n?3多不飽和脂肪酸對(duì)SKH?1小鼠皮膚急性光損傷模型的保護(hù)作用研究

徐雨婷 王佩茹 韓佳彤 王秀麗

200443上海，安徽醫(yī)科大學(xué)上海皮膚病臨床學(xué)院（徐雨婷）；上海市皮膚病醫(yī)院同濟(jì)大學(xué)醫(yī)學(xué)院光醫(yī)學(xué)研究所（王佩茹、韓佳彤、王秀麗）

紫外線照射可引起急性光損傷、光敏性皮膚病、免疫抑制、慢性光老化等［1?2］。膳食中n?3、n?6多不飽和脂肪酸（PUFA）是人體必需脂肪酸，其中n?3 PUFA在心血管系統(tǒng)、結(jié)腸腫瘤防治方面發(fā)揮保護(hù)作用［3］。白種人n?3 PUFA攝入和皮膚光老化呈負(fù)相關(guān)［4］。既往研究表明，膳食補(bǔ)充n?3 PUFA可減少炎癥介質(zhì)白細(xì)胞介素1β（IL?1β）、IL?6、腫瘤壞死因子α（TNF?α）等的產(chǎn)生，從而減輕炎癥反應(yīng)，調(diào)節(jié)免疫功能［5］。但是，膳食補(bǔ)充n?3 PUFA是否可以減輕紫外線引起的光損傷以及具體劑量尚不清楚。我們?cè)谧贤饩€誘導(dǎo)的SKH?1無(wú)毛小鼠急性光損傷模型上，評(píng)估n?3 PUFA攝入對(duì)皮膚光損傷的防護(hù)作用，確定有效劑量，初步探索作用機(jī)制。

材料與方法

一、主要儀器和試劑

SS?03AB型日光紫外線模擬器（UVA∶UVB=9∶1，上海希格瑪高技術(shù)有限公司），兔抗鼠IL?1β、TNF?α多克隆抗體（英國(guó)abcam公司），兔抗鼠IL?6多克隆抗體（美國(guó)Proteintech公司），IL?1β、IL?6、TNF?α DuosetELISA試劑盒（美國(guó)R&D systems公司），Heine手持式皮膚鏡（Delta20，德國(guó)漢尼光學(xué)儀器公司）。

二、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及處理

自美國(guó)JAKSON實(shí)驗(yàn)室引進(jìn)5～6周齡健康雄性SKH?1無(wú)毛小鼠［實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK（滬）2015?0002］，體重25 g左右，上海市公共衛(wèi)生中心動(dòng)物中心負(fù)責(zé)繁育飼養(yǎng)于清潔級(jí)動(dòng)物飼養(yǎng)室內(nèi)，室溫20～24℃。根據(jù)文獻(xiàn)［6?7］，采用SS?03AB型日光紫外線模擬器在小鼠背部照射，最終確定小鼠背部皮膚紫外線最小紅斑量（minimalerythema dose，MED）為500mJ/cm2。

將50只小鼠隨機(jī)分為5組，每組10只。定制5種飼料（美國(guó)Dyets公司），n?3 PUFA占總脂肪酸的比例分別為0（對(duì)照組）、12.5%、25%、50%、100%，其余營(yíng)養(yǎng)成分與正常實(shí)驗(yàn)小鼠飼料相同，分別喂養(yǎng)5組小鼠。喂養(yǎng)至第50天，用4mm環(huán)鉆鉆取小鼠背部皮膚組織2塊，其中1塊放入4%甲醛溶液中固定，制作組織病理切片并行免疫組化檢查；另1塊組織用于制備組織勻漿檢測(cè)細(xì)胞因子。所有實(shí)驗(yàn)小鼠接受單次照射，劑量為2MED。

紫外線照射后24 h觀察小鼠皮膚變化情況，留存大體照片和皮膚鏡照片，并用4mm環(huán)鉆取背部皮膚組織2塊，保存及后續(xù)實(shí)驗(yàn)同照光前。

三、HE染色和曬傷細(xì)胞計(jì)數(shù)

組織標(biāo)本HE染色，光鏡下觀察組織病理改變。兩名未參與本實(shí)驗(yàn)的醫(yī)生在100倍視野下于每張切片上隨機(jī)選取10個(gè)不重疊視野，計(jì)數(shù)曬傷細(xì)胞（細(xì)胞體積變小、核固縮）［8］，計(jì)算每視野下曬傷細(xì)胞均值。

四、免疫組化SP法檢測(cè)IL?1β、IL?6、TNF?α表達(dá)

