Wnt/β-catenin通路在脈沖強(qiáng)磁場(chǎng)促神經(jīng)干細(xì)胞增殖中的作用初探

龍興藍(lán)，許濤，鄒麗麗 ，蔣婷，彭濤，孫衢骎

神經(jīng)干細(xì)胞(neural stem cells，NSCs)是一種可以自我增殖、遷移并且能向神經(jīng)元、少突膠質(zhì)細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞定向分化的干細(xì)胞[1-2]。NSCs的這種自我增殖及定向分化的特性，使其在神經(jīng)系統(tǒng)疾病中的應(yīng)用逐漸增多，特別是在退行性神經(jīng)系統(tǒng)疾病中，如帕金森病等[3-4]。在疾病的治療中NSCs的作用主要有兩種，一種是替代治療[5]，另一種是基因治療[6]。上述兩種方法都需要將大量的NSCs移植到神經(jīng)系統(tǒng)的相應(yīng)部位以發(fā)揮作用。然而NSCs為終末分化前體細(xì)胞[7]，其來(lái)源少，生長(zhǎng)緩慢，增殖能力較弱，獲取、培養(yǎng)與基因修飾都很困難，使大量獲取NSCs成為困難，不能滿(mǎn)足各種研究對(duì)其的需要。在前期實(shí)驗(yàn)中我們發(fā)現(xiàn)脈沖強(qiáng)磁場(chǎng)作為一種物理方法可以促進(jìn)NSCs增殖[8-9]，在場(chǎng)強(qiáng)4T，頻率0.1Hz，刺激次數(shù)8次時(shí)，此種作用最明顯。wnt/β-catenin通路是NSCs增殖與分化過(guò)程中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，在4T、0.1Hz、8次條件下的脈沖強(qiáng)磁場(chǎng)刺激過(guò)程中，可以觀察到β-catenin的表達(dá)增加。雖然脈沖強(qiáng)磁場(chǎng)可以促進(jìn)NSCs增殖，但是其機(jī)制還不明晰，因此我們需要進(jìn)一步明確wnt/β-catenin通路在脈沖強(qiáng)磁場(chǎng)促NSCs增殖中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料 ①實(shí)驗(yàn)動(dòng)物: 出生72h以?xún)?nèi)新生的SD大鼠，不限雌雄，購(gòu)買(mǎi)于華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。②實(shí)驗(yàn)試劑：DMEM/F12高糖培養(yǎng)基(Hyclone公司)，B27(美國(guó)nitrogen公司)，大鼠堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(basic fibroblastgrowth factor, bFGF) (美國(guó)Gibco公司)，人表皮生長(zhǎng)因子(epidermal growth factor, EGF)(美國(guó)Gibco公司)，Trizol試劑(美國(guó)Invitrogen公司)，CCK-8試劑盒(日本同仁化學(xué)研究所)，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和qPcr試劑盒(美國(guó)Fermentas公司)。

