基于極端混合池（BSA）全基因組重測(cè)序的甘藍(lán)型油菜 有限花序基因定位

張堯鋒，張冬青，余華勝，林寶剛，華水金，丁厚棟，傅鷹

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基于極端混合池（BSA）全基因組重測(cè)序的甘藍(lán)型油菜 有限花序基因定位

張堯鋒，張冬青，余華勝，林寶剛，華水金，丁厚棟，傅鷹

（浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物與核技術(shù)利用研究所，杭州 310021）

【目的】適合機(jī)械化收獲是當(dāng)今油菜育種改良和遺傳研究的重要目標(biāo)。該研究以一個(gè)自然變異產(chǎn)生的油菜有限花序（，）突變體為研究對(duì)象，通過分析有限花序的遺傳模式，開展有限花序性狀的基因定位和克隆，以期發(fā)掘候選基因，為培育適合機(jī)械化收獲的油菜新品種提供新思路和新材料，為揭示油菜有限花序遺傳機(jī)制奠定基礎(chǔ)?！痉椒ā恳砸粋€(gè)穩(wěn)定遺傳的有限花序突變株系FM8與野生型自交系FM7開展正反交，觀察F1和F2后代的花序形態(tài)，分析有限花序性狀的遺傳模式。在F2群體中挑選20個(gè)有限花序單株和20個(gè)野生類型單株構(gòu)建混合池，對(duì)混合池和親本開展20×和10×覆蓋度的全基因組重測(cè)序，定位有限花序性狀的關(guān)聯(lián)區(qū)間。根據(jù)關(guān)聯(lián)區(qū)間對(duì)應(yīng)到擬南芥基因組的共線性區(qū)段和基因注釋信息，預(yù)測(cè)候選基因，并對(duì)候選基因進(jìn)行同源克隆，發(fā)掘序列變異，篩選關(guān)鍵基因?！窘Y(jié)果】油菜有限花序突變性狀表現(xiàn)為初花期主花序和側(cè)枝花序頂部形成一個(gè)或若干個(gè)頂生花，花序無限生長(zhǎng)受阻，導(dǎo)致結(jié)角期主枝和側(cè)枝有封頂特征即有限花序。有限花序突變株系與野生型正反交F1均表現(xiàn)為野生型，F(xiàn)2代無限花序與有限花序的分離比符合13﹕3，說明有限花序的遺傳受2對(duì)隱性基因和1對(duì)隱性上位抑制基因互作控制。對(duì)混合池及親本開展全基因組重測(cè)序，得到30 123個(gè)單核苷酸多態(tài)性（SNPs）標(biāo)記和107 636個(gè)插入缺失標(biāo)記（InDels）標(biāo)記，用于有限花序性狀的全基因組定位。定位結(jié)果共檢測(cè)獲得7個(gè)顯著關(guān)聯(lián)區(qū)間，分布于油菜A08、A09、A10、C08和C09共5條染色體。其中，A10染色體上的關(guān)聯(lián)區(qū)間峰值最高，是控制有限花序性狀的主效位點(diǎn)。并且，A10染色體關(guān)聯(lián)區(qū)間內(nèi)的14.36—15.07 Mb的區(qū)域與C09染色體2個(gè)關(guān)聯(lián)區(qū)間顯示高度同源性。候選基因預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)位于A08、A09、A10、C08和C09的5個(gè)關(guān)聯(lián)區(qū)間包含有8個(gè)候選基因，包括（）、（）、（）、（）和（）?；蛐蛄蟹治霰砻魍蛔凅w、和的基因編碼區(qū)存在序列變異，并導(dǎo)致蛋白序列變異?！窘Y(jié)論】油菜有限花序突變由2對(duì)隱性基因和1對(duì)隱性上位抑制基因互作控制。與有限花序性狀顯著關(guān)聯(lián)的區(qū)間有7個(gè)，其中，位于染色體A10和C09的關(guān)聯(lián)區(qū)間具有高度同源性。、和被推斷為有限花序性狀的候選基因。

