4型禽腺病毒抗體間接hexon-ELISA檢測方法的建立

朱慶賀，張鵬宇，崔紅玉，王觀悅，王 爽，陳 曦，劉力威，史同瑞*

(1. 黑龍江省獸醫(yī)科學(xué)研究所，黑龍江齊齊哈爾 161006;2. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所獸醫(yī)生物技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室禽傳染病研究室，哈爾濱 150000)

4型禽腺病毒(Fowl Avianadenovirus serotype 4，F(xiàn)AdV-4)屬于Ⅰ群禽腺病毒，能夠引起雞心包積水綜合征[1]。該病最早在巴基斯坦的安卡拉首先被報道，因此又稱安卡拉病[2-3]。近幾年來，我國多個省份相繼出現(xiàn)爆發(fā)，給養(yǎng)雞業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[4-6]。由于發(fā)病時雞出現(xiàn)明顯的心包積液癥狀[7-8]，因此該病的臨床診斷主要以剖檢為主，實(shí)驗(yàn)室診斷主要以病毒分離、PCR檢測為主，也有利用瓊脂擴(kuò)散進(jìn)行檢測的報道[9-10]。不過以上診斷方法都存在一定的缺點(diǎn)，例如，病毒分離難度大，PCR方法批量檢測樣品工作量大，而瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)靈敏度較差等。因此有必要建立一種高效省時且靈敏度高的檢測方法，能更好的對該病進(jìn)行血清學(xué)檢測以及血清抗體監(jiān)測。

腺病毒粒子中的六鄰體(hexon)是主要的衣殼蛋白，全長約2811 bp，帶有主要的屬和亞屬特異性抗原決定簇及次要的種特異性抗原決定簇。研究表明，hexon中幾個比較大的抗原表位區(qū)都位于前段和中段，這一區(qū)域恰好位于病毒的表面，暴露性好，后段雖然也有較好的抗原性，但暴露性較差[11]。因此在試驗(yàn)中截短表達(dá)了hexon蛋白的前、中段進(jìn)行原核表達(dá)，并應(yīng)用于ELISA方法的建立。

1 材料與方法

1.1 血清及臨床樣品 病雞心臟、肝臟組織樣品、血清樣品均收集自黑龍江省齊齊哈爾市甘南縣肉雞養(yǎng)殖場。FAdV-4陽性雞血清由哈爾濱獸醫(yī)研究所禽傳染病研究室惠贈，禽流感5、7、9型(Avian Influenza Virus, AIV-5、AIV-7、AIV-9)陽性雞血清、新城疫(Newcastle Disease Virus, NDV)陽性雞血清、傳染性支氣管炎(Infection Bronchitis Virus, IBV)陽性雞血清由黑龍江省獸醫(yī)科學(xué)研究所病毒研究室惠贈。FAdV-4陰性血清為SPF雛雞血清，SPF雞胚購自哈爾濱維科生物技術(shù)開發(fā)公司。

1.2 主要實(shí)驗(yàn)試劑 pET-28a載體購自大連寶生物工程有限公司，Taq DNA聚合酶、限制性內(nèi)切酶EcoR Ⅰ/XhoⅠ、T4連接酶、DNA Marker購自TaKaRa公司；HRP標(biāo)記兔抗雞IgG購自北京百奧萊博科技有限公司；增強(qiáng)型HRP-DAB底物顯色試劑盒、可溶性TMB底物顯色液購自天根生物科技有限公司；PVDF膜購自密理博中國有限公司。

