新疆蕪菁莖部內(nèi)生菌的分離鑒定

王麗君 馬國財(cái) 韓愛芝 李雅雯 軒正英

摘 要： 為分析新疆蕪菁莖部內(nèi)生菌資源并揭示其物種特征，筆者采用傳統(tǒng)平板培養(yǎng)，通過擴(kuò)增菌株的16S rDNA，并進(jìn)行序列分析的方法分離篩選蕪菁莖部內(nèi)生菌。結(jié)果共分離得到7株內(nèi)生細(xì)菌，分布在5個(gè)不同屬，6株菌為稀有放線菌。該研究首次在新疆蕪菁莖部獲得內(nèi)生菌資源，并發(fā)現(xiàn)其分布較為廣泛。

關(guān)鍵詞： 蕪菁；內(nèi)生菌；分離；鑒定

Abstract： The study analyzed the resources of endogenous bacteria from the stem of turnips in Xinjiang and identified the species by microspore culture and 16S rDNA sequence alignment. The results showed that 7 endophytic bacteria strains were isolated and the 7 endophytes distributed in 5 different genera， 6 of them were rare acinomycetes. In this study， endophytic bacteria were isolated from stem of haploid turnip in Xinjiang for the first time， suggesting that endophytic bacteria resources were abundant and there was a wide range of turnips from Xinjiang.

Key words： Turnip； Endophytic bacteria； Isolation； Identification

植物內(nèi)生菌是一類可以定植于宿主植物中的微生物。它們的部分或全部生活史都能夠在宿主體內(nèi)生活，并且不會(huì)危害宿主植物的細(xì)胞和組織，能與宿主在協(xié)同進(jìn)化過程中互利共生?，F(xiàn)已分離到的植物內(nèi)生細(xì)菌主要有伯克氏菌屬（Burkholderia）、泛菌屬（Pantoea）、芽孢桿菌屬（Bacillus）等54屬120多種[1]，主要用于研究內(nèi)生菌的植物有果樹，煙草和藥用植物等[2-4]，其目的主要是用于抑制使宿主植物致病的一些病原菌[5]。

蕪菁（Brassica rapa L.），又稱蔓菁，維吾爾語又稱其為恰瑪古[6]，系十字花科（Cruciferae）蕓薹屬蕓薹種的兩年生草本植物。主產(chǎn)于新疆南部地區(qū)，因其全身均可食用且具有一定的藥用功效，一直是維吾爾重要的傳統(tǒng)藥食同源性植物。因其適應(yīng)性強(qiáng)，栽培容易且耐貯藏[7]，尤其在新疆干旱缺水的南部廣泛種植[8]。蕪菁現(xiàn)代藥理研究表明[9-12]，蕪菁主要的活性物質(zhì)是硫代葡萄糖苷、類黃酮和多糖成分，具有增強(qiáng)免疫力、抗輻射和抗疲勞等功效。目前對蕪菁的研究多集中于活性物質(zhì)的研究和功能的開發(fā)[13-15]，而蕪菁內(nèi)生菌資源的研究方面還較少，趙燃等對新疆蕪菁根部內(nèi)生菌進(jìn)行分離鑒定，結(jié)果共分離到48株內(nèi)生細(xì)菌，分為7個(gè)OTUs[16]；梁寒峭等在新疆恰瑪古塊根組織中29株內(nèi)生真菌，分屬于8個(gè)屬的11個(gè)種[17]，蕪菁莖部內(nèi)生菌資源至今未見報(bào)道。

筆者采用南疆地區(qū)蕪菁種質(zhì)資源進(jìn)行小孢子培養(yǎng)后，得到單倍體植株，并以其莖部材料為研究對象，通過傳統(tǒng)方法分離篩選其內(nèi)生菌，對南疆地區(qū)藥食同源性植物的內(nèi)生菌資源進(jìn)行系統(tǒng)研究，為蕪菁種質(zhì)資源研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