1.2 方法 ①NSCs的取材和培養(yǎng)：采用斷頸法處死出生72h以?xún)?nèi)的SD大鼠乳鼠，然后浸泡于75%的酒精消毒。剪開(kāi)乳鼠頭皮，打開(kāi)顱骨，暴露腦組織，隨后去除表面的血管和筋膜。然后取出側(cè)腦室部位組織，并再次去除血管和筋膜。將腦組織塊剪碎成1mm3大小，并制成單細(xì)胞懸液，隨后過(guò)濾并離心。隨后用含2% B27、20ng/ml EGF、20ng/ml bFGF的新鮮培養(yǎng)基重懸沉淀，并接種在50ml培養(yǎng)瓶中。在37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每3天半量換液，每7天傳代。②NSCs免疫組化：使用4%的多聚甲醛固定細(xì)胞并自然晾干。滴加3%過(guò)氧化氫后在室溫下孵育15min，用PBS沖洗3次，然后滴加Nestin抗體4℃孵育過(guò)夜。PBS 沖洗3次，滴加聚合物輔助劑， 37℃孵育20min。再用PBS沖洗，然后加辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記二抗IgG多聚體， 37℃孵育20～30min。然后PBS沖洗4次，加DAB顯色液，顯微鏡下觀察，陽(yáng)性信號(hào)為棕黃色或棕褐色。最后使用Harris蘇木素復(fù)染，脫水及封片后在顯微鏡下拍照。3．RNAi抑制NSCs中β-catenin的表達(dá)。③構(gòu)建β-catenin shRNA 慢病毒載體: 根據(jù)Genbank中β-catenin RNA(NM_053357.2，GI：46048608)序列及查閱文獻(xiàn)后，選取長(zhǎng)度為19nt的干擾序列：β-catenin：5'-AAGATCTGAAGGCAGTCTG-3'；分別靶向β-catenin基因的第898～917位堿基。其對(duì)應(yīng)的shRNA序列的DNA序列如下(5'-3')：shRNA:GATCCCAAGATCTGAAGGCAGTCTGTCTTCAAGAGAGACAGACTGCCTTCAGATCTTTTTTTGGAT。并將其制作成能表達(dá)綠色熒光的慢病毒載體(由上海吉?jiǎng)P基因公司完成)。慢病毒轉(zhuǎn)染NSCs，并觀察不同感染復(fù)數(shù)(multiplicity of infection，MOI)值時(shí)RNAi慢病毒對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞中β-catenin mRNA的水平的影響: 將第一次傳代后并培養(yǎng)4d的104個(gè)目的細(xì)胞接種于6孔板中；加入助染劑polybrenen，使其終濃度為5μg/ml；以MOI=0、0.1、1、10的濃度，加入慢病毒，并于24h后更換新鮮培養(yǎng)基。在轉(zhuǎn)染后3d在基因水平檢測(cè)各組細(xì)胞β-catenin的表達(dá)。用Real Time PCR檢測(cè)β-catenin和內(nèi)參基因的cDNA的擴(kuò)增產(chǎn)物CT值進(jìn)行相對(duì)定量分析。用BioRad IQ5軟件制作實(shí)時(shí)PCR擴(kuò)增曲線、熔解曲線及數(shù)值分析，用GraphPad PRISM 5.0軟件制圖。并計(jì)算不同MOI時(shí)，β-catenin的抑制效果。RNAi慢病毒對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞中β-catenin mRNA的水平的影響：將前面經(jīng)慢病毒轉(zhuǎn)染后的NSCs，在轉(zhuǎn)染后3d在基因水平檢測(cè)各組細(xì)胞β-catenin的表達(dá)。用Real Time PCR檢測(cè)β-catenin和內(nèi)參基因的cDNA的擴(kuò)增產(chǎn)物CT值進(jìn)行相對(duì)定量分析。用BioRad IQ5軟件制作實(shí)時(shí)PCR擴(kuò)增曲線、熔解曲線及數(shù)值分析，用GraphPad PRISM 5.0軟件制圖。并計(jì)算不同MOI時(shí)，β-catenin的抑制效果。Real Time PCR過(guò)程：使用Trizol法提取脈沖強(qiáng)磁場(chǎng)干預(yù)后7d的NSCs的總RNA，并檢測(cè)器濃度及純度；根據(jù)所測(cè)總RNA的濃度，每組分別加入Oligo(dt)及DEPC水并于65℃溫度下變性5min。然后加入5×Reaction Buffer、RNA酶抑制劑、dNTP混合物及M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶。隨后42℃孵育60min，70℃加熱5min終止反應(yīng)；取模版cDNA，分別加入上下游引物、SYBR熒光染料和超純水，經(jīng)歷預(yù)變性、變性、退火/延伸過(guò)程；用BioRad IQ5軟件制作實(shí)時(shí)PCR擴(kuò)增曲線、熔解曲線及數(shù)值分析，用GraphPad PRISM 5.0軟件制圖。RNAi慢病毒對(duì)NSCs中β-catenin 蛋白水平的影響: 將前面經(jīng)慢病毒轉(zhuǎn)染后的NSCs，在轉(zhuǎn)染后3d用Western blot法檢測(cè)各組細(xì)胞β-catenin的表達(dá)。各組β-catenin的相對(duì)含量用β-catenin與內(nèi)參的吸光度比值來(lái)表示。Western blot過(guò)程：電泳,用RIPA裂解液，測(cè)蛋白濃度后取50ug總蛋白上樣電泳；轉(zhuǎn)膜(濕轉(zhuǎn)法)，取出凝膠根據(jù)Marker切下目的條帶，蒸餾水沖洗后，將甲醇浸泡的PVDF膜和濾紙一同浸泡于電轉(zhuǎn)緩沖液中，然后使用nestin---200mA，60min后，300mA，60min進(jìn)行轉(zhuǎn)膜；封閉，封閉液浸泡PVDF膜并封閉2h；隨后加一抗及辣根過(guò)氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)標(biāo)記的二抗；顯色曝光，將充分洗滌的PVDF膜滴加ECL底物液，孵育后顯影、定影。④脈沖強(qiáng)磁場(chǎng)干預(yù)及CCK8檢測(cè)干預(yù)后的NSCs增殖情況：將NSCs分為陰性組(轉(zhuǎn)染無(wú)抑制β-catenin表達(dá)作用的對(duì)照病毒)和實(shí)驗(yàn)組(β-catenin shRNA病毒轉(zhuǎn)染組)；在轉(zhuǎn)染后4d將NSCs移轉(zhuǎn)移進(jìn)15ml離心管中，使用條件為4T、0.1Hz、8次的脈沖強(qiáng)磁場(chǎng)干預(yù)[10-11]；干預(yù)完后更換新鮮無(wú)血清培養(yǎng)基，隨后放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。④將經(jīng)過(guò)干預(yù)后的1d、7d的各組細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液并接種于96孔板中，使每孔細(xì)胞懸液的總體積為200μl，并培養(yǎng)數(shù)小時(shí)；加入CCK8試劑20μl后孵育4h，在酶標(biāo)儀490nm波長(zhǎng)下讀取各孔OD值。每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，最后計(jì)算平均值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用GraphPad PRISM 5.0統(tǒng)計(jì)軟件分析。其中CCK8檢測(cè)的計(jì)量資料均數(shù)采用可重復(fù)的雙因素方差進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，其余結(jié)果采用單因素方差進(jìn)行分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 NSCs形態(tài)觀察及免疫組化染色 取材后在倒置顯微鏡下可觀察到懸浮于培養(yǎng)基中的絮狀組織塊。取材3d后，在懸浮的組織塊周?chē)捎^察到聚集生長(zhǎng)的NSCs，NSCs胞體呈圓形，透亮，折光性好。取材7d后，可見(jiàn)懸浮生長(zhǎng)的NSCs并聚集成球，傳代時(shí)可見(jiàn)部分神經(jīng)球融合。見(jiàn)圖1，2。采用課題組前期NSCs鑒定方法。取材后一周在光鏡下可見(jiàn)大量神經(jīng)球(圖1)，對(duì)其進(jìn)行免疫組化染色，可見(jiàn)其中含有大量棕褐色顆粒，說(shuō)明nestin的陽(yáng)性表達(dá)(圖2)，染色的部位主要在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，細(xì)胞染色均勻，大小一致，蘇木素復(fù)染后可看到深染的細(xì)胞核[9-14]。