小鼠皮膚組織石蠟切片用兔抗鼠IL?1β、TNF?α、IL?6抗體行免疫組化SP法染色。用Image J圖像分析系統(tǒng)計(jì)算陽(yáng)性表達(dá)（棕黃色染色區(qū)域）面積百分比。陰性對(duì)照用0.1mmol/L磷酸鹽緩沖液代替一抗染色。

五、ELISA檢測(cè)組織中IL?1β、IL?6、TNF?α含量

將組織勻漿低溫離心（12 000 r/min，離心半徑2 cm）15min，提取上清液100 μl，測(cè)定IL?1β、IL?6、TNF?α含量，操作方法參照相關(guān)試劑盒說(shuō)明書(shū)。

六、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

結(jié) 果

一、大體及皮膚鏡觀察結(jié)果

大體觀察結(jié)果見(jiàn)圖1。照光前小鼠皮膚正常，色澤均勻，未見(jiàn)任何損傷。紫外線照射后24 h，對(duì)照組、12.5%n?3 PUFA組小鼠背部出現(xiàn)紅斑、明顯水腫、脫屑、抓痕等曬傷反應(yīng)；25%、50%n?3 PUFA組小鼠僅發(fā)現(xiàn)輕微紅腫，無(wú)脫屑及搔抓痕跡；100%n?3 PUFA組的小鼠皮膚紅腫不明顯。皮膚鏡觀察顯示，照光前小鼠皮膚可見(jiàn)皮紋、毛發(fā)、血管等正常結(jié)構(gòu)，無(wú)特殊改變；紫外線照射后24 h，對(duì)照組小鼠皮膚可見(jiàn)明顯抓痕、大量鱗屑；12.5%n?3 PUFA組小鼠皮膚可見(jiàn)輕微抓痕；其他組小鼠皮膚均未見(jiàn)抓痕、鱗屑。

二、組織學(xué)觀察結(jié)果

見(jiàn)圖2。照光前小鼠皮膚組織結(jié)構(gòu)完整，表皮、真皮及皮下組織層次清晰，表皮厚薄均勻。紫外線照射后24 h，對(duì)照組、12.5%n?3 PUFA組小鼠表皮厚薄不均，細(xì)胞間水腫，炎細(xì)胞聚集，可見(jiàn)大量曬傷細(xì)胞；25%、50%n?3 PUFA組小鼠僅見(jiàn)輕微表皮增厚，曬傷細(xì)胞較少；而100%n?3 PUFA組小鼠表皮未見(jiàn)明顯變化。見(jiàn)表1。

免疫組化結(jié)果顯示，照光前小鼠皮膚組織內(nèi)無(wú)明顯炎癥相關(guān)因子（IL?1β、IL?6、TNF?α）表達(dá)。紫外線照射后24 h，小鼠表皮和真皮均不同程度表達(dá)IL?1β、IL?6、TNF?α；且n?3 PUFA含量越高，炎癥因子表達(dá)越少；對(duì)照組和12.5%n?3 PUFA組3種炎癥因子表達(dá)水平均高于25%、50%、100%n?3 PUFA組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001），見(jiàn)表1、圖3。

三、皮膚組織勻漿中IL?1β、IL?6、TNF?α含量

ELISA檢測(cè)顯示，照光前3種炎癥因子含量極低，紫外線照射后24 h，各組小鼠炎癥因子表達(dá)明顯升高，且25%、50%和100%n?3 PUFA組小鼠皮膚組織中IL?1β含量低于對(duì)照組、12.5%n?3 PUFA組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。TNF?α和IL?6檢測(cè)結(jié)果與IL?1β組間變化趨勢(shì)類似。見(jiàn)表2。

討 論

紫外線是致皮炎、光老化和皮膚癌變的主要環(huán)境因子之一［9］。紫外線照射皮膚可產(chǎn)生大量活性氧（reactive oxygen species，ROS），使皮膚發(fā)生一系列光生物化學(xué)反應(yīng)，引起皮膚急性光損傷［10］，臨床上可表現(xiàn)為皮膚血管擴(kuò)張、紅斑、腫脹等；組織學(xué)改變包括細(xì)胞間水腫，毛細(xì)血管擴(kuò)張，表皮出現(xiàn)“曬傷細(xì)胞”以及炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)等。從分子水平上看，在ROS刺激下，細(xì)胞中的各種磷脂酶活化，動(dòng)員細(xì)胞膜上磷脂中花生四烯酸（AA，屬于n?6 PUFA）或二十碳五烯酸（EPA，屬于n?3 PUFA）等不飽和脂肪酸，在脂加氧酶（LOX）和環(huán)氧合酶（COX）作用下產(chǎn)生前列腺素（PG）、白三烯和血栓素A2等類二十烷酸，增加血管通透性、趨化中性粒細(xì)胞，從而調(diào)節(jié)IL?1β、IL?6、TNF?α等炎癥因子的產(chǎn)生［11?14］。

