基質(zhì)金屬蛋白酶9和頸動脈內(nèi)膜剝脫術(shù)中微栓子脫落的相關(guān)性

吳立飛，來志超，李天佳，王子軍，邵 磊，劉 暴

1北京市房山區(qū)第一醫(yī)院心血管外科，北京 1024002中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)院血管外科，北京 100730

頸動脈內(nèi)膜剝脫術(shù)(carotid endarterectomy，CEA)已被證實能有效治療頸動脈狹窄和預(yù)防腦卒中的發(fā)生，但CEA本身可引起嚴重的術(shù)后并發(fā)癥卒中和死亡，2017年1篇Meta分析中，3064例CEA患者中有100例出現(xiàn)圍手術(shù)期卒中或死亡事件，其發(fā)生率為3.3%[1]。而CEA術(shù)中由于動脈粥樣硬化斑塊自發(fā)性破裂或手術(shù)操作不當(dāng)致微栓子脫落所導(dǎo)致的腦缺血性損傷是引起CEA術(shù)后卒中和死亡的主要原因之一。另外，微栓子脫落造成的局部腦組織灌注不足還可引起認知功能下降等亞臨床癥狀[2]。目前，對于CEA術(shù)后出現(xiàn)的腦缺血性損傷，缺乏快速有效的診斷方法，臨床上也需要有效的預(yù)警方法以便早期發(fā)現(xiàn)CEA相關(guān)的腦缺血性損傷?；|(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMP)- 9是一種鋅和鈣依賴的內(nèi)肽酶，可降解膠原Ⅳ和膠原Ⅴ，在胚胎發(fā)育、細胞復(fù)制、組織重建中發(fā)揮分解細胞外基質(zhì)作用，MMP- 9同樣參與炎癥和腫瘤轉(zhuǎn)移等病理活動，尤其與炎癥反應(yīng)關(guān)系密切。有研究表明，MMP- 9在卒中發(fā)生后表達升高[3- 5]，其可能是腦缺血性損傷的一種有效生化標志物。CEA圍手術(shù)期腦缺血性事件的發(fā)生同卒中發(fā)生有共同的機制，但目前尚無研究對MMP- 9在CEA圍手術(shù)期的動態(tài)表達以及MMP- 9和 CEA術(shù)后腦缺血性損傷的關(guān)系做相關(guān)探討。因此，本研究前瞻性探討MMP- 9在CEA患者中的表達變化情況及其臨床預(yù)警作用。

對象和方法

對象選取2012年2至9月在北京協(xié)和醫(yī)院血管外科行CEA治療的頸動脈狹窄患者。納入標準：同意參與本研究并簽署知情同意書；年齡40～80歲；術(shù)側(cè)頸動脈狹窄≥70%；術(shù)前60 d內(nèi)未發(fā)生腦血管事件；經(jīng)顱多普勒超聲(transcranial doppler，TCD)監(jiān)測存在顳窗；術(shù)前已行頸動脈CT血管造影證實狹窄程度。排除標準：拒絕簽署知情同意書；無顳窗，不能在CEA術(shù)中監(jiān)測微栓子脫落情況；頸動脈支架置入術(shù)后再狹窄；非動脈粥樣硬化性頸動脈狹窄，如大動脈炎、纖維肌性發(fā)育不良；對抗血小板和他汀類藥物過敏。

臨床資料共納入40例患者，收集患者的一般情況、病史等資料，包括年齡、性別、高血壓、糖尿病、冠心病、高脂血癥、短暫腦缺血發(fā)作(transient ischemia attacks，TIA)發(fā)作史、卒中發(fā)作史等。根據(jù)術(shù)中TCD監(jiān)測，8例術(shù)中監(jiān)測到微栓子脫落者納入栓子組，32例未監(jiān)測到微栓子脫落者納入無栓子組。

手術(shù)步驟所有CEA均在全麻下進行，并以TCD持續(xù)監(jiān)測術(shù)側(cè)微栓子脫落情況。頸動脈完全暴露后，普通肝素80～100 IU/kg入壺。另外，在頸動脈夾閉之前，在入室血壓的基礎(chǔ)上將血壓提升20%，以提高對側(cè)頸動脈的代償作用，保證患側(cè)頸動脈夾閉期間腦組織血供。根據(jù)術(shù)中情況，16例采用經(jīng)典CEA術(shù)式，即縱行切開頸總動脈及頸內(nèi)動脈進行斑塊剝除，其中2例使用轉(zhuǎn)流管；24例采用翻轉(zhuǎn)式CEA術(shù)式，即環(huán)形切開頸內(nèi)動脈起始部進行斑塊剝除。