新疆蕪菁小孢子培養(yǎng)獲得的單倍體植株于2016年9月12日采集于塔里木大學(xué)南疆特色果樹高效優(yōu)質(zhì)栽培與深加工技術(shù)國家地方聯(lián)合工程實(shí)驗(yàn)室。DNA提取相關(guān)試劑由新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地提供，PCR擴(kuò)增體系相關(guān)試劑購自明日百傲（北京）科技有限公司，16S rDNA擴(kuò)增用引物由上海生工生物技術(shù)有限公司合成。SW-CJ-2F超凈工作臺(tái)購自上海博迅實(shí)業(yè)有限公司，BH-2光學(xué)顯微鏡購自奧林巴斯，fcycler96孔PCR反應(yīng)儀購自Bio-Rad公司，GEL Doc2000凝膠成像分析儀購自Bio-Rad公司。成品培養(yǎng)基TSA-YE（含0.6%酵母浸膏的胰酪胨大豆瓊脂）購自青島賓得生物技術(shù)有限公司，

1.2 方法

1.2.1 蕪菁莖部內(nèi)生菌分離純化 取蕪菁材料無病癥的莖部區(qū)域，用自來水沖洗30 min，晾干。然后用70%乙醇浸泡30 s，無菌水沖洗3次，再用含有2.5%有效Cl-的次氯酸鈉溶液浸泡3 min，最后用無菌水沖洗4次，無菌條件下晾干。取最后一次沖洗的無菌水120 μL，涂布接種于TSA-YE平板上，30 ℃倒置培養(yǎng)3 d，觀察有無菌落形成，以此驗(yàn)證表面滅菌效果。用無菌鑷子和剪刀在表面滅菌后的蕪菁莖部材料內(nèi)部取5 g樣品置于無菌均質(zhì)杯中，加入45 mL無菌水，10 000 r·min-1均質(zhì)2 min。取均質(zhì)后的樣液1 mL，加入到盛有9 mL無菌水的試管中，依次做梯度稀釋至10-5，5個(gè)稀釋梯度各取0.1 mL涂布于TSA-YE平板，每個(gè)梯度涂布兩個(gè)平板，待樣液完全吸收后，于30 ℃培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)5 d，觀察菌落生長情況并記錄。

根據(jù)TSA-YE 平板上的菌落生長情況，對生長良好的菌株進(jìn)行菌落形態(tài)觀察并記錄，然后挑取分離培養(yǎng)平板上的單菌落轉(zhuǎn)接到新配制的純化培養(yǎng)基上進(jìn)行純化培養(yǎng)。待菌體生長到足夠的量時(shí)加入無菌甘油，置于冰箱-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 蕪菁內(nèi)生菌基因組DNA的提取及16S rDNA擴(kuò)增 收集純化后的菌體置于無菌離心管（1.5 mL）中，分別加入480 μL TE緩沖液（1×） 和20 μL溶菌酶（50 mg·mL-1），180 r·min-1搖床振蕩過夜（37 ℃）。分別加入SDS（20%）50 μL和蛋白酶K（20 mg·mL-1）5 μL，55 ℃水浴1 h。再加入550 μL酚∶氯仿∶異戊醇=25∶24∶1，12 000 r·min-1，10 min，取上清液，重復(fù)3次。取上清，加入異丙醇300 μL和3 mol·L-1的乙酸鈉70 μL，放4 ℃沉淀DNA 30 min。12 000 r·min-1離心10 min，棄上清。用70%乙醇300 μL清洗離心產(chǎn)物，12 000 r·min-1離心5 min，棄上清，重復(fù)操作2次，待乙醇完全揮發(fā)，加入無菌超純水50 μL充分溶解DNA，1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA提取質(zhì)量，將提取的DNA放入-20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

擴(kuò)增16S rDNA所用引物為細(xì)菌通用引物。反應(yīng)體系為（25 μL），其中包括：20.4 μL ddH2O，10×buffer 2.5 μL，0.5 μL dNTPs ，引物27F（10 μmol·L-1）和1492R（10 μmol·L-1）各0.5 μL，Taq DNA聚合酶0.1 μL，0.5 μL模板DNA 。反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性1 min，56 ℃退火 1 min，72 ℃延伸2 min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃總延伸8 min。反應(yīng)結(jié)束后用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴(kuò)增產(chǎn)物。將符合條件的PCR產(chǎn)物送測序公司進(jìn)行序列測定。

