微流控液滴操控技術(shù)及其生物分析應(yīng)用

陳金陽， 李春榮， 吉邢虎， 何治柯

(生物醫(yī)學(xué)分析化學(xué)教育部重點實驗室，武漢大學(xué)化學(xué)與分子科學(xué)學(xué)院，湖北武漢 430072)

1 引言

微全分析系統(tǒng)(Micro Total Analysis System,μTAS)概念最早在20世紀(jì)90年代初提出[1]。它所涉及的是化學(xué)、物理學(xué)、生物學(xué)、計算機(jī)科學(xué)等學(xué)科高度交叉的領(lǐng)域。自提出以來μTAS逐漸發(fā)展成為當(dāng)前科技界最活躍、最前沿的研究領(lǐng)域之一，其核心技術(shù)和研究熱點是以微流控技術(shù)為基礎(chǔ)的微流控芯片(Microfluidic Chip)。與宏觀尺度的實驗裝置相比，微流控芯片中的流體在μm級反應(yīng)通道中表現(xiàn)出一些特殊效應(yīng)，這些特殊效應(yīng)使得微流控芯片具備很多獨特且優(yōu)越的分析性能[2]。作為微流控芯片研究的重要分支，液滴微流控受到研究者們高度關(guān)注。除了具備微流控芯片的微型化、集成化、自動化等特點外，液滴微流控芯片還具有耗樣少、通量高、速度快以及無交叉污染等優(yōu)點[3 - 4]。液滴微流控的這些優(yōu)點與生命分析需求的高度契合，使液滴微流控逐漸成為生物醫(yī)學(xué)分析領(lǐng)域的研究熱點及研究平臺[5 - 6]。

2 液滴微流控簡介

2.1 液滴微流控的特點

液滴微流控技術(shù)作為微流控的重要分支，其主要是利用互不相溶的兩液相產(chǎn)生分散的微液滴來進(jìn)行實驗操作。因而液滴微流控除兼具微流控和液滴技術(shù)的特點外，同時還具備自身的一些特點。簡單概括起來，液滴微流控主要具有以下特點：(1)液滴體積微小、樣品消耗少。液滴微流控芯片所產(chǎn)生的微液滴體積一般在nL～pL范圍，特別適用于一些珍貴樣品的分析檢測。另外，由于液滴體積小的特點，液滴微流控也是單細(xì)胞分析和單分子檢測的常用技術(shù)。(2)尺寸均一、單分散性好。這種尺寸均一、單分散性良好的特點，使得實驗過程中各個液滴內(nèi)的試劑體積和濃度均保持一致，實驗條件相同，因而有利于精確的定量分析應(yīng)用。(3)體系封閉、避免交叉污染。由于所有的液滴均被分散相包裹且彼此被隔開，液滴與微通道壁也無直接接觸，因此不同液滴間的樣品交叉污染得以避免。另外，被連續(xù)相包裹的液滴內(nèi)部環(huán)境穩(wěn)定，試劑蒸發(fā)被抑制，使得液滴內(nèi)的反應(yīng)條件更為穩(wěn)定。(4)試劑混合快、反應(yīng)速率高。連續(xù)型微流控通道內(nèi)的流體一般處于層流狀態(tài)，因而內(nèi)部試劑的混合主要以擴(kuò)散為主；而分散成為微液滴的小體積試劑，其傳質(zhì)能力得以增強，液滴內(nèi)的試劑混合時間大大縮短，故而液滴內(nèi)反應(yīng)速率也相應(yīng)提高。(5)操作精確、可重復(fù)性高。利用儀器設(shè)備的精確控制，液滴的生成及操控均能穩(wěn)定可控的實現(xiàn)。因此，基于液滴微流控的實驗過程也是精確可控的，與傳統(tǒng)的分析實驗相比，基于液滴微流控的分析結(jié)果具有更好的重現(xiàn)性。

