雙羅丹明類(lèi)衍生物熒光探針的合成及對(duì)Cu2+的識(shí)別

袁躍華， 朱永軍， 殷強(qiáng)鋒， 馮 鋒， 王海雁， 田茂忠*

(1.山西大同大學(xué)化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院，山西大同 0370092.華東理工大學(xué)化工學(xué)院，上海 200237)

銅是自然界和生物體中特別重要的過(guò)渡金屬元素之一，Cu2+的缺少或過(guò)量存在對(duì)生物體有不利影響[1 - 2]，會(huì)引起動(dòng)植物病變甚至死亡，因此，監(jiān)控生物體內(nèi)和環(huán)境載體中Cu2+的濃度十分必要。

相對(duì)于其他方法，熒光檢測(cè)分析方法具有選擇性好、靈敏度高[3]等優(yōu)點(diǎn)，故基于熒光檢測(cè)方法的Cu2+探針的研究近年來(lái)引起了眾多科學(xué)工作者的關(guān)注[4 - 8]。由于Cu2+具有順磁性特點(diǎn)，Cu2+的檢測(cè)往往會(huì)引起探針的熒光信號(hào)猝滅[9]，從而不利于提高檢測(cè)的靈敏度。但是，具有內(nèi)酰肼螺環(huán)結(jié)構(gòu)的羅丹明類(lèi)染料識(shí)別Cu2+前處于不發(fā)光的非共軛狀態(tài)，當(dāng)探針?lè)肿优cCu2+發(fā)生作用時(shí)，可引發(fā)螺環(huán)開(kāi)環(huán)，開(kāi)啟共軛體系，恢復(fù)羅丹明熒光團(tuán)的發(fā)光性能，從而達(dá)到通過(guò)熒光增強(qiáng)檢測(cè)Cu2+的目的[10 - 14]。

到目前為止，已有大量的文獻(xiàn)報(bào)道基于羅丹明內(nèi)酰胺的金屬離子探針[15 - 17]。從其結(jié)構(gòu)和性能來(lái)看，在識(shí)別金屬離子后羅丹明6G類(lèi)熒光探針的最大發(fā)射波長(zhǎng)比羅丹明B類(lèi)熒光探針的小。一般來(lái)說(shuō)，羅丹明酰胺類(lèi)熒光探針的識(shí)別機(jī)理是金屬離子絡(luò)合誘導(dǎo)螺環(huán)開(kāi)環(huán)后使得探針熒光增強(qiáng)，識(shí)別金屬離子的過(guò)程可逆；但是，羅丹明酰肼類(lèi)熒光探針有時(shí)識(shí)別金屬離子過(guò)程不可逆，探針熒光增強(qiáng)是由于金屬離子誘導(dǎo)其螺環(huán)開(kāi)環(huán)，然后發(fā)生水解反應(yīng)所致。本文基于Cu2+可促進(jìn)羅丹明螺環(huán)內(nèi)酰胺水解的機(jī)制[18]，以雙羅丹明6G為熒光基團(tuán)，設(shè)計(jì)合成了Cu2+選擇性反應(yīng)型螺環(huán)酰肼熒光探針?lè)肿覴G1。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，引入兩個(gè)水合肼基官能團(tuán)不但增強(qiáng)了探針的水溶性，并保持了其肼類(lèi)衍生物的識(shí)別性能。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

F-2500熒光分光光度計(jì)(日本，日立公司)；pHS-25B 型pH酸度計(jì)(上海大中分析儀器廠)；DRX-400核磁共振儀(瑞士，Bruker公司)；Saturn 2200/2100 質(zhì)譜儀(美國(guó)，Varian 公司)；SHZ-D 循環(huán)水式真空泵(鞏義市予華儀器有限公司)；R215型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(瑞士，BUCHI公司)。

RG1標(biāo)準(zhǔn)溶液：準(zhǔn)確稱(chēng)取一定量探針RG1，溶于二甲亞砜(DMSO)，制成濃度為1.0×10-2mol/L的貯備液，使用時(shí)根據(jù)需要適當(dāng)稀釋。金屬離子溶液：準(zhǔn)確稱(chēng)取一定量各金屬離子硝酸鹽，溶于二次蒸餾水中，制成濃度為2.0×10-2mol/L的貯備液，使用時(shí)根據(jù)需要適當(dāng)稀釋。羅丹明6G購(gòu)自百靈威試劑有限公司；水合肼(85%)、乙二醛(40%)和其它試劑均購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。所有試劑均為分析純。柱層析硅膠為200～300目(青島Makall公司)。水為二次蒸餾水。