圖1培養(yǎng)基中懸浮生長(zhǎng)的神經(jīng)球(×100)圖2nestin表達(dá)陽(yáng)性的神經(jīng)球(×40)

2.2 慢病毒轉(zhuǎn)染NSCs并觀察不同MOI值時(shí)RNAi慢病毒對(duì)NSCs中β-catenin mRNA的水平的影響

2.2.1 Real Time PCR檢測(cè)結(jié)果 轉(zhuǎn)染后3d，在MOI=0、MOI=0.1、MOI=1及MOI=10時(shí)，在基因水平使用Real Time PCR檢測(cè)NSCs mRNA的表達(dá)情況，和MOI=0時(shí)比較，在MOI=0.1、MOI=1及MOI=10時(shí)，均存在顯著性差異(均P<0.01)。說(shuō)明在MOI=0.1、MOI=1及MOI=10時(shí)，β-catenin的mRNA表達(dá)均減少，在MOI=10時(shí)最明顯。見(jiàn)圖3。

圖3不同MOI時(shí)β-catenin mRNA 表達(dá)水平，a為MOI=0，b為MOI=0.1，c為MOI=1，d為MOI=10

2.2.2 Western Blot檢測(cè)結(jié)果 β-catenin蛋白的表達(dá)水平，各組細(xì)胞GAPDH條帶寬度相似，β-catenin條帶組則在MOI=1、10時(shí)，條帶寬度明顯變細(xì)，如圖4從左至右，在MOI=0、MOI=0.1、MOI=1及MOI=10時(shí)，β-catenin蛋白表達(dá)均減少。β-catenin與內(nèi)參比值比較，可見(jiàn)從a到d，β-catenin/GAPDH呈下降趨勢(shì)，見(jiàn)圖5。

β-catenin GAPDH

圖4轉(zhuǎn)染72h后，β-catenin蛋白的表達(dá)，a為MOI=0，b為MOI=0.1，c為MOI=1，d為MOI=10。各組細(xì)胞GAPDH條帶寬度相似，β-catenin條帶組則在MOI=1、10時(shí)，條帶寬度明顯變細(xì)

