法夫酵母蝦青素高效液相色譜分析前處理方法改進(jìn)研究

王 春， 杜希萍,2,3， 姜澤東,2,3， 黃高凌*,2,3， 肖安風(fēng),2,3， 倪 輝,2,3

(1.集美大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，福建廈門 361021；2.福建省食品微生物與酶工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建廈門 361021；3.廈門市食品與生物工程技術(shù)研究中心，福建廈門 361021)

蝦青素(Astaxanthin)是一種酮式類胡蘿卜素，分子式為C40H52O4，呈紅褐色，不溶于水，易溶于二氯甲烷、氯仿與丙酮等有機(jī)溶劑，它具有良好的抗氧化、清除自由基、猝滅單線態(tài)氧的功能[1]。法夫酵母(Phaffiarhodozyma)是一種極具產(chǎn)業(yè)化前景的天然蝦青素資源，其具有豐富的蝦青素合成代謝途徑[2]，且容易進(jìn)行規(guī)?；l(fā)酵生產(chǎn)[3]。目前，高效液相色譜法(HPLC)是廣泛應(yīng)用的測(cè)定蝦青素的分析方法。但在HPLC法分析的樣品前處理過(guò)程中,常需要對(duì)待測(cè)溶液進(jìn)行微濾，以保護(hù)色譜系統(tǒng)并延長(zhǎng)色譜柱使用壽命，消除由于顆粒摩擦引起的壓力波動(dòng)和無(wú)規(guī)律的基線波動(dòng)，提高儀器檢測(cè)的準(zhǔn)確度。濾膜對(duì)分析物可能具有吸附作用，從而影響分析的靈敏性和準(zhǔn)確性。比如，Hu等[4]用HPLC法分析茶葉中兒茶素類和生物堿時(shí)，發(fā)現(xiàn)濾液用NL66、PES、MCE和PTFE濾膜過(guò)濾后，兒茶素含量存在較大差異；吳彩娟發(fā)現(xiàn)聚酰胺(Nylon)對(duì)游離蝦青素具有物理吸附作用[5]。因此，研究微孔濾膜對(duì)目標(biāo)分析物的吸附作用，并減少膜過(guò)濾的影響十分重要。

最近，本課題組發(fā)現(xiàn)法夫酵母蝦青素甲醇提取液經(jīng)微孔過(guò)濾后，濾膜上吸附了一層蝦青素，這可能會(huì)影響蝦青素分析測(cè)定的靈敏度和準(zhǔn)確性。雖然微孔濾膜過(guò)濾對(duì)蝦青素具有吸附作用已受到關(guān)注，但尚未見(jiàn)濾膜吸附影響蝦青素液相色譜檢測(cè)結(jié)果的報(bào)道。本文通過(guò)研究證實(shí)了微孔濾膜對(duì)蝦青素的吸附作用，同時(shí)發(fā)現(xiàn)用添加二甲基亞砜(DMSO)的甲醇溶液作為配制蝦青素的溶劑可以減少濾膜對(duì)蝦青素的吸附量，為提高蝦青素HPLC法分析的靈敏度和準(zhǔn)確性提供參考。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器、試劑與材料

LC-200高效液相色譜儀(島津(中國(guó))公司)，配PDA檢測(cè)器、7125型手動(dòng)式進(jìn)樣器、20 μL進(jìn)樣環(huán)； 5810 R型離心機(jī)(艾本德(中國(guó))有限公司)；KQ5200DE數(shù)控超聲波清洗儀(河北潤(rùn)聯(lián)科技開(kāi)發(fā)有限公司)；LaboStar1-DI系列超純水機(jī)(西門子股份公司)；BS223S分析天平(賽多利斯科學(xué)儀器廠)；Epoch2T全自動(dòng)定量繪圖酶標(biāo)儀(美國(guó)，伯騰儀器有限公司)。

蝦青素標(biāo)準(zhǔn)品以及色譜純甲醇購(gòu)自Sigma Aldrich；分析純甲醇及二甲亞砜(DMSO)購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限責(zé)任公司。