甘藍(lán)型油菜；有限花序；基因定位；關(guān)聯(lián)區(qū)間；候選基因

0 引言

【研究意義】中國(guó)是世界油菜生產(chǎn)大國(guó)，種植面積7×106hm2，總產(chǎn)1.1×107t，均占全世界的三分之一（www.fao.org）。油菜生產(chǎn)在中國(guó)農(nóng)業(yè)中有著舉足輕重的作用。然而，隨著中國(guó)農(nóng)村勞動(dòng)力成本增加，油菜種植效益和種植面積逐年下降[1]，急需篩選和培育具有早熟、矮稈、株型緊湊、分枝短、熟期整齊度好等特性的品種，以適應(yīng)油菜機(jī)械化生產(chǎn)的需要。由于油菜馴化歷史短，變異類型有限，很大程度限制了油菜的遺傳改良。因此，發(fā)現(xiàn)和創(chuàng)制新的油菜變異類型對(duì)拓寬現(xiàn)有油菜遺傳資源、加快選育適合機(jī)械化作業(yè)的油菜品種有重要意義。【前人研究進(jìn)展】高等植物的花序分限花序和無限花序[2]。自然生長(zhǎng)的（野生型）油菜屬于無限花序類型，即隨著花序軸的伸長(zhǎng)，不斷產(chǎn)生花芽、形成花蕾。具有無限生長(zhǎng)習(xí)性的油菜在生產(chǎn)上存在一些缺陷，如：植株較高、易倒伏；結(jié)角層不集中，整齊度不好；熟期不一致，無效角果多[3]。實(shí)現(xiàn)油菜從無限花序向有限花序轉(zhuǎn)變，克服無限花序生長(zhǎng)習(xí)性的不足，是選育適合機(jī)械化收獲的油菜品種的新思路。高等植物開花現(xiàn)象涉及一系列精確的發(fā)育進(jìn)程[4-10]。如果植株花序分生組織表現(xiàn)持續(xù)激活，就會(huì)源源不斷產(chǎn)生花分生組織，表現(xiàn)為無限花序類型。目前，在一些物種中已發(fā)現(xiàn)無限花序植株的有限花序變異。Shannon等[11]通過EMS誘變產(chǎn)生了有限花序類型的擬南芥；Bradley等[12]發(fā)現(xiàn)了一個(gè)自然變異的金魚草有限花序突變體；Dhanasekar等[13]通過γ射線誘導(dǎo)豌豆產(chǎn)生了有限花序突變體；Kaur等[14]在人工合成芥菜型油菜創(chuàng)制過程中產(chǎn)生了有限花序變異類型的芥菜型油菜；Zhang等[15]通過EMS誘變產(chǎn)生了芝麻有限花序突變體；劉毅[16]發(fā)現(xiàn)了自然突變的有限花序芝麻突變體。在不同物種的有限花序突變體中，花序形態(tài)基因突變被認(rèn)為是控制無限花序向有限花序變異的關(guān)鍵因素。例如，金魚草的基因（）是最早克隆到的導(dǎo)致無限花序向有限花序變異的花序形態(tài)基因[12]。在隨后的研究中發(fā)現(xiàn)，不同物種的直系同源基因也與植株從無限花序向有限花序變異相關(guān)，包括擬南芥（）[17]、番茄（）[18]、煙草（）[19]、黑麥草[20]和豌豆[21]，近年來報(bào)道的柑橘[22]、水稻[23]、蘋果[24]等物種中的/同源基因均被認(rèn)為是控制花序變異的關(guān)鍵基因。在一些物種的有限花序突變體中，已經(jīng)定位了基因所在的關(guān)鍵區(qū)間：如在芝麻中，有限花序調(diào)控基因定位到連鎖群LG8上18.0—19.2 cM的遺傳區(qū)間[15]；蕓薹屬人工合成芥菜型油菜中的有限花序突變體[25-26]，其突變基因定位到B5染色體上；甘藍(lán)型油菜中，通過小孢子培養(yǎng)得到的一個(gè)有限花序雙單倍體（DH）株系，經(jīng)遺傳分析發(fā)現(xiàn)有限花序的遺傳模式為隱性單基因調(diào)控，其調(diào)控基因定位到A10染色體68 kb的物理區(qū)段，預(yù)測(cè)為關(guān)鍵候選基因[27]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】盡管目前已經(jīng)在若干無限花序物種中發(fā)現(xiàn)了有限花序突變體，并且相關(guān)基因已經(jīng)被定位甚至克隆，但在油菜上關(guān)于有限花序突變體及相關(guān)遺傳機(jī)制的研究鮮見報(bào)道[27]?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本研究發(fā)現(xiàn)了一個(gè)與前人報(bào)道不同的自然產(chǎn)生的油菜有限花序突變體（，），基于高通量測(cè)序平臺(tái)對(duì)突變體和野生型以及F2代的2個(gè)極端混合池開展全基因組重測(cè)序，定位與油菜有限花序性狀顯著關(guān)聯(lián)的區(qū)域，并通過基因克隆測(cè)序篩選關(guān)鍵候選基因，為適合機(jī)械化收獲的油菜新品種培育提供新思路和新材料，同時(shí)也為揭示油菜有限花序遺傳機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