圖5轉(zhuǎn)染72h后，β-catenin與內(nèi)參GAPDH的比值，a為MOI=0，b為MOI=0.1，c為MOI=1，d為MOI=10

2.3 CCK8檢測(cè)脈沖強(qiáng)磁場(chǎng)干預(yù)后的NSCs增殖情況 我們用β-catenin shRNA 序列慢病毒和陰性慢病毒(只含有GFP，但無(wú)抑制β-catenin效果)轉(zhuǎn)染NSCs，然后用4T、8次、0.1Hz的脈沖強(qiáng)磁場(chǎng)干預(yù)NSCs后，用CCK8試劑測(cè)試干預(yù)后1d、7d 時(shí)NSCs的增殖情況，與未經(jīng)干預(yù)的對(duì)比。我們發(fā)現(xiàn)陰性組在干預(yù)后1d、7d增殖明顯(P<0.05)，而實(shí)驗(yàn)組在干預(yù)前后NSCs增殖水平無(wú)明顯變化。見(jiàn)圖6,7。

與未干預(yù)組比較，*P<0.05

圖6干預(yù)后1d用CCK8法檢測(cè)NSCs增殖水平

與未干預(yù)組比較，*P<0.05

圖7干預(yù)后7d用CCK8法檢測(cè)NSCs增殖水平

3 討論

在湖北省青年科技人才基金以及國(guó)家自然科學(xué)基金的資助下，課題組前期成員利用國(guó)內(nèi)首個(gè)脈沖強(qiáng)磁場(chǎng)對(duì)NSCs的作用進(jìn)行了探索。利用華中科技大學(xué)的脈沖強(qiáng)磁場(chǎng)裝置，發(fā)現(xiàn)其對(duì)NSCs有促增殖作用，且這種作用在4T、 0.1Hz、8次的刺激條件下最明顯。隨后我們發(fā)現(xiàn)在4T、 0.1Hz、8次的刺激條件下，NSCs中的β-catenin的表達(dá)增加[12]。而wnt/β-catenin通路又與NSCs的增殖有關(guān)，因此考慮前期課題組成員發(fā)現(xiàn)的脈沖強(qiáng)磁場(chǎng)促進(jìn)NSCs增殖的效應(yīng)可能是通過(guò)wnt/β-catenin經(jīng)典通路起作用。在本實(shí)驗(yàn)中我們采用RNAi方法抑制NSCs中該通路的表達(dá)。在獲得抑制β-catenin表達(dá)的NSCs后，用4T、 0.1Hz、8次的脈沖強(qiáng)磁場(chǎng)干預(yù)NSCs。在干預(yù)后1d、7d分別用CCK8法檢測(cè)實(shí)驗(yàn)組與陰性組NSCs增殖水平，發(fā)現(xiàn)在干預(yù)前后，陰性組NSCs增殖明顯，而實(shí)驗(yàn)組NSCs增殖則無(wú)明顯變化。從圖6、7可以看到，1d時(shí)陰性組和實(shí)驗(yàn)組在干預(yù)前后細(xì)胞數(shù)量變化水平小于7d時(shí)陰性組和實(shí)驗(yàn)組在干預(yù)前后細(xì)胞數(shù)量變化。在1d、7d時(shí)干預(yù)后，陰性組細(xì)胞增殖明顯，而實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞增殖變化不明顯，說(shuō)明在抑制β-catenin表達(dá)后，實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞增殖減少，而未抑制β-catenin時(shí)，陰性組的細(xì)胞增殖明顯。

Wnt/β-catenin 信號(hào)通路在NSCs的增殖與分化過(guò)程中具有的關(guān)鍵作用，其在胚胎發(fā)育和腫瘤形成中起到非常關(guān)鍵的調(diào)控作用[13]。現(xiàn)已知wnt/β-catenin 信號(hào)通路幾乎在神經(jīng)發(fā)生的所有方面起作用，特別是經(jīng)典wnt通路。其主要涉及以下4個(gè)方面：①神經(jīng)管的發(fā)生；②維持神經(jīng)前體細(xì)胞狀態(tài)并控制其分化；③NSCs增殖；④參與軸突和樹(shù)突的發(fā)生，突觸的形成和突觸的可塑性[14-16]。

