β -環(huán)糊精衍生物手性固定相的制備及其在毛細管電色譜-質譜中的應用

李英杰， 趙 楠， 高立娣， 劉樹仁， 徐 蕾

(齊齊哈爾大學化學與化學工程學院，黑龍江齊齊哈爾 161006)

β-環(huán)糊精(β-CD)具有一定尺寸的立體手性空腔，可以與許多有機無機分子、離子等通過范德華力、靜電引力、疏水作用形成主-客體包合物，具備分子識別和選擇性結合的能力[1]。通過對β-CD改性不但可以增加其對手性化合物的拆分能力[2]，還可以將其應用在毛細管電色譜(CEC)中作為整體柱手性固定相[3]。CEC是在毛細管內壁上鍵合、涂漬、填充固定相進行電泳的一種方法，具有毛細管電泳與高效液相色譜的雙重優(yōu)勢[4]。但近年來，隨著樣品復雜程度的增加，研究人員對發(fā)展高靈敏度檢測技術提出了越來越高的要求[5]。毛細管電色譜-質譜(CEC-MS)聯(lián)用技術不僅具有分離速度快、檢測靈敏度高等優(yōu)點，還能提供待測樣品的結構信息，已成為手性分離分析的一種強有力方法[6 - 7]。

手性藥物在生物體內與大分子相互識別之后，所產(chǎn)生的代謝、排泄過程以及體現(xiàn)出來的藥理、毒理作用都不相同[8]。因此，對手性藥物拆分在醫(yī)藥化學領域顯得尤為重要。本文采用原位聚合法，以含乙烯基的β-CD(UPA-β-CD)為功能單體，乙二醇二甲基丙烯酸酯(EDMA)為交聯(lián)劑，制備了新型的環(huán)糊精聚合物手性整體柱。優(yōu)化了制柱條件，以賴氨酸對整體柱的性能進行評價，在CEC-MS模式下成功拆分了鹽酸奧昔布寧、鹽酸芐絲肼兩種手性藥物。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

7100毛細管電泳-6230飛行時間質譜聯(lián)用儀(美國,安捷倫公司)；S-4300掃描電子顯微鏡(日本，日立公司)；Nicolet 380傅里葉變換紅外光譜儀(美國，熱電公司)；石英毛細管(75 μm i.d.，365 μm o.d.)(中國銳豐色譜器材公司)。

乙二醇二甲基丙烯酸酯(EDMA)、3-(異丁烯酰氧)丙基三甲基硅烷(KH570)、對甲基苯磺酰氯(上海阿拉丁試劑公司)；偶氮二異丁腈(AIBN)和2-丙烯酰胺基-2-甲基-1-丙磺酸(AMPS)(美國Flake公司)；β-CD、順丁烯二酸酐(天津科密歐公司)；DL-賴氨酸(北京化學試劑有限公司)；鹽酸奧昔布寧、鹽酸芐絲肼(中國藥品生物制品檢定所)；HAc、NH4Ac、氨水(色譜純，美國MREDA公司)；N，N-二甲基甲酰胺(DMF)、二甲基亞砜(DMSO)、乙腈、HCl、NaOH、三氯甲烷、乙二胺、丙酮、正十二醇、環(huán)己醇均為市售分析純級。實驗用水由GWA-UN5純水儀(北京普析通用儀器有限公司)制備。

1.2 環(huán)糊精衍生物的制備

按文獻方法[9]合成6-en-β-CD。稱取1.2 g 6-en-β-CD和0.13 g順丁烯二酸酐，溶于30 mL DMF中，40 ℃下水浴反應4 h。反應結束后，冷卻至室溫，用三氯甲烷沉淀，再用丙酮充分洗滌，除去未反應的順丁烯二酸酐和6-en-β-CD后，于真空干燥箱中干燥[10]。反應原理圖如圖1所示。

圖1 β -環(huán)糊精含烯衍生物的制備Fig.1 Schematic diagram showing the preparation of olefin-containing β -CD derivative