2008年在育種材料中發(fā)現(xiàn)了一株油菜有限花序自然突變體，連續(xù)5年套袋自交獲得穩(wěn)定遺傳的突變株系FM8。2015年以突變株系FM8與正常自交系FM7正反交獲得F1和F2。從FM8為母本與FM7雜交構(gòu)建F2分離群體中挑選20個(gè)有限花序性狀明顯的F2單株和20個(gè)正常F2單株構(gòu)建成突變類型混合池和野生類型混合池，用于有限花序性狀基因定位。

1.2 田間試驗(yàn)和性狀調(diào)查

經(jīng)過多年田間觀察，確定油菜有限花序性狀的評(píng)價(jià)方法如下：花期花序生長(zhǎng)軸頂端發(fā)育形成頂生花，花序繼續(xù)生長(zhǎng)和后續(xù)花蕾形成均受阻，結(jié)角期表現(xiàn)出主枝和側(cè)枝花序頂端沒有出現(xiàn)無效角果，有封頂?shù)奶卣鳌?/p>

2016年花期，F(xiàn)1單株套袋，收獲自交種子獲得F2。2016年10月5日采用穴盤育苗方式播種F2以及2個(gè)親本種子，11月10日移栽到浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院試驗(yàn)大田。田間種植方式為3行區(qū)，行距為0.4 m，株距為0.3 m。田間管理按照當(dāng)?shù)爻Ｒ?guī)方式進(jìn)行，水平一致。初花期觀察每個(gè)F2單株花序生長(zhǎng)情況，并掛牌記錄，終花期再次觀察確認(rèn)F2單株的花序狀態(tài)。

1.3 極端混合池構(gòu)建與基因分型

F2群體中挑選20株有限花序性狀明顯的突變單株和20株野生類型單株，連同2個(gè)親本FM8和FM7，取幼嫩植株葉片0.15 g，利用OMEGA HP Plant DNA提取試劑盒提取DNA。將20個(gè)有限花序F2單株和20個(gè)野生型F2單株的DNA分別等量混合，構(gòu)建成突變性狀混合池和野生類型混合池。2個(gè)混合池DNA和2個(gè)親本DNA按照標(biāo)準(zhǔn)流程構(gòu)建文庫，并通過illumina HiSeqTMPE150對(duì)2個(gè)混合池和兩親本開展20×和10×覆蓋度的全基因組重測(cè)序。測(cè)序得到的原始序列去除接頭和低質(zhì)量序列，再通過BWA軟件[28]（參數(shù)：mem-t4-k32-M）比對(duì)到油菜參考基因組（http://www. genoscope.cns.fr/brassicanapus/data/Brassica_napus_v4.1. chromosomes.fa.gz）。比對(duì)結(jié)果經(jīng)SAMTOOLS的rmdup命令去除重復(fù)[29]。采用GATK3.3軟件的UnifiedGenotyper模塊進(jìn)行多個(gè)樣本單核苷酸多態(tài)性（SNPs）標(biāo)記和插入缺失（InDels）標(biāo)記的檢測(cè)，使用VariantFiltration進(jìn)行過濾[30]，并利用ANNOVAR軟件對(duì)SNP和InDel進(jìn)行注釋[31]。

1.4 基于混合池的有限花序性狀基因定位與候選基因預(yù)測(cè)