1.3 hexon蛋白克隆、表達(dá)及純化 利用已發(fā)表的Kr-yeoju株hexon序列(登錄號：HQ709228.1)設(shè)計(jì)引物，并添加EcoRⅠ/XhoⅠ為酶切位點(diǎn)。引物序列為：F:5'-GGAATTCCCCACCCGAAATGTCA￣CGAC-3'；R:5'-CCGCTCGAGGGCGGTGTTGTTGGTGTAGAG-3'，擴(kuò)增長度為1032 bp基因片段，連接pET-28a載體，命名為pET-28a-hexon，測序正確的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至EscherichiacoliBL21(DE3)。0.8 mmol/L IPTG 37 ℃條件下6 h誘導(dǎo)重組菌，同時設(shè)立未誘導(dǎo)陰性對照。離心收集菌體進(jìn)行超聲破碎，12% SDS-PAGE電泳分析表達(dá)蛋白并切膠純化。

1.4 Western blot分析 純化的蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳后半干轉(zhuǎn)印至PVDF膜，以 1︰100稀釋的FAdV-4雞陽性血清以及FAdV-4雞陰性血清為一抗，以 1︰5000稀釋的兔抗雞IgG-HRP為二抗，進(jìn)行Western blot分析。

1.5 間接ELISA方法的建立

1.5.1 間接ELISA反應(yīng)條件的優(yōu)化 以37 ℃ 1 h、37 ℃ 2 h和4 ℃過夜三種不同條件包被純化的FAdV-4重組hexon蛋白，確定最佳包被條件；利用方陣滴定法對FAdV-4重組hexon蛋白的工作濃度和FAdV-4雞陽性血清的稀釋濃度進(jìn)行了確定。以不同濃度脫脂乳封閉，確定最佳的封閉液濃度以及封閉時間。確定血清和HRP標(biāo)記二抗最佳工作時間，確定底物作用時間。判定標(biāo)準(zhǔn)為：陽性血清(Positive serum，P)與陰性血清(Negative serum，N)OD450nm的P/N值高且P值≈1為原則將所選條件確定為ELISA反應(yīng)的最佳反應(yīng)條件。

1.5.3 特異性實(shí)驗(yàn) 在相同條件下對其他雞幾種常見病毒，如AIV-5、AIV-7、AIV-9、NDV、IBV陽性血清進(jìn)行檢測，同時設(shè)FAdV-4陰、陽性血清對照。

1.5.4 臨床血清樣本的檢測 于黑龍江省齊齊哈爾市甘南縣肉雞養(yǎng)殖場采集并保存的21份臨床血清樣本通過建立的ELISA方法進(jìn)行檢測。

1.5.5 符合率試驗(yàn) 21份臨床血清樣對應(yīng)的組織樣品提取基因組后進(jìn)行PCR檢測，檢測結(jié)果與ELISA 檢測結(jié)果比較分析。

2 結(jié) 果

2.1 hexon基因擴(kuò)增結(jié)果 在出現(xiàn)心包積液癥狀的雞肝臟組織中擴(kuò)增hexon基因，經(jīng)1%瓊脂糖核酸電泳分析，結(jié)果顯示，擴(kuò)增基因大小約為1032 bp(圖1)。擴(kuò)增基因連接載體后測序，結(jié)果顯示為FAdV-4基因。

M: DL2000 DNA Marker; 1: hexon截短基因M: DL2000 DNA Marker；1: hexon-truncated gene圖1 hexon截短基因擴(kuò)增結(jié)果Fig 1 PCR amplification of hexon gene

2.2 hexon蛋白的表達(dá)與純化 IPTG 誘導(dǎo)后，表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE分析，表達(dá)蛋白約為46 ku(圖2)。

2.3 重組hexon蛋白Western blot驗(yàn)證 純化蛋白進(jìn)行Western blot鑒定，結(jié)果顯示純化的hexon蛋白能夠與FAdV-4陽性血清結(jié)合，而與陰性血清無反應(yīng)(圖3)。

2.4 間接ELISA的建立及反應(yīng)條件的確定 按照常規(guī)ELISA方法建立檢測抗FAdV-4血清抗體的間接ELISA，對各反應(yīng)條件進(jìn)行了篩選和優(yōu)化，結(jié)果如表1所示。

