miR-143/145基因rs353292位點與CHD患者嚴重程度的相關性根據(jù)嚴重程度將CHD患者分為心絞痛組和心肌梗死組。TT基因型者中的心肌梗死發(fā)生率顯著高于C等位基因攜帶者，差異有統(tǒng)計學意義(χ2=5.29，P=0.02)(圖2)。

討 論

miR- 143和miR- 145兩個微小RNA基因位于人類第5號染色體上，miR- 145基因在miR- 143基因的下游，二者彼此靠近，僅相隔1.6 kb，因此認為它們是在同一啟動子的調控下發(fā)生轉錄的，表示為miR- 143/145。rs353292和rs4705343是存在于miR- 143/145基因啟動子區(qū)的兩個單核苷酸變異位點，rs353292位點由轉錄起始點上游的第673位C變異成T生成，次要等位基因T在亞洲人中的變異率為0.16～0.34，高加索人中為0.44～0.50，非洲人中為0.09。rs4705343位點由轉錄起始點上游第400位T變異成C生成，次要等位基因C在亞洲人中的變異率為0.10～0.32，高加索人中為0.11～0.17，非洲人中為0.07(https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/snp/)。

幾項病例-對照研究結果顯示這兩個多態(tài)性位點與結腸癌、宮頸癌和顱內(nèi)動脈瘤的發(fā)病相關[5- 6，11]，但這兩個位點是否也與CHD的發(fā)病及其嚴重程度相關報道較少。本研究在CHD患者中發(fā)現(xiàn)rs353292多態(tài)性TT基因型者血清hs-CRP水平顯著高于C等位基因攜帶者，同時在TT基因型患者中心肌梗死的發(fā)生率顯著高于C等位基因攜帶者(53.3%比32.6%)，推測rs353292多態(tài)性可能是通過影響miR- 143/145的基因表達，進而影響hs-CRP的基因表達，促進心肌梗死的發(fā)生和發(fā)展。通過在線預測(http：//www.targetscan. org)，發(fā)現(xiàn)人類CRP基因的3’UTR區(qū)含有miR- 145的識別和結合位點，其中has-miR- 145- 3p可識別CRP基因下游第1773～1779 bp的核苷酸序列，has-miR- 145- 5p可識別CRP基因下游第603～609 bp、1098～1105 bp和1541～1547 bp的核苷酸序列。Yuan等[5]

表 3 miR- 143/145基因rs353292位點不同基因型者之間生理生化指標的比較Table 3 Physiological and biochemical parameters of the subjects according to the rs353292 genotypes

與CC基因型者比較，aP<0.05；與CT基因型者比較，bP<0.05

aP<0.05 compared with the subjects with the CC genotype；bP<0.05 compared with the subjects with the CT genotype

表 4 miR- 143/145基因rs4705343位點不同基因型者之間生理生化指標的比較Table 4 Physiological and biochemical parameters of the subjects according to the rs4705343 genotypes

與TT基因型者比較，aP=0.01

aP=0.01 compared with the subjects with the TT genotype

與C等位基因攜帶者比較，aχ2=5.29，aP=0.02

aχ2=5.29，aP=0.02 compared with C allele carriers

圖2miR- 143/145基因rs353292位點不同基因型者中心絞痛及心肌梗死的發(fā)生率

Fig2Frequencies of angina pectoris or myocardial infarction in the genotype groups of the rs353292 polymorphism of the miR- 143/145 gene

采用雙熒光素酶報告基因分析法發(fā)現(xiàn)rs353292多態(tài)性T等位基因對miR- 143/145基因的表達具有抑制作用。結合本研究結果推測，rs353292多態(tài)性T等位基因可能通過抑制miR- 145基因的表達，從而削弱miR- 145對CRP基因的抑制效應，導致CRP基因表達增強，血清hs-CRP水平升高，進而影響心肌梗死的發(fā)生和發(fā)展。然而，本研究在對照組中未觀察到TT基因型者血清hs-CRP水平顯著高于C等位基因攜帶者，可能原因之一是miRNA對靶基因的調控存在共調控網(wǎng)絡，即一個miRNA 分子可能對上百個靶基因進行調控，而一個靶基因也可能被眾多的miRNA同時調控[12]。在CHD患者中，miR- 145與其他miRNA共同作用于CRP基因，使其表達增強；而在對照組中，雖然miR- 145表達也增強，但其他miRNA的種類和數(shù)量的構成不同于CHD患者，因此對CRP基因的調控模式也不相同。

大量研究資料表明，AS并不是簡單的脂質沉積過程，炎癥反應和抗氧化失衡在AS的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用。CRP是由肝細胞合成的一種相對分子質量約為115 000的血清β球蛋白。臨床上通過高靈敏度方法檢測出來的血液微量CRP，稱為hs-CRP。hs-CRP是CHD的危險因素[13- 14]，其主要通過以下幾種機制在AS的形成、發(fā)展中發(fā)揮作用：(1)抑制主動脈內(nèi)皮細胞一氧化氮合酶的活性，減少一氧化氮的釋放[15]。一氧化氮可擴張血管，并有抗氧化作用，減緩動脈硬化進程；(2)促進單核細胞趨化因子- 1、血管細胞黏附分子- 1和細胞間黏附分子- 1的分泌[16- 17]。單核細胞趨化蛋白- 1、血管細胞黏附分子- 1和細胞間黏附分子- 1可募集循環(huán)血單核細胞并發(fā)生黏附，加速AS進程；(3)促進巨噬細胞攝取氧化型低密度脂蛋白，形成泡沫細胞[18]。

本研究雖然在對照組中rs353292多態(tài)性與TG和血糖水平顯著相關，但其基因型及等位基因頻率在對照組與CHD組之間無差異。2013美國心臟病學會/美國心臟協(xié)會治療血膽固醇降低成人動脈粥樣硬化性心血管疾病風險指南[19]和美國國家膽固醇教育計劃成人治療組第3次指南[20]均將LDL-C作為心血管病第一干預和治療目標，其他指標作為補充指標。TG和血糖水平與心血管病有一定的關聯(lián)性，但直接沉積于血管壁，形成粥樣斑塊的脂質成分主要是膽固醇。盡管有報道rs4705343位點與宮頸癌[6]和顱內(nèi)動脈瘤[11]顯著相關，但本研究未觀察到該位點與心血管病危險因素、CHD發(fā)病以及嚴重程度相關聯(lián)，rs4705343位點與CHD的關系有待進一步探討。

在對研究群體的Hardy-Weinberg平衡檢驗中，rs353292和rs4705343位點基因型頻率在對照組和CHD組中的分布均不符合Hardy-Weinberg平衡，可能是因為本研究的對照組和CHD組均不是來源于隨機抽樣群體。對照組成員實際上是前往就診的疑似冠心病患者，然后行冠狀動脈造影術，但其冠脈狹窄程度沒有達到冠心病的診斷標準，即至少1支冠狀動脈或主要分支的管腔狹窄程度在50%以上。在對照組中，55%的參試者冠脈正常，34%的參試者有AS，11%的參試者有輕微的冠脈狹窄(<50%)。

綜上，在我國漢族人群中，miR- 143/145基因rs353292多態(tài)性在非CHD對照者中與血漿TG和血糖水平升高相關聯(lián)，在CHD患者中與血清hs-CRP水平升高和心肌梗死風險增加相關聯(lián)。miR- 143/145基因rs4705343位點在非CHD對照者中可能與高血壓發(fā)病相關聯(lián)，但與CHD的發(fā)生和發(fā)展無相關性。