不同階段的神經(jīng)發(fā)育均需Wnt基因的表達(dá)，特別是在胚胎神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過(guò)程中，經(jīng)典Wnt信號(hào)通路參與胚胎NSCs的增殖與分化[17]?，F(xiàn)有研究表明，Wnt/β-catenin 信號(hào)通路能夠明顯調(diào)控NSCs的增殖與分化。Wnt/β-catenin 通路激活可使成人海馬區(qū)域皮質(zhì)出現(xiàn)NSCs增殖。而穩(wěn)定低水平表達(dá)的β-catenin蛋白則可使轉(zhuǎn)基因小鼠大腦皮質(zhì)NSCs增殖，并使皮質(zhì)表面積增大[18]。Wnt通路與Notch 通路在出生后的神經(jīng)形成過(guò)程中，協(xié)同作用增強(qiáng)了NSCs的分化，Wnt-1 可通過(guò)縮短細(xì)胞分裂周期促進(jìn)NSCs的增殖[10]。此外，很多促NSCs增殖的方法也都是通過(guò)Wnt/β-catenin 通路發(fā)揮作用[17]。

前面提到，wnt/β-catenin通路參與了NSCs的增殖與分化過(guò)程，其能調(diào)節(jié)NSCs的數(shù)量，使其保持干細(xì)胞特性[18-19]。因此推測(cè)wnt/β-catenin通路在脈沖強(qiáng)磁場(chǎng)促進(jìn)NSCs增殖的作用中可能通過(guò)這幾個(gè)方面起作用：①脈沖強(qiáng)磁場(chǎng)可以促進(jìn)細(xì)胞外wnt1、wnt3蛋白表達(dá)，從而促進(jìn)wnt蛋白與細(xì)胞膜上受體結(jié)合并啟動(dòng)wnt/β-catenin通路。②經(jīng)典wnt/β-catenin通路中，wnt蛋白與細(xì)胞膜上受體結(jié)合后，使NSCs細(xì)胞內(nèi)LRP6發(fā)生磷酸化，從而增加NSCs內(nèi)β-catenin數(shù)量因此我們認(rèn)為脈沖強(qiáng)磁場(chǎng)干預(yù)NSCs后，通過(guò)LRP6的磷酸化間接增加β-catenin數(shù)量而表現(xiàn)促增殖效應(yīng)[20]。③脈沖強(qiáng)磁場(chǎng)干預(yù)NSCs后抑制GSK3β，從而增加β-catenin數(shù)量。有關(guān)wnt/β-catenin通路在神經(jīng)系統(tǒng)的作用中的研究也提到wnt/β-catenin通路能控制NSCs的增殖與分化，穩(wěn)定表達(dá)低水平β-catenin 蛋白可促使轉(zhuǎn)基因小鼠大腦皮質(zhì)NSCs增殖及皮質(zhì)表面積增大[15]。此研究也發(fā)現(xiàn)脈沖強(qiáng)磁場(chǎng)促NSCs增殖現(xiàn)象與wnt/β-catenin通路有關(guān)，且這種現(xiàn)象在抑制NSCs中β-catenin表達(dá)后不明顯，這與文獻(xiàn)報(bào)道相符合。

綜合考慮，經(jīng)4T、 0.1Hz、8次的脈沖強(qiáng)磁場(chǎng)干預(yù)的NSCs，其β-catenin數(shù)量增加，并與細(xì)胞核中的轉(zhuǎn)錄因子TcF/LEF結(jié)合[21]，從而調(diào)節(jié)與增殖相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，表現(xiàn)出促進(jìn)NSCs增殖現(xiàn)象。因此認(rèn)為脈沖強(qiáng)磁場(chǎng)促NSCs增殖現(xiàn)象與wnt/β-catenin通路有關(guān)。對(duì)wnt/β-catenin通路在脈沖強(qiáng)磁場(chǎng)促NSCs增殖效應(yīng)中的作用的研究有利于弄清脈沖強(qiáng)磁場(chǎng)促NSCs增殖的機(jī)制，對(duì)后期經(jīng)脈沖強(qiáng)磁場(chǎng)干預(yù)后的NSCs的安全性、分化研究都有幫助，并對(duì)將經(jīng)過(guò)脈沖強(qiáng)磁場(chǎng)干預(yù)后的NSCs移植提供穩(wěn)定、安全的細(xì)胞來(lái)源。由于NSCs增殖還與Notch通路、Shh-Gli通路、PPARγ通路等有關(guān)，但是本實(shí)驗(yàn)由于時(shí)間限制未檢測(cè)上述通路在脈沖強(qiáng)磁場(chǎng)促NSCs增殖中的作用，后期可對(duì)相關(guān)通路在脈沖強(qiáng)磁場(chǎng)促NSCs增殖中的作用行進(jìn)一步研究。