用正相高效液相色譜法測定經(jīng)澄清劑處理后一貫煎中梓醇含量的效果觀察

白 蘭，鄭 宇

（1.四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院·四川省人民醫(yī)院，電子科技大學(xué)附屬醫(yī)院·四川省人民醫(yī)院，個體化藥物治療四川省重點(diǎn)實驗室，四川 成都610072；2.成都中醫(yī)藥大學(xué)，四川 成都 610075）

一貫煎是一種具有滋陰疏肝功效的中藥方。該方是由北沙參、麥冬、當(dāng)歸、生地黃、枸杞、川楝子六味中藥組成的，主要用于治療慢性肝炎、肝硬化、慢性萎縮性胃炎、胃及十二指腸球部潰瘍等疾病[1]。有研究者認(rèn)為[2-3]，除了多糖以外，一貫煎中的梓醇也屬于該方的有效成分。因此，本次實驗使用ZTC1+1天然澄清劑Ⅲ型處理一貫煎的提取液，同時保留該方中的多糖及梓醇等非極性活性物質(zhì)，旨在尋找一種測定經(jīng)澄清劑處理后一貫煎中梓醇含量的有效方法?，F(xiàn)報告如下。

1 儀器與試劑

1.1 實驗儀器

本次實驗使用的儀器是waters2690型正相高效液相色譜儀、2996型二極管陣列檢測器、美國waters公司生產(chǎn)的Empower Chromatography Manager 色譜數(shù)據(jù)工作站、德國Sartorius 公司生產(chǎn)的BP 211D 型十萬分之一電子分析天平、蒸發(fā)皿、水浴鍋、恒溫鼓風(fēng)干燥箱等。

1.2 實驗試劑

本次實驗使用的試劑是中國藥品生物制品檢定所生產(chǎn)的梓醇對照品、迪馬公司生產(chǎn)的甲醇（色譜純）、反滲透超純水、分析純。

2 實驗方法

2.1 色譜條件

本次實驗使用的色譜柱是迪馬公司生產(chǎn)的ShimpackCLC-ODS柱（6.00mm×15cm，5μm），其流動相為甲醇-水（4:96），其檢測波長為205nm，其流速為1.2 ml/min，其柱溫為28℃，其進(jìn)樣量為10μl。按照梓醇色譜峰計算理論塔板數(shù)，其理論塔板數(shù)應(yīng)不低于4000。

2.2 制備標(biāo)準(zhǔn)溶液的方法

精密稱取適量的梓醇對照品，將其加入到濃度為1%的甲醇中進(jìn)行溶解，將其配置成濃度為70μg/ml的標(biāo)準(zhǔn)溶液。

2.3 制備供試品溶液的方法

按照一貫煎的處方稱取藥材，加10倍的清水煎煮2次，每次煎煮1.5 h。對所得的藥液進(jìn)行濾過處理。將兩次煎煮所得的藥液合并后，對這些藥液進(jìn)行濃縮處理，使藥材與藥液體積的比例為1:1，以備用。將濃縮后的藥液按照1:8的比例進(jìn)行稀釋，然后對其進(jìn)行水浴處理（溫度為80℃），并進(jìn)行攪拌。將稀釋后的濃縮液分為A組和B組。在這兩組溶液中分別加入ZTC 1+1天然澄清劑Ⅲ型。兩組溶液加入ZTC 1+1天然澄清劑Ⅲ型的間隔時間為120 min。A組溶液中ZTC 1+1天然澄清劑Ⅲ型的加入量為2%，B組溶液中ZTC 1+1天然澄清劑Ⅲ型的加入量為4%。將兩組溶液持續(xù)攪拌30 min后取出，將其放在4℃的環(huán)境中靜置24 h，對其進(jìn)行濾過處理。對濾液進(jìn)行濃縮，使藥材與藥液體積的比例為1:1，得到經(jīng)ZCT 1+1天然澄清液Ⅲ型處理后的一貫煎樣品。精密量取5 ml的一貫煎樣品，將其置于容量為25 ml的量瓶中。在量瓶中加入適量的甲醇。對量瓶中的溶液進(jìn)行超聲（功率250 W，頻率20 kHz）處理30 min，將溶液放冷。在量瓶中加入甲醇至刻度后，將量瓶中的溶液搖勻。使用直徑為0.45μm的微孔濾膜對溶液進(jìn)行濾過處理。精密量取1 ml的續(xù)濾液，將續(xù)濾液放到容量為10 ml的量瓶中，加水至刻度，然后將量瓶中的溶液搖勻，所得的藥液即為供試品溶液。按照一貫煎處方中藥物的用量稱取除生地黃以外的其他藥材，參照上述方法制備陰性樣品溶液。