基于基因分型的結(jié)果，篩選親本間純合差異的多態(tài)性位點(diǎn)。選擇親本FM8作為參照親本，參考Takagi等[32]的方法計(jì)算2個(gè)子代混合池在每個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)上的SNP頻率（SNP-index）。為減少測(cè)序錯(cuò)誤和比對(duì)錯(cuò)誤造成的影響，對(duì)計(jì)算出SNP-index后的親本多態(tài)性位點(diǎn)進(jìn)行過濾，過濾標(biāo)準(zhǔn)如下：（1）2個(gè)子代中SNP-index都小于0.3，并且SNP深度都小于7的位點(diǎn)，過濾掉；（2）1個(gè)子代SNPindex缺失的位點(diǎn)，過濾掉。隨后，計(jì)算2個(gè)子代SNP-index作差（△SNP-index）。選擇1 Mb為窗口、1 kb為步長(zhǎng)對(duì)△SNP-index在各個(gè)染色體上的分布進(jìn)行作圖，選取95%置信水平作為篩選的閾值，置信水平以上的窗口作為候選區(qū)間。為了預(yù)測(cè)關(guān)聯(lián)區(qū)間內(nèi)的候選基因，我們收集了擬南芥中與花序和花發(fā)育相關(guān)的基因（數(shù)據(jù)來源于BRAD數(shù)據(jù)庫http://brassicadb.org/brad/），利用blast2go[33]中的blastall將這些基因的CDS序列與101 040個(gè)油菜基因的CDS序列進(jìn)行比對(duì)，以比對(duì)覆蓋率（>70%）和值（<1e-50）為標(biāo)準(zhǔn)尋找對(duì)應(yīng)到油菜上的同源基因。如果花序和花發(fā)育相關(guān)基因?qū)?yīng)到油菜上的同源基因位于顯著關(guān)聯(lián)的候選區(qū)間，則認(rèn)為該基因?yàn)楹蜻x基因。

1.5 候選基因分子克隆和序列分析

參照油菜基因組數(shù)據(jù)庫（http:// brassicadb. org/brad/）公布的目的基因序列設(shè)計(jì)引物（電子附表1）。以有限花序和無限花序親本，以及有限花序和無限花序的F2株系的基因組DNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增，電泳后回收純化，連接、轉(zhuǎn)化，PCR檢測(cè)，挑選出與預(yù)測(cè)片段分子量大小一致的陽性克隆送到公司測(cè)序。

2 結(jié)果

2.1 油菜有限花序性狀的形態(tài)觀察與鑒定

油菜有限花序突變體在初花期表現(xiàn)出主花序和側(cè)枝花序頂部形成1個(gè)或者若干個(gè)柱頭外露的頂生花（圖1-A），此類型頂生花不僅自身無法正常開花，同時(shí)也限制了花序生長(zhǎng)和后續(xù)花蕾形成。結(jié)角期，突變體表現(xiàn)出主枝和側(cè)枝有封頂?shù)奶卣鳎▓D1-C）。由于存在營(yíng)養(yǎng)競(jìng)爭(zhēng)，無限花序頂端角果結(jié)實(shí)率往往顯著降低，產(chǎn)生無效角果（圖1-D）。而有限花序頂部通常不存在無效角果（圖1-C）。由于有限花序的形成，突變體表現(xiàn)出株高降低、成熟期更一致并且熟期提早等有利特征。除此之外，有限花序突變體與野生型油菜的其他農(nóng)藝性狀并無明顯差別，表現(xiàn)為植株粗壯，葉色較深，分裂較淺，葉面光滑，初花期為3月10日。除頂端花蕾柱頭外露，其他部位的花器發(fā)育良好，花瓣平滑。

A：花期的油菜有限花序突變體；B：花期的野生型油菜；C：結(jié)角期的油菜有限花序突變體；D：結(jié)角期的野生型油菜

2.2 油菜有限花序性狀的遺傳分析

以穩(wěn)定遺傳的油菜有限花序株系FM8作為親本，與野生型油菜自交系FM7正反交，F(xiàn)1均表現(xiàn)為野生型無限花序，說明該有限花序突變?yōu)殡[性突變。突變株系FM8與正常自交系FM7構(gòu)建的F2群體中出現(xiàn)了有限花序與無限花序的分離，卡方測(cè)驗(yàn)表明分離比符合13﹕3分離（表1），說明油菜有限花序性狀受2對(duì)隱性基因和1對(duì)隱性上位抑制基因互作控制。