2.2 液滴的生成

液滴的生成主要是通過施加一定的外力，以破壞互不相溶的連續(xù)相與分散相之間存在的張力平衡來實現(xiàn)的。常用的連續(xù)相和分散相主要是油和水，或水和油，因此常見的液滴也有兩種，分別為油包水型液滴(W/O)和水包油型液滴(O/W)。目前，液滴生成方法和技術(shù)的研究有很多，其中主要用到的幾種液滴生成方法有T型通道法、流動聚焦法、共流聚焦法、電場驅(qū)動法、光控法和微型閥驅(qū)動法等。

2.2.1T型通道法(T-junctions) 利用T型通道法生成液滴最早是由Thorsen等提出的，他們通過壓力控制微通道內(nèi)的流體流動，生成不同的油包水的液滴[7]。典型的T型通道法是通過在芯片中設(shè)計T型結(jié)構(gòu)的通道，兩種互不相溶的液相分別流經(jīng)垂直的兩個通道，當(dāng)它們在通道交叉口相遇時即會生成液滴。研究者們發(fā)現(xiàn)，液滴的生成是兩相間的剪切力和表面張力共同作用的結(jié)果，兩相的流速及兩垂直通道的寬度均會對液滴的生成產(chǎn)生影響。因此，通過控制和調(diào)節(jié)兩相的流速及兩通道寬度，能生成不同大小尺寸的液滴。T型通道法是最早提出及最常用的液滴生成技術(shù)之一，在目前的液滴微流控研究中應(yīng)用依然十分廣泛。

2.2.2流動聚焦法(FlowFocusing) 流動聚焦法是指利用連續(xù)相流體從兩側(cè)擠壓分散相流體形成液滴的一種方法，最早是由Anna等和Dreyfus等提出[8 - 9]。利用流動聚焦法生成液滴的芯片通道是一種十字交叉的結(jié)構(gòu)。與T型通道法的單側(cè)剪切相比，流動聚焦法利用連續(xù)相流體從兩側(cè)對分散相流體施加對稱的剪切作用來生成液滴，因而所生成液滴更穩(wěn)定，更容易控制。研究表明，芯片微通道的內(nèi)徑尤其是流聚焦出口的尺寸，以及連續(xù)相和分散相的流速等是影響液滴尺寸的主要因素。故流動聚焦法生成液滴的尺寸調(diào)節(jié)，也是通過兩相流速以及芯片結(jié)構(gòu)的改變來實現(xiàn)的。

2.2.3共流聚焦法(Co-flowing) 在流動聚焦法的基礎(chǔ)上，研究者們提出了一種新型的液滴生成方法，稱之為共流聚焦法。Cramer等最早運用共流聚焦法生成液滴，并研究了影響液滴形成的各種因素[10]。與流動聚焦法相同，共流聚焦法也是利用連續(xù)相流體對分散相流體的對稱剪切來生成液滴。但不同于流動聚焦十字交叉的對稱結(jié)構(gòu)，共流聚焦法采用的是兩個微通道以同軸嵌套的方式組合在一起，常用毛細(xì)管或PDMS通道等實現(xiàn)共流聚焦法的結(jié)構(gòu)組裝。因而在共流聚焦的微通道結(jié)構(gòu)中，連續(xù)相流體從四周環(huán)繞分散相流體并進(jìn)行剪切以形成液滴。利用共流聚焦法生成液滴，能夠很好地避免液滴內(nèi)分散相與通道壁的接觸污染，同時所得到的液滴也較為穩(wěn)定、尺寸較為均一。