血清檢測在CEA術(shù)前(入室后，麻醉開始前)、頸動脈開放前、開放后30 min、術(shù)后12 h分別采集大隱靜脈血5 ml，均使用促凝管。采集成功后室溫靜置1 h，613 ×g 離心10 min，抽取上清并分裝至離心管，分裝完成后立即置于-80℃冰箱保存并避免反復(fù)凍融。血清MMP- 9濃度使用酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)進行檢測，ELISA試劑盒(Beijing 4A Biotech Co. Ltd.，Beijing)所有樣本均設(shè)3個復(fù)孔，試劑盒檢測靈敏度為30 pg/ml，板間及板內(nèi)檢測變異系數(shù)均<10%。血清MMP- 9活性使用明膠酶譜試劑盒進行檢測(Life Technologies，USA)，以MMP- 2為內(nèi)參，上樣量為未經(jīng)稀釋血清1 μl/孔。MMP- 9濃度及活性檢測均嚴格按照試劑盒說明書進行。

統(tǒng)計學(xué)處理應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析，定量變量采用均數(shù)±標準差表示，兩組之間定量資料比較使用t檢驗，定性資料采用χ2檢驗或Fisher’s精確檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

一般情況共納入40例患者，栓子組8例(共監(jiān)測到27個微栓子脫落，均在夾閉頸動脈期間出現(xiàn))，非栓子組32例，兩組患者在年齡、性別、糖尿病、高血壓、冠心病、高脂血癥、TIA發(fā)作史、卒中發(fā)作史、術(shù)式方面差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05)(表1)。至術(shù)后30 d，所有患者均未出現(xiàn)術(shù)后卒中或TIA發(fā)作。

血清檢測CEA術(shù)前、開放前、開放后30 min、術(shù)后12 h 4個時間點MMP- 9濃度分別為(367.44±182.15) ng/ml、(213.69±169.42) ng/ml、(254.51±207.65) ng/ml、(559.05±336.94) ng/ml。在術(shù)前、開放前、開放后30 min 3個時間點，MMP- 9在無栓子組和栓子組差異無統(tǒng)計學(xué)意義。而術(shù)后12 h，MMP- 9在栓子組的濃度顯著高于無栓子組(t=-3.741，P=0.001)(表2)。在無栓子組，術(shù)前、術(shù)后12 h MMP- 9的血清濃度差異無統(tǒng)計學(xué)意義(t=-1.643，P=0.081)；而在栓子組，術(shù)后MMP- 9的血清濃度較術(shù)前明顯升高(t=4.132，P=0.001)。

此外，所有血清標本均使用明膠酶譜法對MMP- 9活性進行檢測，檢測結(jié)果同ELISA結(jié)果一致，在無栓子組，術(shù)前和術(shù)后12 h MMP- 9活性無變化，而在栓子組，MMP- 9活性在術(shù)后12 h明顯升高(圖1)。

表 1 兩組一般資料比較Table 1 Comparisons of the general information between two groups

TIA：短暫腦缺血發(fā)作；CEA：頸動脈內(nèi)膜剝脫術(shù)

TIA：transient ischemia attacks；CEA：carotid endarterectomy

表 2 兩組不同時間點患者MMP- 9濃度比較(-±s，ng/ml)Table 2 Comparisons of the MMP- 9 concentration at different time points between two groups(-±s，ng/ml)

MMP:基質(zhì)金屬蛋白酶；和術(shù)前比較，at=4.132，aP=0.001

MMP：matrix metalloproteinases;at=4.132，aP=0.001 compared with preoperative

Emboli(-)：無栓子組；Emboli(+)：栓子組；Pre-op：術(shù)前；12 h Post-op：術(shù)后12 h

Emboli(-)：embolic-negative group；Emboli(+)：embolic-positive group；Pre-op：preoperative；12 h Post-op：12 hours post-operative

圖1栓子組和無栓子組術(shù)前和術(shù)后12 h MMP- 9活性

Fig1Preoperative and 12 hours postoperative MMP- 9 activity in the embolic-positive group and the embolic-negative group

討 論

動脈粥樣硬化斑塊由膽固醇結(jié)晶、鈣化灶、脂質(zhì)核以及纖維帽等構(gòu)成，在CEA手術(shù)過程中，可由于斑塊自發(fā)性破裂或手術(shù)操作原因而發(fā)生微栓子脫落，引起顱內(nèi)動脈栓塞和腦組織局部灌注不足，導(dǎo)致CEA相關(guān)的腦缺血性損傷，包括無癥狀腦梗灶、卒中甚至死亡事件的發(fā)生。有研究顯示近期發(fā)生卒中或TIA的患者中，有25%的患者監(jiān)測到自發(fā)性微栓子脫落，這部分患者中又有23%的患者再次發(fā)生卒中或TIA，證實微栓子脫落同腦缺血性損傷關(guān)系密切[6]。不過，目前對于CEA圍手術(shù)期腦缺血性損傷的診斷主要依據(jù)臨床癥狀和影像學(xué)檢查，如CT和磁共振成像，但這些影像學(xué)檢查并不能在早期有效地發(fā)現(xiàn)腦缺血性損傷，盡管有研究顯示CT可在急性腦梗死發(fā)病6 h內(nèi)發(fā)現(xiàn)腦組織中缺血半暗帶，但其技術(shù)相對復(fù)雜且難以普遍應(yīng)用[7]。對于未導(dǎo)致明顯臨床癥狀的微栓子脫落，更是只能通過術(shù)中TCD監(jiān)測發(fā)現(xiàn)。因此，臨床上迫切需要能對CEA術(shù)后腦缺血性損傷進行及時和準確診斷的方法，為術(shù)后治療方案制定及護理級別選擇提供依據(jù)。