2.3 極端群體混合池構(gòu)建與測(cè)序數(shù)據(jù)分析

對(duì)20個(gè)有限花序F2單株和20個(gè)無限花序F2單株構(gòu)建的混合池以及兩親本開展全基因組重測(cè)序，總共得到53.17 G的原始數(shù)據(jù)。過濾后4個(gè)樣本的有效序列數(shù)據(jù)量在8 722.79—17 717.90 M，總數(shù)據(jù)量為53.026 G。測(cè)序數(shù)據(jù)Q20＞96.9%，Q30＞95.29%，GC含量在37.35%—38.73%，測(cè)序數(shù)據(jù)有95.36%—98.56%的序列可以成功比對(duì)到參考基因組。由此可知，所有樣本的數(shù)據(jù)量足夠，測(cè)序質(zhì)量合格，GC分布正常，測(cè)序數(shù)據(jù)與油菜參考基因組比對(duì)結(jié)果正常，可用于后續(xù)的變異檢測(cè)及性狀的基因定位。

表1 有限花序突變株系與野生型雜交組合后代分離比例

將突變體親本FM8和野生型親本FM7測(cè)序結(jié)果比較，共獲得1 186 750個(gè)SNPs和764 900個(gè)InDels。親本間檢測(cè)到的SNPs明顯多于InDels。根據(jù)變異發(fā)生的位置進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)，無論SNPs變異還是InDels變異，位于基因非編碼區(qū)的多態(tài)性位點(diǎn)顯著多于基因編碼區(qū)?；诨蚍中偷慕Y(jié)果，篩選2個(gè)親本間純合差異的標(biāo)記，最終挑選出137 759個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)，包括30 123個(gè)SNPs和107 636個(gè)InDels，用于后續(xù)基因定位。這些多態(tài)性位點(diǎn)在染色體間呈現(xiàn)非均勻分布，其中A07染色體擁有最豐富的多態(tài)性位點(diǎn)，而A04染色體擁有最少的多態(tài)性位點(diǎn)。

2.4 油菜有限花序性狀基因定位

分析2個(gè)混合池△SNP-index，用于甘藍(lán)型油菜有限花序性狀的基因定位。定位結(jié)果顯示，分布于甘藍(lán)型油菜5條染色體的7個(gè)區(qū)域出現(xiàn)了超過臨界值水平的極顯著峰，說明這些區(qū)域可能包含調(diào)控油菜有限花序變異的基因（圖2）。這7個(gè)顯著關(guān)聯(lián)區(qū)間在油菜基因組上的分布為chr.A08：12.36—12.51 Mb、chr.A09：26.01—26.05 Mb、chr.A09：30.34—30.68 Mb、chr.A10：14.43—17.37 Mb、chr.C08：27.38—27.75 Mb、chr.C09：45.80—46.45 Mb和chr.C09：46.54—46.60 Mb。這些顯著關(guān)聯(lián)區(qū)間覆蓋的染色體長(zhǎng)度為0.04—3.04 Mb。其中，染色體A10關(guān)聯(lián)區(qū)間頂點(diǎn)峰值最高，暗示該區(qū)間可能具有引起油菜有限花序變異的主效基因。

2.5 染色體A10主效關(guān)聯(lián)區(qū)域與C09關(guān)聯(lián)區(qū)域的微共線性比較研究

從表2可以看出，A10染色體關(guān)聯(lián)區(qū)間對(duì)應(yīng)到擬南芥基因組上的共線性區(qū)段（chr.5：0—4.02 Mb）完全覆蓋并延伸了C09染色體2個(gè)關(guān)聯(lián)區(qū)間對(duì)應(yīng)到擬南芥上的共線性區(qū)段（chr.5：3.10—3.57 Mb和chr.5：2.98—3.04 Mb）。進(jìn)一步分析A10上的關(guān)聯(lián)區(qū)間發(fā)現(xiàn)，該區(qū)間內(nèi)的14.63—15.07 Mb區(qū)段與C09的2個(gè)關(guān)聯(lián)區(qū)間對(duì)應(yīng)到擬南芥基因組的相同位置（圖3），這說明A10染色體14.36—15.07 Mb的關(guān)聯(lián)區(qū)域與C09染色體的2個(gè)候選區(qū)域具有高度同源性。油菜A和C亞基因組上的同源區(qū)域同時(shí)被檢測(cè)出與油菜有限花序性狀顯著連鎖不僅證實(shí)了這三個(gè)候選區(qū)間的可信性，并且可以推測(cè)這三個(gè)區(qū)域?qū)τ筒擞邢藁ㄐ虻恼{(diào)控可能由同源遺傳因子決定。

