水曲柳種子脂肪酸GC-MS分析

馬忠孝,李 奉,郭 森,白乃生

(西北大學(xué) 化工學(xué)院， 陜西 西安 710069)

水曲柳(FraxinusMandshuricaR.)屬于木犀科(Oleaceae)梣屬(Fraxinus)植物,別名,東北梣,主要分布于我國東北黑龍江的大興安嶺東部和小興安嶺、吉林的長白山等地。其樹皮具有抗炎鎮(zhèn)痛之功效,常作秦皮的替代品使用[1]?！缎氯A本草綱要》也記載了它的皮味苦,性寒,具有清熱燥濕,清肝明目的功能,用于腸炎、痢疾、月經(jīng)不調(diào)、白帶、慢性支氣管炎、急性結(jié)膜炎、瘧疾的治療[2]。

梣屬(Fraxinus)植物種子中所含的化學(xué)成分種類比較多,主要有環(huán)烯醚萜類、酚苷類、香豆素類、木脂素類、黃酮類等化合物[3-7]。因此，水曲柳種子具有較高的藥用價(jià)值和食用價(jià)值,藥理研究發(fā)現(xiàn),其主要有抗炎鎮(zhèn)痛、抗病原微生物、利尿、抗腫瘤、抗氧化、降血糖等多種藥理作用[8-17]。多不飽和脂肪酸(Polyunsaturated fatty acids, PU-FA)具有抗癌、抗氧化、保肝促進(jìn)細(xì)胞生長抗心腦血管疾病等作用[18]。本文擬采用乙醇提取,氣相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(Gas Chromatography and Mass Spectrometry, GC-MS)分析水曲柳種子所含有的小極性脂肪酸成分,為水曲柳種子下一步的研究和開發(fā)利用提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

水曲柳種子:水曲柳種子2015年12月年于吉林購買,經(jīng)西北大學(xué)白乃生鑒定,留樣于西北大學(xué)。

試劑:水曲柳種子提取分離使用的乙醇、石油醚、乙酸乙酯、二氯甲烷均為工業(yè)級(jí);乙醚(分析純)購自天津市富宇精細(xì)化工有限公司;正己烷(分析純)購自天津市富宇精細(xì)化工有限公司;氫氧化鈉(分析純)購自天津市恒興化學(xué)試劑制造公司;甲醇(分析純)購自天津市富宇精細(xì)化工有限公司;氯化鈉(分析純)購自天津市河?xùn)|區(qū)紅巖試劑廠;無水硫酸鈉(分析純)購自天津市河?xùn)|區(qū)紅巖試劑廠;純凈水。

1.2 儀 器

GC-MS 2010-plus氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀,配有電子轟擊離子源,四級(jí)桿質(zhì)量分析器;GC-MS-Solution數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)(日本島津公司);NIST-05版質(zhì)譜圖庫; KQ3200DE超聲清洗器(昆山市超聲儀器有限公司);FA1204電子天平(天津康亨達(dá)電子衡器有限公司);QE-500粉碎機(jī)(武義縣屹立工具有限公司);R-1001VN旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(鄭州長城科工貿(mào)有限公司);WB-2000恒溫水浴鍋(鄭州長城科工貿(mào)有限公司);SHB-Ⅲ循環(huán)水真空泵(鄭州長城科工貿(mào)有限公司);DLSB-5/10低溫冷卻液循環(huán)泵(鄭州長城科工貿(mào)有限公司)。

1.3 方法與條件

1.3.1 提 取 取水曲柳種子30kg,粉碎后加入3倍體積的乙醇-水(體積比為9∶1)在室溫下浸泡提取3次。每次48h,將提取液合并濃縮后,溶劑回收重復(fù)使用,得到墨綠色的浸膏(1.441 kg)和褐色油狀物。將提取浸膏用適量的水分散后,先后分別用二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇萃取3次,將各個(gè)萃取部位進(jìn)行濃縮,得到二氯甲烷萃取物(0.388 kg)、乙酸乙酯萃取物(0.089 kg)、正丁醇萃取物(0.433 kg)及水層部分(0.485 kg)。對提取后的濾渣先后分別用適當(dāng)體積50L的體積比為1∶1的乙醇和水提取,分別濃縮成浸膏,待后續(xù)處理。