1.3 整體柱的制備

將毛細管依次用1 mol/L HCl、水、1 mol/L NaOH溶液、水各沖洗5 min，氮氣吹干后注入硅烷化試劑(VKH570∶V丙酮=1∶1 溶液)，40 ℃水浴24 h，甲醇沖洗、氮氣吹干后備用。分別稱取0.025 g UPA-β-CD-DMSO溶液(0.15 g/mL)、0.06 g EDMA、0.15 g正十二醇、0.10 g 環(huán)己醇、0.0017 g AIBN 和0.0018 g AMPS 于小瓶中并超聲至澄清。取上述液體注入到處理后的毛細管中(填料部分20 cm)，兩端用橡皮塞封好后，45 ℃水浴反應11 h，反應完成后用甲醇沖洗、氮氣吹干。

1.4 樣品溶液的配制

分別取0.02 g賴氨酸、鹽酸奧昔布寧、鹽酸芐絲肼，用水溶解定容至10 mL容量瓶中。配制成2 mg/mL待測樣品。使用前經(jīng)0.22 μm濾膜過濾。

1.5 色譜條件

電色譜條件：20 mmol/L NH4Ac緩沖溶液；運行溫度：20 ℃；運行電壓：20 kV；進樣方式：5 kPa×3 s進樣；紫外檢測波長：200 nm。

質譜條件：離子源：dual ESI；干燥氣溫度：325 ℃；干燥氣流速：8 L/min；鞘流液組成：50%甲醇-50% 超純水溶液；流速：0.4 mL/min。

2 結果與討論

2.1 β -CD衍生物的表征

圖2 β -CD衍生物的紅外(IR)光譜圖Fig.2 IR spectra of β -CD derivativesa.6-OTs-β -CD;b.6-en-β -CD;c.UPA-β -CD.

2.1.1紅外光譜分析采用紅外(IR)光譜對產(chǎn)物進行分析，結果如圖2所示。曲線a在1 600 cm-1處為苯環(huán)的C=C雙鍵的伸縮振動吸收峰，1 364.71 cm-1處為S=O的對稱伸縮振動峰，表明已合成6-OTs-β-CD。曲線b在1 115.50 cm-1處出現(xiàn)了C-N伸縮振動峰，表明化合物已由6-OTs-β-CD轉變?yōu)?-en-β-CD。曲線c在1 659.63 cm-1處為C=C雙鍵的伸縮振動峰，1 572.68 cm-1處為酰胺基Ⅱ帶吸收峰，初步確定合成了目標產(chǎn)物。

2.1.2質譜分析采用質譜對產(chǎn)物(m/z=1 274)進一步驗證。在正離子掃描模式下，如圖3a所示，m/z1 275.43 為UPA-β-CD的[M+H]+峰，m/z1 297.41為[M+Na]+峰。在負離子掃描模式下，如圖3b所示，m/z1 273.41為UPA-β-CD的[M-H]-峰，可以確定合成了目標產(chǎn)物。

圖3 UPA-β -CD質譜圖 Fig.3 Mass spectra of UPA-β -CD a.positive ion mode;b.negative ion mode.

2.2 整體柱制備條件的優(yōu)化

在制柱過程中，毛細管內部固定相大孔越多，流動相流經(jīng)時柱壓越低。但對于柱效而言，基質材料中的小孔和中孔數(shù)應較多[11]。EDMA和β-CD的比例會影響整體柱對手性藥物的拆分效果。EDMA含量增加，材料表面活性位點減?。籈DMA含量減小，孔徑變大，柱效降低。當EDMA為0.06 g，UPA-β-CD溶液濃度為0.15 g/mL時，制備的整體柱具有良好的分離選擇性。溫度主要是通過影響AIBN的分解速度來影響毛細管內部孔徑分布。反應溫度越高，聚合物結合致密，能夠承受較高的柱壓；反應溫度越低，聚合物質地疏松，易被流動相沖掉。綜合考慮其機械性能和孔徑分布，較好的反應溫度為45 ℃。反應時間過短，聚合反應不完全；時間過長，有些官能團可能會遭到破壞，從而影響柱子的分離效果和使用壽命。反應時間為11 h時，整體柱具有較好的通透性和較高的柱效。

2.3 掃描電鏡表征

通過掃描電鏡(SEM)對所制備的電色譜整體柱內部結構進行表征，從圖4可以看出，聚合物成功鍵合到毛細管內壁上，并且在柱內形成了較密的網(wǎng)狀結構，其形態(tài)錯綜復雜，具有較強的機械強度，能承受較大的壓力，且整體柱內有較大的孔徑，具有良好的通透性。

圖4 整體柱固定相掃描電鏡(SEM)圖Fig.4 SEM image of monolithic column stationary phase

2.4 整體柱固定相紅外表征

圖5 整體柱固定相紅外光譜表征Fig.5 Characterization of monolithic column stationary phase with infrared spectrum a.Monolithic column stationary phase;b.UPA-β -CD.