表2 有限花序性狀7個(gè)關(guān)聯(lián)區(qū)間對(duì)應(yīng)到擬南芥基因組上的共線性區(qū)段

2.6 油菜有限花序性狀候選基因預(yù)測(cè)與克隆

通過數(shù)據(jù)庫收集擬南芥與花序和花發(fā)育相關(guān)的基因（數(shù)據(jù)來源于BRAD數(shù)據(jù)庫http://brassicadb.org/ brad/），并比對(duì)得到這些基因?qū)?yīng)到油菜基因組上的同源基因（電子附表2）。8個(gè)基因被鑒定到位于A08、A09、A10、C08和C09的5個(gè)關(guān)聯(lián)區(qū)間（表3）：（，）、（）、（，）、（）、（）、（，）、（）和（，）。其中，是花序形態(tài)關(guān)鍵基因，被錨定到具有最高峰值的A10染色體主效關(guān)聯(lián)區(qū)間，因此，推測(cè)為調(diào)控有限花序性狀的關(guān)鍵基因。

紅色曲線代表利用滑動(dòng)窗口計(jì)算得到的整個(gè)染色體上ΔSNP-index的變化趨勢(shì)。綠色虛線代表顯著性閾值，如果一個(gè)區(qū)域的滑動(dòng)窗口曲線出現(xiàn)明顯的峰谷并超過臨界值，則認(rèn)為這個(gè)區(qū)域與性狀顯著關(guān)聯(lián)，每個(gè)點(diǎn)應(yīng)對(duì)一個(gè)SNP，橫坐標(biāo)代表每個(gè)SNP在油菜基因組上的物理位置，縱坐標(biāo)代表ΔSNP-index 值

利用有限花序親本FM8和有限花序F2株系，野生型親本FM7和野生型F2株系的基因組DNA對(duì)有限花序性狀關(guān)聯(lián)區(qū)間內(nèi)的8個(gè)潛在候選基因進(jìn)行基因克隆和測(cè)序。結(jié)果顯示，有3個(gè)潛在候選基因發(fā)生了編碼區(qū)的堿基序列變異，并最終導(dǎo)致氨基酸序列變異：位于A10染色體上的主效關(guān)聯(lián)區(qū)間內(nèi)的，有限花序親本在其編碼區(qū)存在2個(gè)SNPs變異，并最終導(dǎo)致TFL1蛋白序列發(fā)生了2個(gè)氨基酸的變異（圖4）；位于A09染色體關(guān)聯(lián)區(qū)間內(nèi)的，有限花序親本在其編碼區(qū)存在6個(gè)堿基的插入和22個(gè)SNPs變異，并最終導(dǎo)致FVE蛋白序列發(fā)生了2個(gè)氨基酸的插入和8個(gè)氨基酸序列變異（圖4）；位于C08染色體關(guān)聯(lián)區(qū)間內(nèi)的，有限花序親本在其編碼區(qū)發(fā)生了31個(gè)堿基片段的丟失，導(dǎo)致第146—174位置的氨基酸序列發(fā)生變異，并且第175位置發(fā)生氨基酸終止編碼（圖4）。

3 討論

3.1 di1突變體是一個(gè)新型的油菜有限花序突變體

在蕓薹屬作物中已有關(guān)于有限花序變異的報(bào)道。Kaur等[26]在遠(yuǎn)緣雜交獲得的人工合成芥菜型油菜后代中發(fā)現(xiàn)了受隱性單基因控制的芥菜型油菜有限花序突變體。Li等[27]在甘藍(lán)型油菜不同生態(tài)型雜交的小孢子培養(yǎng)后代中也發(fā)現(xiàn)了受隱性單基因控制的甘藍(lán)型油菜有限花序突變體。與前人報(bào)道的蕓薹屬中的有限花序突變體進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)：（1）從遺傳模式上看，本研究中的油菜有限花序突變受2對(duì)隱性基因和1對(duì)隱性上位抑制基因互作控制。這個(gè)遺傳模式與前人報(bào)道的蕓薹屬中的有限花序突變體并不完全相同。（2）從突變體產(chǎn)生方式看，上述得到的芥菜型油菜和甘藍(lán)型油菜突變體為遠(yuǎn)緣雜交或者不同生態(tài)型間雜交誘導(dǎo)產(chǎn)生，而本研究中的油菜有限花序突變體為自然突變產(chǎn)生。（3）從基因定位結(jié)果看，芥菜型油菜有限花序調(diào)控基因定位在B5染色體1.9 cM的區(qū)段，但其調(diào)控基因尚未報(bào)道。Li等[27]報(bào)道的甘藍(lán)型油菜有限花序調(diào)控基因定位于A10染色體，預(yù)測(cè)為候選基因，該基因與本研究預(yù)測(cè)得到的位于主效區(qū)域的候選基因相同。然而，除此之外，本研究還定位得到其他調(diào)控位點(diǎn)，這與該性狀受2對(duì)隱性基因和1對(duì)隱性上位抑制基因互作控制的遺傳模式吻合。（4）盡管在本研究和Li等[27]的報(bào)道中均為關(guān)鍵候選基因，但變異位點(diǎn)存在差異。Li等[27]報(bào)道中蛋白序列的第46和第47位的氨基酸產(chǎn)生變異，而本研究蛋白變異位點(diǎn)位于第37位和第139位。綜上所述，本研究得到的油菜有限花序突變體與前人報(bào)道的有限花序突變體并不相同，該新型油菜有限花序突變體的發(fā)現(xiàn)對(duì)于拓寬甘藍(lán)型油菜的變異類型具有一定意義。針對(duì)預(yù)測(cè)得到的候選基因開展更加深入的功能驗(yàn)證將在后續(xù)研究中繼續(xù)開展。