二氯甲烷層整體極性偏小, 用0.075～0.150mm硅膠,石油醚(PE)-乙酸乙酯(EtOAc)梯度洗脫,柱分離粗分劃斷為7個(gè)餾分(組分1～7),組分1～3為大量的黃褐色油狀物質(zhì),在TLC跟蹤檢測時(shí)發(fā)現(xiàn)極性很小,但其中的化合物極性很相近。因此，為了全面掌握二氯甲烷層中的主要成分,對組分1～3極性很小的油脂性成分進(jìn)行脂肪酸GC-MS組成分析。

1.3.2 脂肪酸甲酯化 稱取組分1～3各0.200 g,加入0.5 mol/L氫氧化鈉的甲醇溶液6mL,充分震蕩后放入60℃的恒溫水浴鍋中。放置1h后取出,加入提前配好的10% H2SO4—MeOH溶液至酸性(大約加入了7mL)。然后放入60℃的恒溫水浴鍋中, 1h后將樣品取出自然放置使其冷卻。加入8mL正己烷、4mL水進(jìn)行萃取,離心后取出上清液并加入無水硫酸鈉進(jìn)行干燥處理。處理后的樣品用0.22μm微孔過濾頭進(jìn)行過濾,預(yù)處理結(jié)束待分析。

1.3.3 GC-MS 分析 氣相色譜(GC)條件:Rtx-5MS彈性石英毛細(xì)管柱(30m×0.25 mm×0.25 μm);以99.99%(體積分?jǐn)?shù))的氦氣為載體,柱前壓力為83 kPa;流速為1.05 mL/min,進(jìn)樣口的溫度為250℃,進(jìn)樣量為1.0 μL,分流比30∶1(體積比),計(jì)算各峰相對含量。采用程序升溫法,色譜柱的初始溫度為100℃,保持這個(gè)溫度2min,然后以10℃/min升溫至210℃,再以1.5℃/min升溫至230℃,保持1min。最后以5℃/min升溫至250℃,此升溫過程結(jié)束。

質(zhì)譜(MS)條件:采用EI電離源,電子能量為70eV,離子源溫度為220℃,四級(jí)桿溫度為150℃,接口溫度是280℃,掃描方式為間歇掃描,質(zhì)量范圍為m/z 50-500,數(shù)據(jù)采集時(shí)間為2～22min。

1.3.4 數(shù)據(jù)處理 測定方法。取脂肪酸甲酯化樣品1μL,用GC-MS儀測定,通過色譜工作站數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)檢索NIST-05 譜圖庫,結(jié)合有關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行人工譜圖解析,確認(rèn)脂肪酸及其他化學(xué)成分。通過GC-MS Solution色譜工作站數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)按面積歸一化法進(jìn)行定量分析,分別求出各脂肪酸成分的相對百分含量。

2 結(jié)果與分析

將組分1，2，3采用上述GC-MS 分析條件進(jìn)行分析,得到相對應(yīng)組分的脂肪酸成分總離子流色譜圖(圖1,2,3)，對所含組分進(jìn)行NIST-05譜庫檢索,并根據(jù)離子峰質(zhì)譜解析、結(jié)構(gòu)篩選,最終初步確認(rèn)所含組分的可能結(jié)構(gòu)。同時(shí)，應(yīng)用面積歸一化法,通過GC-MS Solution色譜工作站數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)求得各脂肪酸成分的相對質(zhì)量分?jǐn)?shù)(表1)。

圖1 組分-1脂肪酸GC-MS總離子流譜圖Fig.1 GC-MS total ion chromatogram of the ingredient-1

圖2 組分-2脂肪酸GC-MS總離子流譜圖Fig.2 GC-MS total ion chromatogram of the ingredient-2

圖3 組分-3脂肪酸GC-MS總離子流譜圖Fig.3 GC-MS total ion chromatogram of the ingredient-3

綜合3個(gè)組成分來看,水曲柳種子中含有較高的不飽和脂肪酸,其中主要為多烯脂肪酸、亞油酸及油酸、芳環(huán)脂肪酸及不飽和脂肪酸,各類脂肪酸成分的含量相對較高,且在GC-MS中能夠做出較好的定性和定量分析。