M：Protein Marker；1：純化蛋白；2：誘導(dǎo)表達(dá)重組hexon蛋白細(xì)菌；3：未誘導(dǎo)表達(dá)細(xì)菌對照M：Protein Marker; 1：The purification of recombinant hexon protein;2：Lysed hexon-containing bacterial inclusion bodies; 3:Non-induced crude bacterial lysate from bacteria containing hexon plasmid圖2 SDS-PAGE分析Fig 2 SDS-PAGE analysis

M：Protein Marker；1：純化hexon重組蛋白;2：陰性血清對照M：Protein Marker; 1: The purification of recombinant hexon protein; 2: Negative serum control圖3 Western blot鑒定結(jié)果Fig 3 Western blot analysis

篩選條件Filter condition重組hexon蛋白hexon protein封閉液Blocking solution待檢血清Sample兔抗雞-HRPRabbit Anti-Chicken Antibody-HRP顯色底物Chromogenic substrate最佳稀釋濃度Optimized dilutions1 ug/mL5%脫脂乳1︰1001︰5000 /反應(yīng)條件Reaction condition4℃/12 h37℃/1 h37℃/1 h1 h15 min

"/"顯色底物為商品化購買不需要稀釋，直接加入至ELISA板中即可

2.6 特異性試驗(yàn) 利用建立的間接ELISA方法對FAdV-4、NDV、AIV-5、 AIV-7、AIV-9、IBV陽性血清進(jìn)行檢測，同時設(shè)陰性對照(Negative Control，NC)，結(jié)果表明：重組hexon蛋白與FAdV-4陽性血清特異性結(jié)合，與NDV、AIV-5、 AIV-7、AIV-9、IBV陽性血清均沒有交叉反應(yīng)(圖5)

2.7 符合率試驗(yàn) 采用建立的間接ELISA檢測方法，檢測臨床中21份雞血清樣品，其中15份為FAdV-4抗體陽性，而PCR結(jié)果顯示18份樣品呈陽性，兩種方法陽性符合率為83.33%。結(jié)果表明，建立的ELISA方法和PCR方法符合率較好，可用于臨床雞血清樣品的抗體檢測。

圖4 陰性樣品結(jié)果分布圖Fig 4 Negative samples normal distribution diagram

圖5 ELISA 特異性試驗(yàn)Fig 5 Specific Detection of ELISA

檢測方法Detection method陽性樣本數(shù)Positive陰性樣本數(shù)Negative總樣本數(shù)Total陽性樣本符合率ConcordanceELISA15621PCR1832183.33

3 討論與小結(jié)

多數(shù)學(xué)者以Ⅰ群禽腺病毒代表株CELO株hexon蛋白作為包被抗原[12]，由于不同血清型hexon蛋白推導(dǎo)的氨基酸同源性差異較大，同源性的差異很可能會影響重組蛋白的抗原性。鑒于此，建立了以FAdV-4的基因組為DNA模板擴(kuò)增并表達(dá)的hexon蛋白為包被抗原的ELISA檢測方法，對于FAdV-4的血清學(xué)鑒定可能更有針對性，更適于臨床出現(xiàn)心包積液癥狀病雞的血清學(xué)診斷，但兩種蛋白包被抗原對于FAdV-4的檢測靈敏性是否具有差異仍需進(jìn)一步研究驗(yàn)證。

目前，F(xiàn)AdV-4的實(shí)驗(yàn)室診斷仍然以PCR為主，ELISA方法的建立為該病的診斷提供了血清學(xué)方法。除作為診斷手段，ELISA也可以作為監(jiān)測抗體效價的有效方法，黑龍江省獸醫(yī)科學(xué)研究所獸藥研究室在進(jìn)行雞心包積水綜合征卵黃抗體的制備過程中血清抗體監(jiān)測就是由建立的ELISA方法完成，抗體含量檢測準(zhǔn)確，相比較瓊脂擴(kuò)散方法靈敏度高，效果更好。