1.2 探針的制備

探針的合成路線(xiàn)如下所示：

1.2.1化合物RG3的合成參照文獻(xiàn)方法[15]，將羅丹明6G 2.0 g(4.5 mmol)加入裝有50 mL乙醇的100 mL燒瓶中。室溫下，劇烈攪拌，慢慢滴入85%的水合肼6.0 mL(過(guò)量)。滴加完畢后，攪拌回流2 h。冷卻溶液，減壓蒸去乙醇。然后加入大約100 mL HCl(1 mol/L)，得到紅色溶液；不斷攪拌下，再慢慢加入大約140 mL NaOH溶液(1 mol/L)，直到pH達(dá)到9～10之間，出現(xiàn)大量白色沉淀。過(guò)濾，并用30 mL水洗滌濾餅3次。真空干燥后，初產(chǎn)品用柱色譜分離得到1.18 g化合物RG3(60.9%)。

1.2.2化合物RG2的合成將RG3 500.0 mg(1.2 mmol)加入50 mL的單口燒瓶中，再加入15 mL無(wú)水甲醇和40%乙二醛水溶液1.0 mL，然后在氮?dú)獗Ｗo(hù)下，室溫?cái)嚢? h，減壓蒸去溶劑。把粗產(chǎn)品溶在2 mL 的二氯甲烷中，用硅膠柱色譜分離，洗脫劑為石油醚∶乙酸乙酯=6∶1(V∶V),得到317.3 mg的黃色固體RG2(30.9%)。1H NMR(400 MHz,CD3CN) δH9.23(s,1H),9.21(s,1H),7.97(d,J=7.6 Hz,1H),7.65～7.52(m,4H),7.43(d,J=7.6 Hz,2H),7.03(d,J=7.6 Hz,1H),6.34(s,4H),6.28(s,4H),4.17(s,2H),3.18(q,J=7.2 Hz,8H),2.13(s,2H),1.85(s,12H),1.24(t,J=7.2 Hz,12H)。13C NMR(100 MHz,CD3CN) δC192.15,187.78,165.26,153.01,151.48,148.63,140.57,135.49,128.99,127.59,124.33,119.63,103.98,96.34,65.85,37.97,16.10,13.61。HRMS:m/z計(jì)算值:C54H55N8O4[M+H]+:879.4346，實(shí)測(cè)值:879.4341。

1.2.3化合物RG1的合成將RG2 200.0 mg(0.2 mmol)加入50 mL的單口梨形燒瓶中，再加入10 mL無(wú)水乙醇，然后在氮?dú)獗Ｗo(hù)及室溫?cái)嚢柘?，慢慢分多次加入NaBH415.2 mg(0.4 mmol),加完后室溫下再攪拌2 h。減壓蒸去溶劑，粗產(chǎn)品溶于10 mL二氯甲烷中，加入3 mL K2CO3溶液(0.1 mol/L)，有機(jī)相用無(wú)水MgSO4干燥，過(guò)濾，蒸去溶劑，把固體溶在2 mL的二氯甲烷中。用硅膠柱色譜分離，洗脫劑為石油醚∶乙酸乙酯=2∶1(V∶V),得到184.1 mg的白色固體RG1(91.6%)。1H NMR(400 MHz,CDCl3) δ 7.92(dd,J=5.9,2.7 Hz,2H),7.57～7.39(m,4H),7.08(dd,J=5.9,2.7 Hz,2H),6.36(s,4H),6.18(s,4H),4.55(t,J=7.0 Hz,2H),4.39(t,J=7.0 Hz,2H),3.51(s,4H),3.32～3.33(d,2H),3.19(m,8H),1.88(s,12H)。1.30(t,J=7.1 Hz,12H)。13C NMR(100 MHz,CDCl3) δ 178.88,167.99,152.12,151.45,147.45,133.00,129.67,128.29,127.92,123.94,122.87,117.69,105.43,96.61,66.24,58.43,52.43,38.25,16.62,14.64。HRMS:m/z計(jì)算值:C54H59N8O4[M+H]+:883.4659，實(shí)測(cè)值:883.4667。