圖1 紫外線照射前后5組小鼠皮膚表現(xiàn) 照光前小鼠皮膚正常。紫外線照射后24 h，對(duì)照組、12.5%n?3 PUFA組小鼠背部皮膚出現(xiàn)紅斑、明顯水腫、脫屑、抓痕等，25%、50%n?3 PUFA組小鼠僅發(fā)現(xiàn)輕微紅腫，100%n?3 PUFA組小鼠皮膚紅腫不明顯

圖2 紫外線照射前后5組小鼠皮膚組織病理改變（HE×100） 照光前小鼠背部皮膚組織結(jié)構(gòu)完整，表皮厚薄均勻，表皮、真皮及皮下組織層次清晰。照光后對(duì)照組、12.5%n?3 PUFA組小鼠表皮厚薄不均，細(xì)胞間水腫（紅色箭頭），曬傷細(xì)胞（黃色箭頭）、炎癥細(xì)胞聚集（黑色箭頭），25%和50%n?3 PUFA組可見(jiàn)輕微表皮增厚，曬傷細(xì)胞較少，100%n?3 PUFA組里未見(jiàn)明顯結(jié)構(gòu)改變

表1 紫外線照射后24 h小鼠皮膚中曬傷細(xì)胞數(shù)量及不同炎癥細(xì)胞因子的表達(dá)（±s）

表1 紫外線照射后24 h小鼠皮膚中曬傷細(xì)胞數(shù)量及不同炎癥細(xì)胞因子的表達(dá)（±s）

注：a與對(duì)照組和12.5%n?3 PUFA組比較，P＜0.05；b與同列25%、50%、100%n?3 PUFA組相比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.001。PUFA：多不飽和脂肪酸

組別對(duì)照組12.5%n?3 PUFA組25%n?3 PUFA組50%n?3PUFA組100%n?3 PUFA組F值P值只數(shù)10 10 10 10 10曬傷細(xì)胞（個(gè)/100倍視野）17.50±4.93 14.25±1.71 6.50±1.73a 4.75±2.06a 4.50±1.73a 19.1＜0.001白細(xì)胞介素1β（%）9.90±0.75b 4.05±0.50b 3.98±0.49 1.31±0.20 0.84±0.10 175.8＜0.000 1白細(xì)胞介素6（%）12.25±0.52b 3.61±0.79b 2.42±0.23 1.04±0.13 0.71±0.24 332.6＜0.000 1腫瘤壞死因子α（%）4.96±0.21b 4.06±0.27b 1.43±0.47 1.08±0.12 0.79±0.16 145.7＜0.000 1

表2 ELISA檢測(cè)紫外線照射前后各組小鼠皮膚中炎癥因子表達(dá)水平（±s，ng/L）

表2 ELISA檢測(cè)紫外線照射前后各組小鼠皮膚中炎癥因子表達(dá)水平（±s，ng/L）

注：a與同列25%、50%、100%n?3PUFA組相比，P ＜0.05。PUFA：多不飽和脂肪酸

照光前照光后組別 只數(shù)對(duì)照組12.5%n?3 PUFA組25%n?3PUFA組50%n?3 PUFA組100%n?3 PUFA組F值P值10 10 10 10 10白細(xì)胞介素1β 112.30±24.74 72.36±12.02 75.96±9.22 69.80±21.93 58.73±19.76 2.931＞0.05白細(xì)胞介素6 104.80±5.65 94.80±36.16 82.30±26.16 115.80±32.07 67.80±16.97 1.458＞0.05腫瘤壞死因子α 92.06±12.35 84.15±40.44 71.90±11.45 94.70±45.43 66.86±12.10 0.398＞0.05白細(xì)胞介素1β 1962.44±451.78a 1276.67±531.54a 862.52±102.08 746.39±28.76 312.11±39.35 11.670＜0.001白細(xì)胞介素6 396.30±70.00a 373.80±67.55a 271.80±52.74 264.80±10.54 222.30±14.85 5.262＜0.05腫瘤壞死因子α 492.33±27.30a 547.67±63.31a 308.15±36.96 272.00±51.64 297.00±47.68 21.830＜0.000 1