對整體柱固定相進行紅外光譜表征，見圖5。如圖5曲線a所示，在3 422 cm-1處為-OH伸縮振動吸收峰，2 920 cm-1處為-CH2-伸縮振動吸收峰，與圖5曲線b的UPA-β-CD相比，1 635.14 cm-1處的C=C峰已經(jīng)明顯減弱，在1 260 cm-1和1 150 cm-1處仍有β-CD的特征峰，說明所制備的整體柱鍵合上UPA-β-CD。

2.5 柱性能評價

以DL-賴氨酸對整體柱進行性能評價，在20 kV的工作電壓下，用20 mmol/L NH4Ac緩沖溶液(pH=5.5)進行連續(xù)5次進樣，其分離度RS均達到2.0以上。并且其對映體保留時間(tD，tL)的相對標準偏差(RSD)均小于2%，結果表明該整體柱具有良好的分離能力。間歇性使用1個月仍有較好的分離性能，說明整體柱具有較好的穩(wěn)定性。

2.6 整體柱的應用

用該整體柱對鹽酸奧昔布寧、鹽酸芐絲肼兩種手性藥物進行分離，優(yōu)化CEC分離條件和MS檢測條件，兩種手性藥物可在18 min和22 min內達到基線分離。圖6為鹽酸奧昔布寧和鹽酸芐絲肼對映體的質譜總離子流圖(TIC)色譜圖，對應的提取質譜圖如圖7所示。圖7a為保留時間為16.91 min的質譜圖，m/z358.24是鹽酸奧昔布寧的[M-HCl+H]+峰，m/z390.29是鹽酸奧昔布寧的[M-HCl+Na]+峰；圖7b為保留時間17.49 min的質譜圖，m/z358.24是鹽酸奧昔布寧的[M-HCl+H]+峰，m/z390.29是鹽酸奧昔布寧的[M-HCl+Na]+峰?？梢耘袛鄨D7a和7b為鹽酸奧昔布寧的對映體峰。圖7c為保留時間19.95 min的質譜圖，m/z258.11是鹽酸芐絲肼的[M-HCl+H]+峰，m/z290.19是鹽酸芐絲肼的[M-HCl+Na]+峰；圖7d為保留時間20.91的質譜圖，m/z258.12是鹽酸芐絲肼的[M-HCl+H]+峰，m/z290.21是鹽酸芐絲肼的[M-HCl+Na]+峰?？梢耘袛鄨D7c和7d為鹽酸芐絲肼的對映體峰。

圖6 兩種手性藥物的總離子流(TIC)色譜圖Fig.6 TIC chromatograms of two chiral drugs

圖7 兩種手性藥物對映體質譜圖Fig.7 Mass spectra of the enantiomers of two chiral drugsa,b:MS spectra of oxybutynrn hydrochloride;c,d:MS spectra of benserazide hydrochloride.

2.7 反應機理探討

鹽酸奧昔布寧與鹽酸芐絲肼結構具有相似的官能團，與UPA-β-CD作用時苯環(huán)可進入環(huán)糊精疏水性腔體，形成疏水包合。手性碳原子所連的羥基或氨基基團可與環(huán)糊精端口的取代基形成氫鍵作用。除上述作用外，衍生基團可增強β-CD空腔的柔韌性，使客體分子的手性中心易于接近β-CD的手性部位，有利于增強主客體間的相互誘導作用。

3 結論

本文采用原位聚合法制備了UPA-β-CD毛細管電色譜整體柱，通過賴氨酸對整體柱手性分離性能進行評價，該柱具有較好的手性拆分能力和重現(xiàn)性。在CEC-MS模式下對鹽酸奧昔布寧、鹽酸芐絲肼兩種手性藥物進行拆分，分離度達1.76和2.12。此方法試劑消耗量少，對手性藥物的分離檢測具有一定參考價值。