表1 各組分脂肪酸甲酯化后的衍生物Tab.1 Fatty acid methylated derivatives of each ingredient

結(jié)果表明,從組分1中分離鑒定出4種脂肪酸, 均為不飽和脂肪酸, 其占組分1脂肪油總量的14.69%(質(zhì)量分?jǐn)?shù)),主要種類有十六烯酸(1.18%，質(zhì)量分?jǐn)?shù))，(Z,Z)-9,12-十八碳二烯酸(4.88%，質(zhì)量分?jǐn)?shù))，9-十八碳烯酸(5.36%，質(zhì)量分?jǐn)?shù))，8-硬脂酸(2.66%，質(zhì)量分?jǐn)?shù))、順-11-二十烯酸(0.91%，質(zhì)量分?jǐn)?shù))等;這幾個(gè)脂肪酸均在組分2也有中發(fā)現(xiàn)。從組分2中分離鑒定出14種脂肪酸, 其中含10種不飽和脂肪酸, 其占組分2脂肪油總量的30.37%(質(zhì)量分?jǐn)?shù)),主要種類有癸烯酸(0.51%，質(zhì)量分?jǐn)?shù))、蓖麻油酸(0.80%，質(zhì)量分?jǐn)?shù))、亞油酸(0.48%，質(zhì)量分?jǐn)?shù))、9-十六烯酸(0.69%，質(zhì)量分?jǐn)?shù))、十六烯酸(3.47%，質(zhì)量分?jǐn)?shù))、對羥基苯丙酸(0.63%，質(zhì)量分?jǐn)?shù))、9,13-十八碳二烯酸(7.11%，質(zhì)量分?jǐn)?shù))、反油酸(5.33%，質(zhì)量分?jǐn)?shù))、硬脂酸(1.34%，質(zhì)量分?jǐn)?shù))、順-11-二十烯酸(0.91%，質(zhì)量分?jǐn)?shù))等;含有飽和脂肪酸4種,其含量占脂肪油總量的6.31%(質(zhì)量分?jǐn)?shù)),主要種類有二十烷酸(1.30%，質(zhì)量分?jǐn)?shù))、二十二烷酸(1.00%，質(zhì)量分?jǐn)?shù))、十九酸(3.60%，質(zhì)量分?jǐn)?shù))、二十四碳酸(1.41%，質(zhì)量分?jǐn)?shù))等。兩類脂肪酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)占組分2脂肪油總量的36.59%。從組分3中分離鑒定出16種脂肪酸, 均為不飽和脂肪酸, 其含量占組分3脂肪油總量的48.96%,主要種類有9-棕櫚油酸和棕櫚油酸總共(3.3%，質(zhì)量分?jǐn)?shù))、各類亞油酸(17.7%，質(zhì)量分?jǐn)?shù))、多烯脂肪酸(24.20%，質(zhì)量分?jǐn)?shù))以及其他各種芳環(huán)脂肪酸(7.07%，質(zhì)量分?jǐn)?shù))。

3 結(jié) 論

水曲柳種子中所含有的脂肪酸成分主要以不飽和脂肪酸為主,其中有多種多烯脂肪酸(Polyene fatty acid)，具有降低血脂、甘油三酯、總膽固醇作用,提高高密度脂蛋白,降低血黏度,減少血小板聚集和血栓形成作用,以及防止冠心病猝死及抗腫瘤作用[19]。亞油酸(Octadecenoic acid)也有多種藥理作用,可以降低實(shí)驗(yàn)鼠和人體的血膽固醇和β脂蛋白,并可以防治動(dòng)脈粥樣硬化和血栓的形成[20]。多存在于海產(chǎn)品中的棕櫚油酸,在水曲柳種子中有微量存在,棕櫚油酸對肥胖癥、高血糖有很好的緩解作用[21]。由此可見,水曲柳種子中的小極性脂肪酸也有較高的營養(yǎng)價(jià)值和藥用價(jià)值。