1.2.3 蕪菁內(nèi)生菌16S rDNA系統(tǒng)發(fā)育分析 使用DNAstar中Seqman軟件進(jìn)行序列拼接，使用Mega 6.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，通過構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，明確微生物的分類地位。

2 結(jié)果與分析

2.1 蕪菁莖部內(nèi)生菌分離純化

采用傳統(tǒng)的微生物分離方法共分離得到內(nèi)生菌7株（WN1-WN7，見圖1），根據(jù)菌落形態(tài)特征可以分為5類。通過革蘭氏染色后顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，7株內(nèi)生菌中革蘭氏陽性桿菌3株（WN2、WN3和WN6）；革蘭氏陽性球菌3株（WN1、WN5和WN7）；革蘭氏陰性球菌1株（WN4），見表1。

2.2 蕪菁內(nèi)生菌基因組DNA的提取及16S rDNA擴(kuò)增

采用細(xì)菌基因組DNA提取的傳統(tǒng)方法進(jìn)行蕪菁莖部內(nèi)生菌的基因組DNA提取。以上述DNA為模板進(jìn)行菌株16S rDNA的擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分析，結(jié)果顯示PCR擴(kuò)增產(chǎn)物條帶單一，且清晰，大小在1 500 bp左右（見圖2）。

2.3 蕪菁內(nèi)生菌16S rDNA系統(tǒng)發(fā)育分析

蕪菁莖部內(nèi)生菌16S rDNA測序后進(jìn)行序列比對，發(fā)現(xiàn)7株內(nèi)生菌分布于Kocuria、Microbacterium、Sanguibacter、Pectobacterium和Rhodococcus 5個(gè)不同屬，還有一個(gè)為疑似新物種（表2）。從進(jìn)化樹上可知7株菌聚類于5個(gè)不同的分支，其中WN1和WN7同源性最高，屬于同一種，其次為WN5，與前者屬于同屬不同種。WN2、WN3、WN6和WN4都是單獨(dú)聚類于一支，遺傳距離較遠(yuǎn)，其中WN4和其他6株菌差異最大，說明本地區(qū)的蕪菁莖部材料內(nèi)生菌具有豐富的物種多樣性（圖3）。

3 討 論

蕪菁富含多種人體所需營養(yǎng)成分，其中多種營養(yǎng)物質(zhì)均高于同為根菜類的蘿卜、大頭菜，具有極高的品質(zhì)和營養(yǎng)價(jià)值[18]。同時(shí)根據(jù)《本草綱目》等書籍中記載：蕪菁具有益中氣、利五臟、解邪毒等功效。《中藥大辭典》[19]記載：蕪菁系蕓薹屬植物，其根皮中含有的蕓薹素成分能夠?qū)θ祟惣纳x和某些病原菌產(chǎn)生抑制作用。本研究從其可食部分的莖部分離內(nèi)生菌，旨在體表比較小的部位分析內(nèi)生物種的資源，為健康植株的共生菌種的后期研發(fā)工作提供理論思路。