3 實驗結(jié)果

3.1 進(jìn)行線性關(guān)系實驗的結(jié)果

分別精密量取 4.0μl、6.0μl、8.0μl、10.0μl、12.0μl的梓醇對照品溶液，將其分別注入到正相高效液相色譜儀中，測定梓醇對照品的峰面積。以梓醇對照品的峰面積作為縱坐標(biāo)，以梓醇對照品的進(jìn)樣量作為橫坐標(biāo)，求解梓醇對照品的線性回歸方程：Y= 1758758.98X+1115.60，r=0.9999。結(jié)果顯示，梓醇對照品的進(jìn)樣量在0.28～0.84μg時的線性關(guān)系良好。

3.2 進(jìn)行專屬性實驗的結(jié)果

分別精密量取對照品溶液、供試品溶液、陰性樣品溶液各10μl，將這些溶液注入到正相高效液相色譜儀中。結(jié)果顯示，在供試品溶液的色譜中，在與對照品溶液色譜相對應(yīng)的位置上，有相同的保留時間，且對陰性樣品溶液的色譜無干擾，說明本法具有良好的專屬性。詳情見圖1。

圖1 一貫煎中梓醇的HPLC圖

3.3 進(jìn)行精密度實驗的結(jié)果

精密量取同一濃度的對照品溶液，按照2.1中的色譜條件，重復(fù)進(jìn)樣5次，記錄并計算其峰面積。結(jié)果顯示，對照品溶液的RSD=1.02%，表明本法的精密度良好。

3.4 進(jìn)行重復(fù)性實驗的結(jié)果

精密量取5 ml的同一批樣品，按照2.3中的方法制備6份供試品溶液，在2.1中的色譜條件下，記錄并計算供試品溶液的峰面積。結(jié)果顯示，在供試品溶液中梓醇的含量為5.176 mg/ml時，其RSD=2.06%，說明本法的重復(fù)性良好。

3.5 進(jìn)行穩(wěn)定性實驗的結(jié)果

取3.3中的一份供試品溶液，在2.1中的色譜條件下，在第0 h、第2 h、第4 h、第8 h、第12 h時進(jìn)行檢測，記錄并計算供試品溶液的峰面積。結(jié)果顯示，供試品溶液的RSD=1.91%，說明供試品溶液在常溫下放置12 h的穩(wěn)定性良好。

3.6 進(jìn)行加樣回收率實驗的結(jié)果

分別精密量取2.5 ml 已知含量的9份同一批樣品，將其分為三組，每組3份樣品。在每組樣品中分別加入一定量的對照品溶液，按照2.3中的方法制備供試品溶液，在2.1中的色譜條件下記錄供試品溶液的峰面積，計算供試品溶液的回收率。結(jié)果顯示，供試品溶液的平均回收率為102.46%，其RSD=1.96%。

3.7 進(jìn)行樣品濃度實驗的結(jié)果

取3批樣品，分別按照2.3的方法制備供試品溶液，在2.1的色譜條件下進(jìn)樣，使用外標(biāo)法計算樣品中梓醇的含量。結(jié)果顯示，樣品中梓醇的含量分別為5.176 mg/ml、5.386 mg/ml、4.908 mg/ml。

4 討論

在進(jìn)行本次實驗時，課題組參考了相關(guān)文獻(xiàn)，使用不同比例的乙腈和水作為流動相，或在供試品溶液中加入不同濃度的磷酸溶液，分離的效果均不理想。這可能是由于在經(jīng)澄清劑處理后的一貫煎供試品溶液中保留的多糖成分可對梓醇含量的測定造成影響。經(jīng)過更換色譜柱、改變流動相的組成及比例等方式，課題組最終找到一種測定經(jīng)澄清劑處理后一貫煎中梓醇含量的有效方法，即正相高效液相色譜法。該檢測方法的專屬性強(qiáng)，測定的結(jié)果準(zhǔn)確，可為對一貫煎制劑的定量控制提供參考。