MMP- 9是一種鋅離子依賴蛋白酶，它在細胞外基質(zhì)的降解中發(fā)揮關(guān)鍵作用[8]。臨床和動物實驗表明，卒中發(fā)生后MMP- 9表達升高[3- 5]，而MMP- 9抑制劑則可降低腦缺血性損傷的程度和范圍[4]，提示MMP- 9可能是腦缺血性損傷的一種生化標志物。然而，在CEA圍手術(shù)期，并不了解MMP- 9的動態(tài)表達情況，以及MMP- 9變化同 CEA相關(guān)性腦缺血性損傷的關(guān)系。本研究觀察CEA圍手術(shù)期MMP- 9動態(tài)變化及其同大腦中動脈血流速度變化、微栓子脫落的關(guān)系，探索MMP- 9在預(yù)警CEA圍手術(shù)期腦缺血性損傷中的作用。本研究顯示在CEA術(shù)中監(jiān)測到微栓子脫落的情況下，MMP- 9表達在CEA術(shù)后12 h明顯高于術(shù)前，而在無微栓子脫落情況下，術(shù)后12 h的MMP- 9表達同術(shù)前相比無變化。另外，通過ELISA和明膠酶譜法分別對MMP- 9濃度和活性進行檢測，得到了完全一致的結(jié)果，保證了結(jié)果的可靠性。

本研究MMP- 9濃度在開放前和開放后30 min相較于術(shù)前出現(xiàn)了明顯降低。如前所述，本研究所有患者均使用了丙泊酚和七氟醚進行麻醉誘導(dǎo)和麻醉維持，臨床研究已證實，丙泊酚和七氟醚可抑制MMP- 9表達，且在全身麻醉過程中具有腦保護作用[9- 12]。因此，筆者考慮術(shù)中MMP- 9濃度降低同丙泊酚、七氟醚等應(yīng)用有關(guān)。由于麻醉藥品種類及劑量、麻醉時間在不同患者存在差異，本研究未能就MMP- 9表達與麻醉藥品的相關(guān)性進行探討。

MMP- 9可有效降解細胞外基質(zhì)如Ⅳ型膠原[8]，這決定了其在降低斑塊穩(wěn)定性及血腦屏障破壞方面可發(fā)揮關(guān)鍵作用[3，13- 15]。2017年Zhong等[5]研究顯示，在3186例急性卒中患者中，MMP- 9升高同急性卒中發(fā)生后3個月內(nèi)的死亡、致殘率相關(guān)，提示MMP- 9在腦缺血性損傷中發(fā)揮重要作用，并且和預(yù)后相關(guān)。在動物實驗中，發(fā)現(xiàn)MMP- 9在大鼠大腦中動脈阻塞后4 h即出現(xiàn)升高，并且和血腦屏障破壞緊密相關(guān)[3]，臨床實驗方面，Montaner等[16]對110例卒中發(fā)生后12 h內(nèi)入院的患者進行研究，發(fā)現(xiàn)卒中患者血漿MMP- 9表達明顯高于對照組，并且和卒中后腦梗死體積相關(guān)，提示MMP- 9于卒中后早期即可出現(xiàn)。MMP- 9在腦缺血性損傷早期即可出現(xiàn)，且同腦缺血性損傷嚴重程度以及預(yù)后相關(guān)，因而可能是腦缺血性損傷一種有效的生化標志物。Turner 和Sharp[17]根據(jù)以往多項研究提出假說，MMP- 9在卒中發(fā)生后12～48 h由腦缺血灶內(nèi)中性粒細胞和小膠質(zhì)細胞分泌，并且是早期血腦屏障破壞的重要原因，但MMP- 9在隨后的腦組織修復(fù)和重塑中同樣發(fā)揮重要作用，因而，通過調(diào)節(jié)MMP- 9及其抑制劑水平有可能是未來治療卒中的一個重要方向。

此前，Molloy等[18]研究顯示MMP- 9 在CEA術(shù)后48 h出現(xiàn)升高且同術(shù)中微栓子脫落有關(guān)，提出術(shù)后48 h MMP- 9表達升高同微栓子脫落造成的腦損傷有關(guān)。不足的是，其研究未能對CEA圍手術(shù)期MMP- 9的活性變化和升高時間進行說明，而本研究證實MMP- 9表達可于CEA術(shù)后12 h內(nèi)升高，且同術(shù)中微栓子脫落有關(guān)，證實MMP- 9有早期發(fā)現(xiàn)CEA術(shù)后微栓子相關(guān)性腦缺血性損傷的作用。

綜上，本研究顯示CEA術(shù)中微栓子脫落可導(dǎo)致術(shù)后12 h MMP- 9升高，因而MMP- 9可能對于隱匿性卒中具有一定的提示作用，對于出現(xiàn)術(shù)后MMP- 9升高的患者，可對其進行更為嚴密的術(shù)后觀察和更為完善的術(shù)后檢查。