新疆地處邊緣地區(qū)，干旱少雨，尤其是南疆，位于塔克拉瑪干沙漠邊緣，屬于極其干燥的氣候。該種環(huán)境下分離出的植物內(nèi)生菌本身應(yīng)具備較強(qiáng)的抗旱能力。前期學(xué)者[16]在新疆北部地區(qū)的恰瑪古根部中分離到48株內(nèi)生細(xì)菌，包含7個(gè)OTUs。本研究對南疆蕪菁莖部內(nèi)生菌進(jìn)行分離鑒定，共得到7株內(nèi)生菌，包含5個(gè)OTUs。兩者研究具有較大差異，其原因有以下幾種，首先是試驗(yàn)材料：前者的材料是采集自中國新疆烏魯木齊市米東區(qū)古牧地鎮(zhèn)團(tuán)結(jié)村十一小隊(duì)的恰瑪古，屬于雜交系品種；本研究使用的試驗(yàn)材料是新疆蕪菁小孢子培養(yǎng)獲得的單倍體植株，屬于樣本量較少的純系植株，由此造成所分離的內(nèi)生菌種類較少；其次是試驗(yàn)部位的選?。呵罢呤沁x擇的成熟果實(shí)部分，該部分體積比較大，且是在地下生長，其內(nèi)生菌種類多部分應(yīng)歸因于果實(shí)所生長的環(huán)境即根際微生物菌群的種類。本研究是采用的樣品莖部，該部位未接觸土壤，其內(nèi)生菌全部來自于植物本身所生，且材料面積較小，取材所需量相對較大，對所分離的內(nèi)生菌在植株莖部的分布比較具有代表性，所以兩者雖研究的同一種植物，但物種從數(shù)量到種類都表現(xiàn)為較大的不同；第三是試驗(yàn)所用培養(yǎng)基：前者使用的培養(yǎng)基是LB培養(yǎng)基，本研究使用的TSA-YE培養(yǎng)基。比較兩種培養(yǎng)基成分發(fā)現(xiàn)，TSA-YE培養(yǎng)基的營養(yǎng)成分較LB培養(yǎng)基多添加了多價(jià)胨、磷酸氫二鉀和葡萄糖三種物質(zhì)。多價(jià)胨屬于有機(jī)氮源，其中除了含有蛋白質(zhì)、肽和游離的氨基酸外，還含有少量的維生素和生長因子，能夠滿足微生物生長和代謝的需要[20-22]。內(nèi)生菌分離結(jié)果不同部分可歸因于培養(yǎng)基成分不同，所提供的生長因子和碳氮源的比例有所不同，本試驗(yàn)所分離出的內(nèi)生菌較適合該種培養(yǎng)基，后續(xù)研究可以多設(shè)計(jì)幾種培養(yǎng)基以期分離篩選到更多數(shù)目和種類的內(nèi)生菌資源。

本研究共分離得到7株內(nèi)生菌，其中多數(shù)為放線菌，表明新疆蕪菁小孢子培養(yǎng)獲得的單倍體植株中內(nèi)生放線菌分布較多。能夠與宿主植株共生，表明兩者之間相互依存的物質(zhì)資源具有一定的共同之處。放線菌能夠產(chǎn)生多種抗菌物質(zhì)，具有較強(qiáng)的抗氧化能力且含有潛在的抗腫瘤功能[23]。本文中使用的試驗(yàn)材料是可食用且對延緩衰老和抗腫瘤具有一定效果的植物，其內(nèi)生菌的次生代謝產(chǎn)物應(yīng)該是具有較好的生防功能，結(jié)合這一特點(diǎn)，后期可以對其內(nèi)生菌的活性成分進(jìn)行分析，以期得到該種植物對人體健康更有效的成分，為人類健康提供有價(jià)值的參考資料。

從新疆蕪菁小孢子培養(yǎng)獲得的單倍體植株莖部材料中分離到1株內(nèi)生菌，與Micro- bacterium fluvii YSL3-15（T）具有98.83%的同源性，初步斷定為Microbacterium屬，該菌株可能含有一些新的抗性物質(zhì)，能夠使該種植物產(chǎn)生特殊的耐旱和耐鹽堿等的功效，其成分和作用機(jī)理有待進(jìn)一步研究。后續(xù)試驗(yàn)可以對蕪菁根、莖、葉、花和果實(shí)等不同部位中的內(nèi)生菌進(jìn)行分離和全面分析鑒定，以期獲得更多的菌種資源，為后期抗菌活性的研究提供廣泛的物資基礎(chǔ)。

綜上所述，新疆不同地區(qū)的蕪菁內(nèi)生菌資源差別較大，且各自都具有較豐富的物種資源，特別是南疆地區(qū)的分離結(jié)果中顯示的菌株數(shù)量不多，此現(xiàn)象歸因于本研究所選的材料是蕪菁莖部，該部位是可食部分且所占植株面積較小，不易分離出內(nèi)生菌，但其所分離的菌株在種屬分布范圍較大，為后期活性成分和功能性狀研究奠定了良好的理論基礎(chǔ)。

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