法夫酵母PhaffiarhodozymaJMU-MVP14干酵母菌體由廈門匯盛生物有限公司提供。

1.2 色譜條件

色譜柱：安捷倫 ZORBAX SB-C18柱(100×2.1 mm i.d.,3.5 μm)；流動(dòng)相為甲醇和超純水；梯度洗脫程序：0～5 min，甲醇-水(9∶1，V/V)；10～15 min，甲醇；20～45 min，甲醇-水(9∶1，V/V);流速：0.2 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：474 nm；柱溫：室溫；進(jìn)樣量：20 μL。

2 結(jié)果與討論

2.1 膜材料及膜孔徑對(duì)蝦青素分析的影響

采用0.22 μm PES濾膜與0.22 μm Nylon濾膜，過(guò)濾1 mL 20 μg/mL蝦青素甲醇標(biāo)準(zhǔn)溶液，觀察濾膜顏色變化,測(cè)定過(guò)濾前后的吸光度變化,結(jié)果如圖1A所示，蝦青素甲醇溶液用Nylon膜過(guò)濾，濾膜上吸附了一層褐色物質(zhì)(圖1A中黑色圈內(nèi))，而未過(guò)濾的濾膜及只過(guò)濾甲醇的濾膜顏色潔白。此外，分別使用孔徑為0.22、0.45 μm Nylon膜過(guò)濾1 mL 40 μg/mL蝦青素，對(duì)比濾液液相分析的峰面積，結(jié)果發(fā)現(xiàn)不論是使用Nylon還是用PES膜過(guò)濾后，蝦青素溶液的吸光度值都顯著降低(圖1B)。這些結(jié)果說(shuō)明微孔膜過(guò)濾對(duì)甲醇溶液中蝦青素具有顯著的吸附作用。

圖1 蝦青素溶液過(guò)濾前后濾膜顏色(A)及濾液吸光值變化(B)Fig.1 The colors of filters(A) and absorbance of astaxanthin solution(B) before and after filtration

采用SPSS進(jìn)行顯著性分析，結(jié)果表明Nylon膜和PES膜過(guò)濾后蝦青素溶液的吸光度值(圖1B)以及液相色譜分析峰面積(圖2A)之間沒(méi)有顯著差異。該結(jié)果說(shuō)明濾膜材料對(duì)蝦青素吸附作用的影響不顯著。相關(guān)研究表明，PES對(duì)有機(jī)溶劑的耐受能力不如Nylon膜強(qiáng)[6]，因此選用Nylon膜進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究。如圖2B所示，0.45 μm和0.22 μm孔徑Nylon膜過(guò)濾后，蝦青素峰面積沒(méi)有顯著差異，說(shuō)明微孔膜孔徑對(duì)蝦青素吸附的影響不顯著。由于0.22 μm膜截留的微粒更小，對(duì)色譜柱及儀器的保護(hù)作用更強(qiáng)，因此，選用0.22 μm的Nylon膜進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖2 過(guò)濾膜的材料種類(A)及孔徑(B)對(duì)蝦青素分析的影響Fig.2 The effects of filter material(A) and cut-off size(B) on the analysis of astaxanthin

圖3 DMSO含量對(duì)蝦青素溶液過(guò)濾的影響Fig.3 The effect of DMSO content on the filtration of astaxanthin solution(inset:The peak area of the samples with different content DMSO)Note:The different nomal letters indicate significant difference among treat ments at 0.05 level(n=3)

2.2 二甲基亞砜含量對(duì)膜吸附蝦青素的影響

在蝦青素分析測(cè)定過(guò)程中，常使用二甲基亞砜對(duì)細(xì)胞進(jìn)行破壁處理，因此蝦青素提取液中常含有一定量的二甲基亞砜，因此向溶劑體系中加入不同量的二甲基亞砜達(dá)到改善過(guò)濾膜對(duì)蝦青素的吸附。分別用含有0、2.5%、5%、7.5%、10%和12% 二甲基亞砜的甲醇溶解并定容到25 mL，制得濃度為40 μg/mL的蝦青素溶液，用0.22 μm的Nylon膜過(guò)濾，進(jìn)行HPLC法分析，比較峰面積的變化情況。如圖3所示，在甲醇溶液中添加二甲基亞砜可以顯著提高過(guò)濾液的蝦青素峰面積，這表明二甲基亞砜可顯著減少Nylon膜對(duì)蝦青素的吸附作用。當(dāng)甲醇中二甲基亞砜含量為7.5%時(shí)，蝦青素峰面積最大，說(shuō)明此時(shí)Nylon膜對(duì)蝦青素的吸附量最小。因此，在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中，確定蝦青素溶液中二甲基亞砜濃度為7.5%。