2.2.4電場驅(qū)動法前面提到的三種液滴生成方法都是利用微通道的幾何結(jié)構(gòu)并基于流體間的剪切力、界面張力等作用來實現(xiàn)的，屬于被動的液滴生成方式。這些被動的液滴生成方式雖然操作簡單，易于得到大量單分散的液滴，但是對于單個液滴的控制以及不同液滴的個性化操控都較難實現(xiàn)。因此，針對上述問題，在利用流體間的剪切力和界面張力的基礎(chǔ)上，借助外力的驅(qū)動作用來生成液滴的方法也隨之被提出，這類方法則屬于主動的液滴生成方法。其中，基于電場驅(qū)動作用生成液滴的方法受到研究者們的廣泛關(guān)注。電潤濕法(Electrowetting Ondielectric,EWOD)[11]和介電電泳法(Dielectrophoresis,DEP)[12]是兩種較為常用的電場驅(qū)動液滴生成方法。EWOD法是利用電場作用改變流體與固體表面的接觸角，故流體局部會產(chǎn)生一定的壓力差，使流體局部變形失穩(wěn)，從而形成液滴。運用EWOD法生成的液滴更易被操控，能夠方便地進(jìn)行后續(xù)液滴運輸、混合、分裂等操作。DEP法是指電解質(zhì)流體在非均一電場的作用下發(fā)生遷移，結(jié)合界面張力作用從而形成液滴。與EWOD法一樣，DEP法也有利于單個液滴的精準(zhǔn)操控，因而適用于單液滴的分析應(yīng)用。但是，利用DEP法生成液滴的過程都是在持續(xù)的電場區(qū)域中完成的，這種外加電場極易對后續(xù)的液滴操控產(chǎn)生一定的影響。另外，電場驅(qū)動法由于涉及到電極制作與集成、施加電壓以及表面修飾等，因此其芯片制作過程和儀器設(shè)備比前面提到的被動液滴生成方法復(fù)雜。

2.2.5光控法除了電場的作用外，光輻射的作用也被用于發(fā)展新型的液滴生成技術(shù)。這種利用光輻射的作用誘導(dǎo)液滴生成的方法稱之為光控法。例如在2011年，Park課題組提出了一種激光脈沖輔助的液滴生成方法，并研究了液滴生成頻率及液滴尺寸調(diào)控等問題[13]。該方法的主要原理是利用激光脈沖能夠誘導(dǎo)產(chǎn)生氣泡膨脹現(xiàn)象，使原本穩(wěn)定的油水界面失去平衡而產(chǎn)生液滴。利用這種方法生成液滴的頻率高達(dá)10 000 液滴/秒，并可按需生成，所產(chǎn)生的液滴體積在1～150 pL范圍內(nèi)都能精確調(diào)控。

2.2.6微型閥驅(qū)動法為了實現(xiàn)單個液滴的精準(zhǔn)生成與操控，在T型通道法的基礎(chǔ)上引入微型閥的控制，一種新的液滴生成方法被提出，被稱之為微型閥驅(qū)動法。該法最早是由Lin等人于2009年提出[14]，他們在T型通道的結(jié)構(gòu)上集成一個微型閥層，閥層與氣壓驅(qū)動裝置相連，通過計算機(jī)系統(tǒng)準(zhǔn)確地控制氣壓閥的開關(guān)，從而精準(zhǔn)地控制液滴的生成及調(diào)節(jié)液滴的尺寸。與前面提到的電場驅(qū)動法和光控法相比，微型閥驅(qū)動法對設(shè)備要求較低，操作更為簡便可行，能滿足單液滴精確操控與分析的需求。

2.3 液滴的操控

目前，液滴的操控主要包括液滴的分裂、融合、內(nèi)部混合及捕獲等。

(1)液滴的分裂是指借助一定的技術(shù)使單個母液滴變成多個子液滴，以提高液滴的數(shù)量。液滴的分裂為液滴陣列的生成，以及大規(guī)模平行液滴實驗的進(jìn)行提供了必要的技術(shù)手段。在液滴的高通量應(yīng)用中，液滴分裂是一種常用的操控技術(shù)。目前用于實現(xiàn)液滴分裂的方法有很多，主要都是利用芯片通道結(jié)構(gòu)的設(shè)計，并基于液滴在與特定結(jié)構(gòu)的通道表面接觸時所引起的界面張力變化而發(fā)生液滴分裂。Link等利用T型通道一分為二的結(jié)構(gòu)，使單個母液滴裂變?yōu)閮蓚€小的子液滴[15]。這種液滴的分裂對T型通道的設(shè)計精度要求較高，通道的內(nèi)徑大小直接決定分裂所得子液滴的尺寸。使用這種被動式的方法，可以重復(fù)地實現(xiàn)液滴的分裂，并且依然保持液滴較好的單分散性。例如，Ismagilov等就是利用同樣的T型通道結(jié)構(gòu)，經(jīng)過層層串聯(lián)，實現(xiàn)了液滴的重復(fù)分裂，最終得到體積在nL級別的液滴陣列(圖1A)[16]。除了上述利用固定角度且對稱的通道設(shè)計來實現(xiàn)液滴分裂外，Tabeling課題組還提出了一種利用可調(diào)整為任意角度的Y型結(jié)構(gòu)的通道實現(xiàn)液滴分裂的方法，并詳細(xì)考察了影響液滴分裂的主要因素[17]。