2 結(jié)果與討論

2.1 紫外-可見(jiàn)光譜分析

圖1 探針RG1(10 μmol/L)對(duì)金屬離子(濃度均為50 μmol/L)響應(yīng)的紫外-可見(jiàn)(UV-Vis)光譜Fig.1 UV-Vis response of probe RG1(10 μmol/L) to different metal ions(50 μmol/L)

通過(guò)紫外-可見(jiàn)光譜研究了探針?lè)肿覴G1對(duì)Cu2+的識(shí)別作用。由圖1可見(jiàn)，在體積比為1∶1的乙腈-水溶液(10 mmol/L Tris-HCl，pH=7.2)體系中，探針?lè)肿覴G1(10 μmol/L)在可見(jiàn)光譜區(qū)(400～700 nm)幾乎沒(méi)有吸收，當(dāng)加入Cu2+后，紫外-可見(jiàn)光譜在525 nm處出現(xiàn)很強(qiáng)的吸收峰，同時(shí)溶液顏色從無(wú)色變?yōu)榉奂t色。這種現(xiàn)象表明探針?lè)肿覴G1對(duì)Cu2+有良好的識(shí)別功能。Cu2+誘導(dǎo)探針?lè)肿拥牧_丹明內(nèi)酰肼螺環(huán)打開(kāi)，使得摩爾吸光系數(shù)大幅度增大，可達(dá)到4.81×104L/(mol·cm)。另外，還研究了其它常見(jiàn)的金屬離子，如Na+、K+、Mg2+、Ca2+、Ba2+、Fe3+、Ni2+、Cr3+、Cd2+、Mn2+、Pb2+、Ag+、Zn2+、Hg2+與探針?lè)肿覴G1之間的相互識(shí)別作用。從圖中可以發(fā)現(xiàn)，除了Fe3+可引起熒光分子探針RG1的吸收強(qiáng)度稍微增加外，其它金屬離子均未引起探針?lè)肿覴G1可見(jiàn)區(qū)吸光度較明顯的增大，溶液顏色也未發(fā)生明顯變化。所以，探針RG1可以用作Cu2+的顯色傳感。

2.2 熒光光譜分析

在相同的乙腈-水溶液體系中，利用熒光光譜評(píng)價(jià)了探針?lè)肿覴G1對(duì)上述常見(jiàn)金屬陽(yáng)離子的識(shí)別功能。由圖2(A)可見(jiàn)，當(dāng)用510 nm的光激發(fā)時(shí)，探針?lè)肿覴G1(10 μmol/L)的熒光強(qiáng)度很弱。當(dāng)向探針溶液中加入一定濃度的Cu2+后，發(fā)現(xiàn)探針?lè)肿覴G1的熒光增強(qiáng)非常明顯。除了Fe3+對(duì)探針的熒光光譜稍有影響外，加入其它金屬離子后探針的熒光光譜相對(duì)變化都很小，說(shuō)明此探針對(duì)這些金屬離子沒(méi)有識(shí)別響應(yīng)。同時(shí)，實(shí)驗(yàn)考察了探針?lè)肿覴G1識(shí)別Cu2+時(shí)受其它金屬陽(yáng)離子干擾的情況。從圖2(B)可以看出，在不同金屬離子選擇性實(shí)驗(yàn)的體系中，再加入一定濃度的Cu2+都能引起熒光強(qiáng)度的大幅度增加，說(shuō)明這些離子不干擾探針?lè)肿訉?duì)Cu2+的特異性識(shí)別。結(jié)果表明，探針?lè)肿覴G1對(duì)Cu2+有良好的選擇性。

圖2 (A) 探針RG1對(duì)金屬離子的選擇性(探針RG1的濃度為10 μmol/L,金屬離子的濃度均為50 μmol/L);(B)其他金屬離子和Cu2+(50 μmol/L)共存時(shí)探針RG1熒光強(qiáng)度的變化Fig.1 (A) Fluorescence response of probe RG1(10 μmol/L) to different metal ions(50 μmol/L);(B) Fluorescence intensity changes of RG1 upon the addition of various metal ions in and without the presence of Cu2+