2.3 添加二甲基亞砜時(shí)蝦青素的標(biāo)準(zhǔn)曲線

用甲醇及含7.5%二甲基亞砜的甲醇溶液分別配制蝦青素標(biāo)準(zhǔn)溶液，以色譜峰面積(Y)對(duì)溶液質(zhì)量濃度(X，μg/mL)進(jìn)行線性回歸。結(jié)果表明，甲醇配制蝦青素標(biāo)準(zhǔn)溶液得到的回歸方程為：Y=117 223X+24 060，相關(guān)系數(shù)R2=0.9994;用含7.5%二甲基亞砜的甲醇配制標(biāo)準(zhǔn)溶液的回歸方程為：Y=86 1648X+1 992.5，R2=0.9995。二者相比，加入7.5%二甲基亞砜的甲醇配制蝦青素溶液所得的標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率增大了7倍多，而截距降低了10倍以上。標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率是表征HPLC法靈敏性的重要指標(biāo)，本研究用添加7.5%二甲基亞砜的甲醇配制蝦青素溶液，所得標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率明顯高于用甲醇配制蝦青素溶液的對(duì)應(yīng)值，說(shuō)明在甲醇中加入7.5%的二甲基亞砜可顯著提高蝦青素測(cè)定的靈敏度。在此情況下，計(jì)算方法的檢測(cè)限(S/N=3)為2.81 ng/mL，定量限(S/N=10)為14.78 ng/mL。

根據(jù)國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理總局藥品審評(píng)中心《含量測(cè)定分析方法驗(yàn)證的可接受標(biāo)準(zhǔn)簡(jiǎn)介》[7]判定方法驗(yàn)證數(shù)據(jù)的可靠性，其中提到線性相關(guān)系數(shù)(R2)不得小于0.998，Y軸截距應(yīng)在100%響應(yīng)值的2.0%。添加7.5%二甲基亞砜的甲醇配制蝦青素溶液所得標(biāo)準(zhǔn)曲線的Y軸截距為100%響應(yīng)值的0.23%，僅用甲醇配制蝦青素溶液的Y軸截距為100%響應(yīng)值的20.5%，超出了2.0%的可靠性分析。由此可見(jiàn)，用添加7.5%二甲基亞砜的甲醇配制蝦青素溶液，可以提高蝦青素分析的可靠性。

2.4 精密度與回收率

在濃度為3.03 μg/mL的法夫酵母蝦青素提取液中，分別添加低、中、高濃度(2.2、4.4和11.0 μ/mL)蝦青素標(biāo)準(zhǔn)品，進(jìn)行加標(biāo)回收率試驗(yàn)，每個(gè)濃度進(jìn)行6次平行實(shí)驗(yàn)，計(jì)算加標(biāo)回收率，如表1所示蝦青素的加標(biāo)回收率在95.11%～100.76%之間。美國(guó)食品和藥檢局(FDA)規(guī)定，回收率在80%～120%之間、相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在±10%之間，可認(rèn)為該方法可接受[8]。根據(jù)該標(biāo)準(zhǔn)判斷，本方法的加標(biāo)回收率符合FDA分析檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)要求。姜淼等[9]用HPLC法分析蝦殼中蝦青素，測(cè)定得到加標(biāo)回收率為80.41%～109.21%。孫偉紅等[10]認(rèn)為加標(biāo)回收率是評(píng)價(jià)分析方法準(zhǔn)確度的指標(biāo)，本研究蝦青素的加標(biāo)回收率范圍比相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道的數(shù)值更接近100%，說(shuō)明本方法準(zhǔn)確度更高。

表1 蝦青素提取樣品加標(biāo)回收率(n=6)