(2)液滴的融合即是利用一定的技術(shù)使多個液滴合并成為單個液滴。在液滴的分析應(yīng)用中，不同試劑或樣品間的混合是一個至關(guān)重要的環(huán)節(jié)，液滴的融合正好為其提供了必要的技術(shù)手段。因此，各種不同的液滴融合方法相繼被提出，這些方法基本上歸為兩類。一類是基于芯片微通道的幾何結(jié)構(gòu)或通過液滴位移的精確控制，改變不同液滴的流速或位置，使之相互接近并最終融合。這類方法無需施加外力作用，液滴在流經(jīng)特定的通道區(qū)域后便會自發(fā)融合，因而屬于被動的融合方式。Zhao等在一段直形通道內(nèi)引入一截圓形的空腔以增大通道內(nèi)徑，當(dāng)兩個液滴依次到達(dá)圓形空腔區(qū)域時，由于通道內(nèi)徑突然變大，使得原本幾乎同速的兩個液滴之間產(chǎn)生一定的速度差，因而最終發(fā)生兩個液滴間的相互融合[18]。同樣是為了改變相鄰液滴的流速，deMello等在特定的通道區(qū)域內(nèi)設(shè)計兩排凸起的柱狀陣列結(jié)構(gòu)，以增大液滴流動的阻力[19]。通過這種方法，相鄰的液滴流經(jīng)柱狀陣列之間時，相互間的距離被縮短，直至最終融合(圖1B)。此外，通過對液滴位置的精確調(diào)控，也能達(dá)到液滴融合的目的。除了上述的被動融合方式外，另一類方法則屬于主動融合方式，主要是通過施加外力作用促使液滴融合。例如，Link等提出了一種電動控制的液滴融合方法[20]。該方法主要是利用外加電場與帶電荷液滴之間的相互作用來實現(xiàn)液滴融合操作的。這類方法便于根據(jù)實驗需求選擇性操控，但是對芯片制作及設(shè)備要求相對較高。

(3)在液滴微流控分析應(yīng)用中，為了實現(xiàn)多種試劑或樣品的混合，除了需要進(jìn)行液滴融合外，隨之需要考慮的便是液滴內(nèi)部的混合。這主要是因為液滴內(nèi)的流體由于雷諾系數(shù)較小而原本處于層流狀態(tài)，液滴內(nèi)部多組分試劑或樣品的混合主要以擴(kuò)散的方式進(jìn)行，速度較慢?？焖?、充分的液滴內(nèi)部混合有利于加快反應(yīng)的進(jìn)行，縮短反應(yīng)時間。為了加快液滴內(nèi)部的混合，提高反應(yīng)效率，研究者們提出多種不同的方法。Ismagilov等發(fā)現(xiàn)，當(dāng)液滴流經(jīng)彎曲的通道時，液滴內(nèi)部試劑的混合速率會大大加快(圖1C)[21,23]。基于這種發(fā)現(xiàn)，他們將一段特定的通道設(shè)計成多個U形相連的結(jié)構(gòu)，液滴經(jīng)過U形結(jié)構(gòu)時，液滴內(nèi)部層流狀態(tài)被破壞，內(nèi)部溶液的混合加快，最終使不同試劑或樣品完全混勻。此外，Paik等提出了一種線性陣列液滴混合裝置，利用電潤濕技術(shù)加速液滴內(nèi)部溶液的對流速度，從而實現(xiàn)液滴內(nèi)部的快速混合[24]。使用該法進(jìn)行的液滴內(nèi)部混合速度快，效率高。