左右兩邊綠色線條代表A10關(guān)聯(lián)區(qū)間部分區(qū)段和C09關(guān)聯(lián)區(qū)間所所對(duì)應(yīng)的物理位置，中間紅色和綠色線條為兩者對(duì)應(yīng)到擬南芥基因組上的物理位置，其中紅色部分代表A10關(guān)聯(lián)區(qū)間部分區(qū)段和C09關(guān)聯(lián)區(qū)間對(duì)應(yīng)到擬南芥基因組相同位置

表3 關(guān)聯(lián)區(qū)間內(nèi)的候選基因預(yù)測(cè)

箭頭和虛線區(qū)域代表氨基酸序列發(fā)生變異的位置

3.2 di1突變體有限花序候選基因的預(yù)測(cè)

利用本研究定位到的7個(gè)關(guān)聯(lián)區(qū)間總共預(yù)測(cè)得到8個(gè)潛在候選基因，包括1個(gè)、3個(gè)、2個(gè)、1個(gè)和1個(gè)。、、、和在擬南芥花序和花形態(tài)建成的過程中具有非常重要的作用[17,34-41]（圖5）?；蚩寺〗沂居邢藁ㄐ蛲蛔凅w中的、和發(fā)生了基因編碼區(qū)的堿基序列變異，并最終導(dǎo)致氨基酸序列變異。根據(jù)前人研究報(bào)道，屬于磷脂酰乙醇胺結(jié)合蛋白家族，是維持花序分生組織特性所必需的，有抑制開花的作用[17]，因此，在植物從營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)到生殖生長(zhǎng)這一成花轉(zhuǎn)化過程中扮演非常重要的角色[42-44]。在擬南芥中，的突變將導(dǎo)致花序分生組織轉(zhuǎn)化為花分生組織，形成單個(gè)的頂生花，最終使得花序由無限花序變?yōu)橛邢藁ㄐ騕11,17,45]。在豌豆和豇豆中的作用均被揭示為維持花序分生組織的無限生長(zhǎng)習(xí)性，該基因的突變將產(chǎn)生有限花序類型的豌豆和豇豆[13,21]。此外，金魚草[12]、番茄[18]、煙草[19]、黑麥草[20]、柑橘[22]、水稻[23]、蘋果[24]等多個(gè)物種中均報(bào)道了由同源基因變異導(dǎo)致的有限花序突變。本研究中，位于A10染色體主效關(guān)聯(lián)區(qū)域內(nèi)，并且該基因在野生型和突變體中存在編碼區(qū)和蛋白序列的變異，因此，推斷對(duì)控制油菜有限花序變異具有關(guān)鍵作用。是自主開花途徑中的一個(gè)關(guān)鍵基因，編碼了一個(gè)同源基因，跟組蛋白的脫乙酞化復(fù)合體的形成有關(guān)。它的存在對(duì)FLC染色體組蛋白去乙酞化是必要的，F(xiàn)LC染色體組蛋白去乙酞化后，F(xiàn)LC由活化狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)榉腔罨癄顟B(tài)，從而啟動(dòng)植物開花[46]。劉新慶等[47]將擬南芥突變體與野生型相比較發(fā)現(xiàn)在野生型植株正常開花的階段突變體植株尚未發(fā)育出花序，因此認(rèn)為突變體影響了擬南芥花序的發(fā)育，并最終導(dǎo)致晚花表型。位于光周期途徑，編碼AP2/EREBP轉(zhuǎn)錄因子，但其作用卻獨(dú)立于，是通過與miR172的結(jié)合來抑制表達(dá)，最終抑制成花[48]。盡管這些基因位于不同的途徑，但均可以作用于下游的花序分生組織特異基因，最終參與到花序和花的形態(tài)建成（圖5）。