表2 日內(nèi)精密度與日間精密度

準(zhǔn)備3個(gè)濃度標(biāo)準(zhǔn)樣品(4.5、9.5、14.0 μg/mL)，同1 d內(nèi)連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)定6次檢測(cè)值的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(日內(nèi)精密度)；此外，連續(xù)3 d進(jìn)樣檢測(cè)值，計(jì)算檢測(cè)值的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(日間精密度)。如表2所示，低濃度、中濃度和高濃度樣品的日內(nèi)精密度范圍為0.13%～1.45%，日間精密度范圍為1.14%～1.67%。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[7]，供試液含量的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差不大于2.0%時(shí)可認(rèn)為其精密度良好。以此標(biāo)準(zhǔn)判斷，本研究建立的方法精密度符合分析檢測(cè)的要求。王松等[11]在分析南極磷蝦蝦青素時(shí)的日內(nèi)精密度為1.0%～3.4%，日間精密度為1.3%～4.3%。精密度是評(píng)價(jià)分析方法重復(fù)性的重要指標(biāo)，本實(shí)驗(yàn)方法的精密度都小于2.0%，比相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道的精密度更好，說(shuō)明本研究方法重復(fù)性更好。

2.5 法夫酵母蝦青素的提取與分析應(yīng)用

圖4 DMSO菌體質(zhì)量體積倍數(shù)對(duì)蝦青素提取分析的影響Fig.4 The effect of the ratio of DMSO volume to yeast mass on astaxanthin extraction and analysisNote:The different normal letters indicate significant difference among treatments at 0.05 level(n=3).

取0.30 g法夫酵母干粉，置于50 mL離心管中，加入菌體質(zhì)量體積倍數(shù)為1.5、2、3、4、5和6的二甲基亞砜，45 ℃ 水浴10 min，加入甲醇使二甲基亞砜濃度達(dá)到7.5%，以37 680 r/min離心10 min，取上清液用0.22 μm 的Nylon 膜過(guò)濾后進(jìn)行HPLC法分析。如圖4所示，隨著二甲基亞砜與菌體質(zhì)量比值的不斷增大，提取分析得到蝦青素含量值越大；當(dāng)二甲基亞砜與法夫酵母菌體比例為4時(shí)，提取分析出的蝦青素含量最大，達(dá)到1667.56 μg/g(干酵母)。應(yīng)國(guó)青等[12]報(bào)道了甲醇浸提、旋蒸濃縮、四氯化碳溶解、HPLC法分析的蝦青素分析流程；謝紅等[13]使用石英砂破壁丙酮渦流振蕩提取、石油醚萃取、旋蒸濃縮、溶解后進(jìn)行HPLC法分析的流程；肖冬光等[14]報(bào)道了鮮酵母酸熱處理、冰水冷卻、離心收集菌體、丙酮振蕩提取、取上清液進(jìn)行分析測(cè)定的流程。相比其他蝦青素提取分析流程，本研究用7.5%的二甲基亞砜為溶劑配制蝦青素提取液進(jìn)行分析測(cè)定，不需要進(jìn)行濃縮及溶劑轉(zhuǎn)換，只需要對(duì)菌體進(jìn)行二甲基亞砜處理、甲醇浸提、離心、微孔過(guò)濾后進(jìn)行HPLC法分析。

3 結(jié)論

本文研究了膜材料、膜孔徑、溶劑中二甲基亞砜比例對(duì)蝦青素吸附的影響，改良法夫酵母蝦青素HPLC法分析的樣品前處理方法。結(jié)果表明，微孔濾膜能顯著吸附蝦青素，膜材料以及濾膜孔徑對(duì)蝦青素吸附?jīng)]有顯著影響；添加二甲基亞砜的甲醇配制蝦青素溶液可以減少濾膜對(duì)蝦青素的吸附量，甲醇中二甲基亞砜含量為7.5%時(shí)蝦青素吸附量最低。該方法應(yīng)用于法夫酵母JMU-MVP菌株蝦青素提取分析測(cè)定，其結(jié)果具有更高的靈敏性、可靠性、加標(biāo)回收率和精密度。