(4)在芯片通道內(nèi)，液滴尺寸小，流動性大，為了便于原位監(jiān)測和長時分析以及得到靜態(tài)的液滴陣列，就需要將液滴進(jìn)行捕獲固定。目前用于液滴捕獲的方法大都是基于芯片內(nèi)通道幾何結(jié)構(gòu)的設(shè)計來實現(xiàn)(圖1D)。Hollfelder等通過在芯片通道內(nèi)構(gòu)建馬蹄型的微陣列來捕獲液滴[22]。液滴在流動的過程中，在連續(xù)相的推動下，液滴一旦進(jìn)入到馬蹄型的微結(jié)構(gòu)內(nèi)，則會被固定在其中，從而得到靜態(tài)的液滴陣列。Lin等也提出了一種類似的方法，即利用液滴在主通道和側(cè)通道所受到的壓力差，將液滴擠入微腔內(nèi)固定成為液滴陣列[25]。他們還利用此方法進(jìn)行了液滴內(nèi)單個線蟲的分析研究。此外，通過設(shè)計控制芯片通道的內(nèi)徑與單個液滴的直徑相匹配，在連續(xù)相的流動下，將液滴推至通道內(nèi)，實現(xiàn)直線型的液滴排列，也能達(dá)到捕獲液滴的目的[26]。除單純依靠通道微結(jié)構(gòu)設(shè)計外，一些常規(guī)物理技術(shù)和手段也被用于液滴的捕獲。例如，Sung等利用表面聲波技術(shù)實現(xiàn)液滴的捕獲與釋放，該法可控性強，液滴捕獲也較為溫和順暢[27]。

圖1 (A) 液滴分裂示意圖[16]；(B) 兩種相同尺寸液滴的融合[19]；(C) 液滴流經(jīng)彎曲通道時內(nèi)部的混合過程實驗圖(a)和理論圖(b) [21]；(D) 液滴捕獲陣列[22]Fig.1 (A) A schematic drawing of the droplet splitting process[16];(B) Merging and mixing of two different droplets having the same size[19];(C) Mixing by the baker’s transformation in plugs moving through winding microfluidic channels shown(a) experimentally and(b) schematically[21];(D) Droplet trapping arrays[22]

3 液滴微流控生物分析應(yīng)用

3.1 單細(xì)胞分析

利用液滴技術(shù)進(jìn)行細(xì)胞的封裝與篩選是單細(xì)胞分析研究的一大熱點。Chiu等利用光學(xué)捕獲與液滴微流控技術(shù)，選擇性地將單個細(xì)胞及細(xì)胞器封裝至pL甚至fL級的液滴內(nèi)，進(jìn)行單細(xì)胞及細(xì)胞器的研究[28]。Tan等運用液滴微流控及乳化技術(shù)，成功地將單個腫瘤細(xì)胞、熒光微球甚至是蛋白質(zhì)分子封裝至脂質(zhì)囊泡內(nèi)[29]，該實驗結(jié)果對藥物運輸、傳感器的構(gòu)建以及細(xì)胞工程等提供了諸多有用的信息。Brouzes等采用液滴微流控平臺，實現(xiàn)了單個細(xì)胞的液滴封裝，并結(jié)合光學(xué)編碼技術(shù)進(jìn)行了單細(xì)胞的高通量篩選(圖2A)[30]。此外，基于液滴微流控的單細(xì)胞分析檢測也是一個重要的研究方向。Wang等在液滴微流控芯片中實現(xiàn)了單個大腸桿菌細(xì)胞的裂解，并利用非放大技術(shù)進(jìn)行了細(xì)胞內(nèi)基因的檢測[31]。Fang等通過搭建一個全自動、多功能的液滴微流控平臺，實現(xiàn)了單個PC12細(xì)胞內(nèi)半乳糖苷酶的活性分析及單細(xì)胞內(nèi)DNA提取與純化[32]。Huck等采用液滴微流控技術(shù)，將單個的激活T細(xì)胞封裝至單分散的瓊脂糖液滴中，并對細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子進(jìn)行檢測，以實現(xiàn)細(xì)胞異質(zhì)性分析[33]。