4 結(jié)論

油菜有限花序性狀受2對(duì)隱性基因和1對(duì)隱性上位抑制基因互作控制。有7個(gè)區(qū)間與有限花序性狀顯著關(guān)聯(lián)。和被推斷為有限花序性狀的候選基因。

箭頭表示促進(jìn)作用，線段表示抑制作用；基因右上角星號(hào)代表候選基因

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（責(zé)任編輯 李莉）

Location and Mapping of the Determinate Growth Habit ofby Bulked Segregant Analysis (BSA) Using Whole Genome Re-sequencing

ZHANG YaoFeng, ZHANG DongQing, YU HuaSheng, LIN BaoGang, HUA ShuiJin, DING HouDong, FU Ying

(Institute of Crop and Nuclear Technology Utilization, Zhejiang Academy of Agricultural Sciences, Hangzhou, 310021)

【Objective】Mechanical harvesting has been one of the major goals of rapeseed breeding and genetic research worldwide. A natural and novel rapeseed mutant with determinate inflorescence()was identified in this study. Genetic analysis, gene mapping, candidate gene prediction and gene cloning were used to elucidate the genetic control of determinate inflorescence.【Method】For genetic analysis, reciprocalcrosses were performed between determinate inflorescence line FM8 and wild type FM7, and the inflorescence morphology was observed for F1and F2progenies. Two pools with 202lines and 20 wild type lines were constructed. For gene mapping of determinate inflorescence, 20× and 10× depth of whole genome re-sequencing were conducted for the two pools and parental lines, respectively. The associated loci were aligned to the genome offor synteny blocks searching. Potential candidate genes for determinate inflorescence were predicted by annotation analyses of genes within the physical boundaries of the associated regions.Gene cloning was used to identify polymorphisms and screen candidate gene(s). 【Result】Themutant showed a single fruiting body or a cluster of fruiting bodies at the top of the inflorescence axis, and the growth of inflorescence was hampered. The F1progenies from the reciprocalcrosses were indeterminate, and the trait segregation of indeterminate inflorescence and determinate inflorescence among F2progenies fit the 13:3 segregation ratio, assuming that the determinate inflorescence was controlled by two pairs of recessive duplicate genes interacting with one pair of recessive epistatic inhibitor genes. Whole genome re-sequencing of two pools and two parental lines identified 30123 homozygous SNPs and 107636 homozygous InDels. Seven significantly associated loci were mapped on chromosomes of A08, A09, A10, C08 and C09. Of which, the locus on chromosome A10 not only exhibited the highest peak, but alsoshowed homologous with the two loci on chromosome C09 by synteny analysis. Genes of(),(),(),() and() were predicted as potential candidate genes.Gene cloning identified coding region polymorphisms and protein polymorphisms for genes of,and.【Conclusion】The determinate inflorescence ofmutant was controlled by two pairs of recessive duplicate genes interacting with one pair of recessive epistatic inhibitor genes. Seven loci were significantly associated with determinate inflorescence. Of which, the loci on chromosomes A10 and C09 were homologous.,andshowed coding region polymorphisms and protein polymorphisms, and were deduced to be candidate genes for determinate inflorescence.

; determinate inflorescence; gene mapping; associated regions; candidate genes

2018-01-18；

2018-05-28

浙江省農(nóng)業(yè)（糧食）新品種選育重大科技專項(xiàng)-油料新品種選育（2016C02050-8）、國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃“七大農(nóng)作物育種”（2016YFD0101306）、2017年農(nóng)業(yè)科技發(fā)展項(xiàng)目（10102000317CC1201G/005）

張堯鋒，E-mail：y.f.zhang@163.com。

傅鷹，Tel：0571-86404096；E-mail：fy97@163.com

10.3864/j.issn.0578-1752.2018.16.001