圖3 紫外線照射前后不同炎癥細(xì)胞因子在5組小鼠皮膚中的表達(dá)（免疫組化染色×100）

既往人體實(shí)驗(yàn)表明，膳食魚(yú)油能顯著增加免疫細(xì)胞膜磷脂中EPA、二十二碳六烯酸含量，使AA含量下降［15?16］，而且n?3 PUFA可通過(guò)與AA直接競(jìng)爭(zhēng)，對(duì)脂加氧酶、環(huán)氧合酶作用或者影響酶活性來(lái)減少AA來(lái)源的PGE2和白三烯B4等類二十烷酸［17］，從而發(fā)揮抗炎作用。n?3 PUFA除了對(duì)系統(tǒng)性疾病如心血管疾病、結(jié)腸腫瘤等有一定防治作用，對(duì)皮膚最小紅斑量、長(zhǎng)期紫外線照射所致皮膚光老化亦有一定影響。有研究表明攝入來(lái)自魚(yú)貝類等海洋來(lái)源的EPA、二十二碳六烯酸的受試者光老化程度較輕［4］。但是影響急性光損傷的具體劑量和保護(hù)作用之間的關(guān)系尚未見(jiàn)研究。

我們定制5種n?3 PUFA含量不同的小鼠飼料，分別喂養(yǎng)5組SKH?1無(wú)毛小鼠。該型小鼠皮膚裸露，同時(shí)又具有健全的免疫功能，類似于正常人體皮膚，便于紫外線照射和實(shí)驗(yàn)觀察［7］。SS?03AB型日光紫外線模擬器發(fā)射的光線比較接近日光紫外線的組成，因此我們選擇其作為照射光源。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)［18］，小鼠膳食攝入n?3 PUFA第2周皮膚中n?3 PUFA包括α-亞麻酸、EPA和二十二碳六烯酸的含量即可顯著提高，但n?6 PUFA如AA、亞油酸的含量降低，這種變化在第4周趨于穩(wěn)定。因而本研究在特殊喂養(yǎng)第50天進(jìn)行急性光損傷造模，因1MED引起的小鼠皮膚紅腫反應(yīng)不強(qiáng)，故采用2MED造模。在紫外線照射24 h后大體和皮膚鏡觀察均顯示對(duì)照組、12.5%n?3 PUFA組小鼠皮膚出現(xiàn)紅斑、水腫、脫屑、抓痕等，組織病理觀察到兩組小鼠表皮厚薄不均、細(xì)胞間水腫，可見(jiàn)曬傷細(xì)胞、大量炎癥細(xì)胞聚集等現(xiàn)象。該結(jié)果與胡堅(jiān)等［7］研究結(jié)論相同，表明成功建立急性光損傷模型。25%、50%n?3 PUFA兩組照光小鼠僅見(jiàn)輕微紅腫、表皮增厚、細(xì)胞增生等，而100%n?3 PUFA組照光小鼠只觀察到輕微紅腫，且其表皮厚薄均勻，結(jié)構(gòu)完整，層次清晰，與照光前小鼠的表現(xiàn)相似。表明n?3 PUFA對(duì)紫外線所致急性損傷有光保護(hù)作用。

本研究中免疫組化檢測(cè)還發(fā)現(xiàn)，紫外線照射后，各組IL?1β、IL?6、TNF?α在表皮或真皮中有不同程度表達(dá)；且隨n?3 PUFA含量升高，組織內(nèi)3種因子的表達(dá)基本呈下降趨勢(shì)。ELISA檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組、12.5%n?3 PUFA兩組相比，25%、50%、100%n?3 PUFA組IL?1β、IL?6、TNF?α含量降低。結(jié)合25%、50%、100%n?3 PUFA組小鼠皮膚損傷程度較輕，提示n?3 PUFA可能通過(guò)抑制上述炎癥因子產(chǎn)生，減輕急性光損傷。

以上結(jié)果表明，小鼠膳食中n?3 PUFA的比例達(dá)到25%時(shí)對(duì)紫外線所致的急性光損傷即可產(chǎn)生顯著防護(hù)作用，而且，比例越高，防護(hù)效果越顯著。這與一些研究證明飲食中n?6 PUFA/n?3 PUFA的比例不應(yīng)超過(guò)4∶1結(jié)果一致［19］。但這些脂肪酸是否具有直接的紫外線防護(hù)作用尚需進(jìn)一步研究。