3.2 酶分析

液滴微流控的混合速率快、生物相容性好及耗樣少等特點，使其在酶動力學(xué)研究及分析方面有較為突出的優(yōu)勢。Zheng等采用氣動閥輔助的液滴微流控平臺進(jìn)行了ms級的酶動力學(xué)測定[34]。他們利用安培測定法，成功實現(xiàn)了H2O2的米氏動力學(xué)完整過程的測定，所得到的最佳時間分辨為0.05 s，整個過程所消耗的試劑體積不到50 mL。Han等在較低樣品量的要求下，運用液滴微流控技術(shù)進(jìn)行了多種蛋白酶活性的分析檢測(圖2B)[35]。他們以金屬蛋白酶為模型，成功實現(xiàn)了臨床樣品中多種金屬蛋白酶的活性分析，并應(yīng)用到子宮內(nèi)膜異位癥的診斷中，實驗過程中所用的樣品量不到20 mL。Knudsen等在液滴微流控平臺中，通過對酶活性的測定，實現(xiàn)了瘧原蟲的高靈敏檢測[36]。該工作主要是將DNA擴(kuò)增技術(shù)與液滴微流控平臺相結(jié)合，對拓?fù)洚悩?gòu)酶進(jìn)行測定，從而間接檢測瘧原蟲。該方法對瘧原蟲的檢測非常靈敏，能實現(xiàn)μL樣品中單個瘧原蟲的檢測。并且，該法可以直接以病人的唾液作為樣品進(jìn)行分析檢測，因而該法也是一種無創(chuàng)的檢測方法。

3.3 蛋白質(zhì)分析

液滴微流控技術(shù)在蛋白質(zhì)分析方面的應(yīng)用極其廣泛，主要體現(xiàn)在蛋白質(zhì)結(jié)晶化、蛋白質(zhì)表達(dá)分析、蛋白質(zhì)相互作用以及蛋白質(zhì)檢測等方面。在蛋白質(zhì)結(jié)晶化方面，傳統(tǒng)的蛋白質(zhì)結(jié)晶化研究主要是利用微孔板平臺進(jìn)行大量的篩選及分析對比實驗來完成的。這類方法步驟繁瑣、蛋白質(zhì)消耗量大且耗時長。而液滴微流控的高通量、低耗樣、自動化等特點則為蛋白質(zhì)結(jié)晶化研究提供了新的平臺和手段。Hansen等利用全自動可編程的閥控液滴微流控芯片進(jìn)行了大規(guī)模和高密度的同質(zhì)分析篩選實驗，并實現(xiàn)了蛋白質(zhì)結(jié)晶化研究[37]。在蛋白質(zhì)表達(dá)分析方面，液滴的封閉性和穩(wěn)定性使其在細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)表達(dá)分析方面具有獨特的優(yōu)勢。Huebner等利用液滴微流控技術(shù)成功檢測到了大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)一種熒光蛋白的表達(dá)，并對所表達(dá)蛋白進(jìn)行了定量分析[38]。作為一種有力的分析平臺，液滴微流控在蛋白質(zhì)相互作用方面也有一定的應(yīng)用。Chang等以血管生成素與其抗體相互作用為模型，結(jié)合熒光偏振技術(shù)，成功實現(xiàn)了蛋白間相互作用的高通量分析[39]。此外，液滴微流控在蛋白質(zhì)分析應(yīng)用中的一個重要方面即是蛋白質(zhì)分子的檢測。Malaquin等將液滴微流控與磁分離技術(shù)結(jié)合，實現(xiàn)了低成本、高通量的免疫分析(圖2C)[40]。Tang等將切刻內(nèi)切酶輔助的信號放大方法與適配體技術(shù)相結(jié)合，實現(xiàn)了細(xì)胞表面膜蛋白的均相檢測[41]。與傳統(tǒng)檢測方法相比，該法反應(yīng)速度快、樣品消耗少，且靈敏度較高。