2.3 Cu2+濃度對(duì)探針?lè)肿訜晒夤庾V的影響

為了進(jìn)一步考察探針?lè)肿覴G1熒光強(qiáng)度變化與Cu2+濃度之間的關(guān)系，在相同的乙腈-水溶液體系中進(jìn)行了Cu2+熒光滴定實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如圖3所示。由圖3可見(jiàn)，隨著Cu2+濃度的逐漸增大，探針?lè)肿覴G1在553 nm處的熒光強(qiáng)度不斷增強(qiáng)，當(dāng)Cu2+濃度增大到6倍時(shí)，探針的熒光強(qiáng)度接近飽和。Cu2+濃度在3.0×10-6～1.5×10-5mol/L范圍內(nèi)與探針熒光發(fā)射強(qiáng)度(553 nm)呈良好的線(xiàn)性關(guān)系，線(xiàn)性回歸方程為：y=8.84x+7.43，相關(guān)系數(shù)R2=0.9910。Cu2+檢出限(S/N=3)為3.31×10-7mol·L-1。上述結(jié)果表明，探針RG1可以定量檢測(cè)此范圍內(nèi)Cu2+的含量，靈敏度較高。

2.4 pH對(duì)探針?lè)肿訜晒夤庾V的影響

考察了不同pH體系探針?lè)肿拥臒晒夤庾V。由圖4可見(jiàn)，在未加入Cu2+時(shí)，在pH=4～10范圍內(nèi)幾乎探測(cè)不出明顯的熒光信號(hào)，說(shuō)明在此范圍內(nèi)對(duì)體系pH變化不敏感。另外，評(píng)估了加入Cu2+后，pH對(duì)探針RG1熒光光譜的影響，發(fā)現(xiàn)在pH=5～10范圍內(nèi)，探針的熒光強(qiáng)度明顯增大，以上結(jié)果表明，此探針可在較寬的pH范圍內(nèi)直接檢測(cè)Cu2+的濃度。

圖3 逐漸加入Cu2+(0～80 μmol/L)為探針RG1(10 μmol/L)的熒光發(fā)射光譜圖Fig.3 Fluorescence emission spectra of probe RG1 in the presence of Cu2+ with concentration increased[Cu2+]：a-n:0-80 μmol/L；[RG1]=10 μmol/L.

圖4 pH對(duì)探針RG1熒光強(qiáng)度(λem=553 nm)的影響Fig.4 Eeffect of pH on the fluorescence intensity(λem=553 nm) of probe RG1(a) free probe RG1(10 μmol/L);(b) probe RG1+Cu2+.[Cu2+]=50 μmol/L;Excitation at 510 nm.

2.5 探針識(shí)別機(jī)理探討

為了了解探針RG1對(duì)Cu2+的識(shí)別機(jī)理，考察了EDTA對(duì)探針RG1和Cu2+作用體系熒光光譜的影響。發(fā)現(xiàn)當(dāng)向探針識(shí)別Cu2+的體系中加入過(guò)量的EDTA時(shí)，熒光光譜的變化很小，表明Cu2+的識(shí)別過(guò)程不可逆。此外，通過(guò)HRMS對(duì)探針識(shí)別Cu2+的溶液進(jìn)行測(cè)試，發(fā)現(xiàn)生成了探針RG1的水解產(chǎn)物，[M+H]+計(jì)算值：415.2022,實(shí)測(cè)值：415.2015。由此可以進(jìn)一步證明探針RG1對(duì)Cu2+的識(shí)別機(jī)理[18]為探針?lè)肿又凶R(shí)別部位氮原子和氧原子先與Cu2+鍵合引起探針?lè)肿勇輧?nèi)酰肼開(kāi)環(huán)，然后進(jìn)一步水解生成化合物R1，從而誘導(dǎo)熒光明顯增強(qiáng)，如圖5所示。

圖5 探針RG1識(shí)別Cu2+的機(jī)理Fig.5 Proposed mechanism of probe RG1 detecting Cu2+

2.6 樣品檢測(cè)及加標(biāo)回收試驗(yàn)

取河水水樣，按實(shí)驗(yàn)方法測(cè)定其熒光強(qiáng)度，并進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn)，結(jié)果如表1，平均回收率為100.7%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為2.3%。因此，該方法具有較好的準(zhǔn)確度和精密度。

表1 水樣中Cu2+的檢測(cè)(n=5)

3 結(jié)論

合成了一種新的熒光增強(qiáng)型Cu2+熒光探針。在熒光探針RG1的水溶液中，加入Cu2+后會(huì)引發(fā)探針螺環(huán)開(kāi)環(huán)，然后發(fā)生水解，導(dǎo)致熒光明顯增強(qiáng)。方法檢測(cè)Cu2+的靈敏度高、選擇性好，檢出限為3.31×10-7mol/L，而且，探針可以在比較寬的pH范圍內(nèi)對(duì)Cu2+實(shí)施檢測(cè)。