3.4 核酸分析

與上述幾個方面的分析應(yīng)用相比，液滴微流控在核酸分析領(lǐng)域的應(yīng)用更為廣泛。基于液滴微流控平臺的核酸分析應(yīng)用主要包括兩個方面：一是核酸檢測及分析應(yīng)用；另一個方面是基于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)的分析應(yīng)用。在核酸分析檢測方面，又可以細(xì)分為DNA檢測和DNA堿基突變及序列分析等。Edel課題組將熒光共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù)與液滴微流控結(jié)合，進(jìn)行了高通量的DNA分析[43]。此后他們采用高靈敏的光學(xué)系統(tǒng)及液滴微流控平臺，實現(xiàn)了單個DNA分子的檢測[44]。Ryckelynck等將等溫擴(kuò)增技術(shù)和熒光分析方法結(jié)合，實現(xiàn)了高通量的單個DNA分子檢測[45]。Huang等將光纖檢測單元集成到液滴微流控芯片中，利用熒光檢測技術(shù)，實現(xiàn)了DNA堿基突變的高通量實時分析[46]。Weitz等將熒光共振能量轉(zhuǎn)移與液滴微流控結(jié)合，通過建立大量的探針數(shù)據(jù)庫，從而進(jìn)行了DNA片段的序列分析[47]。液滴微流控由于所生成的液滴通量高、封閉性好及無交叉污染等，為PCR的進(jìn)行提供了極富競爭力的技術(shù)支持。利用液滴的連續(xù)性和均一性，以定量PCR為基礎(chǔ)，并引入統(tǒng)計學(xué)和概率分布的原理，研究者們提出了一種新的PCR技術(shù)，即液滴數(shù)字PCR(ddPCR)。目前，ddPCR在核酸分析領(lǐng)域應(yīng)用廣泛。Ji等提出了一種單色ddPCR技術(shù)，并用于DNA拷貝數(shù)及單堿基突變的檢測[48]。該方法與定量PCR相比，無需對照標(biāo)準(zhǔn)，它可以在同一分析區(qū)域內(nèi)實現(xiàn)目標(biāo)DNA和參照DNA的檢測。Li等將連接酶技術(shù)與ddPCR結(jié)合，成功實現(xiàn)了細(xì)胞內(nèi)miRNA的準(zhǔn)確定量分析(圖2D)[42]。該方法操作簡單，且靈敏度和選擇性均較高。近年來，精準(zhǔn)醫(yī)療的提出引起了研究者們的廣泛關(guān)注，而基于液滴微流控的核酸分析有望為精準(zhǔn)醫(yī)療的發(fā)展提供新的技術(shù)支撐。

圖2 (A) 液滴篩選用于單細(xì)胞分析流程圖[30]；(B) 蛋白酶活性分析的微流控裝置示意圖[35]；(C) 實驗裝置以及液滴內(nèi)的磁珠聚集免疫分析流程圖[40]；(D) 基于液滴數(shù)字PCR的miRNA分析原理圖[42]Fig.2 (A) Droplet screening workflow for analysis of single cell[30].(B) Microfluidic device for analysis of protease activity[35].(C) Experimental set up and procedure of magnetic beads based immuno-agglutination in droplets[40].(D) Principle of the ddPCR-based miRNA assay[42].

4 展望

對于液滴微流控生物分析的發(fā)展，可能面臨以下幾個方面的機(jī)遇和挑戰(zhàn)。首先，高通量是液滴微流控分析追求的一大優(yōu)勢，而目前液滴微流控的分析效率和通量仍受諸多因素限制，因此進(jìn)一步提高檢測通量依然是液滴分析應(yīng)用研究的重要趨勢之一。另外，要實現(xiàn)液滴微流控集成化、規(guī)?；姆治鰬?yīng)用，提高液滴的自動化、智能化操控水平，發(fā)展與液滴微流控相匹配的微型、高效、自動的進(jìn)樣技術(shù)也是關(guān)鍵。從分析檢測靈敏度的角度來看，目前液滴微流控分析的靈敏度仍難充分滿足實際應(yīng)用的需求，故圍繞液滴微流控技術(shù)的高靈敏分析應(yīng)用，發(fā)展高靈敏的檢測器件和數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)，構(gòu)建高靈敏的傳感策略，進(jìn)一步提高分析檢測的靈敏度也是重要的研究方向。