泰山山慈菇對小鼠肝癌的治療作用及相關免疫機制研究

修朋程 李騰 李雅林 劉紀豪 李棟 劉有旺

摘 要：目的 探討泰山山慈菇對小鼠肝癌的免疫治療作用。方法 本課題首先制備泰山山慈菇提取液，體外用山慈菇提取液對H22肝癌細胞進行干預，分為空白組、山慈菇提取液低、中、高劑量組和5-氟尿嘧啶陽性對照組，干預12 h后，Annexin V和7-AAD染色，流式細胞術檢測細胞凋亡。體內制備小鼠H22實體瘤肝癌模型，將50只小鼠分為山慈菇低、中、高劑量組、5-Fu陽性對照組、模型對照組，每組10只。山慈菇各劑量組均進行灌胃治療，模型組灌胃等體積生理鹽水，5-Fu陽性對照組進行等體積腹腔注射。連續(xù) 10 d，停藥后次日摘取小鼠眼球取血后頸椎脫臼處死小鼠，檢測小鼠腫瘤大小分析對腫瘤的抑制作用。酶聯免疫吸附試驗（ELISA）檢測血清中腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素-2（IL-2）和γ-干擾素（IFN-γ）的含量。結果 泰山山慈菇提取液體外促進H22腫瘤細胞凋亡且具有劑量依賴性。體內抑制H22腫瘤的生長，增加血清中TNF-α、IL-2和IFN-γ的含量且呈現劑量依賴性。結論 泰山山慈菇通過增加抗腫瘤細胞因子產生發(fā)揮抗腫瘤作用。

關鍵詞：泰山山慈菇；肝癌；腫瘤壞死因子-α；白細胞介素-2；γ-干擾素

中圖分類號：R392.3 文獻標識碼：A DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2018.09.003

文章編號：1006-1959（2018）09-0008-04

Abstract：Objective To investigate the immunotherapy effect of Taishan mountain mushroom on liver cancer in mice.Methods We first prepared the Taishan mountain mushroom extract.In vitro，the H22 hepatoma cells were treated with the extract of mushroom extract in vitro.It was divided into blank group，low，middle and high dose group and 5- fluorouracil positive control group.After 12 h intervention，Annexin V and 7-AAD were stained，and cell apoptosis was detected by flow cytometry.The mice model of H22 solid tumor was prepared in vivo，and 50 mice were divided into low，medium and high dose group，5-Fu positive control group and model control group，with 10 rats in each group.The rats in each dose group were treated by intragastric perfusion，and the model group was given iso-volume intraperitoneal injection of normal saline and 5-Fu positive control group.For 10 d，the mice were killed the next day after extirpation of eyeball and blood，and the inhibitory effect of tumor size analysis on the tumor was detected.Enzyme-linked immunosorbent assay（ELISA）was used to detect the levels of TNF-α，IL-2 and IFN-γ in serum.Results The extract of Taishan mountain mushroom promoted the apoptosis of H22 tumor cells in a dose-dependent manner.In vivo，the growth of H22 tumor was inhibited and the levels of TNF-α，IL-2 and IFN-γ in serum increased.Conclusion Taishan mountain mushroom plays an anti-tumor role by increasing the production of anti-tumor cytokines.

Key words：Taishan mountain mushroom；Liver cancer；Tumor necrosis factor -α；Interleukin-2；γ-interferon

肝癌是死亡率較高、五年生存率較低、惡性程度極高的腫瘤疾病之一。肝癌的治療主要有手術、放療、化療等治療方法[1]。放療、化療對機體毒副作用較大，探討中藥對肝癌的治療作用是目前研究的熱點。山慈菇是常用的抗腫瘤中藥之一。泰山山慈菇資源豐富，而其藥用價值遠遠沒有得到開發(fā)。據記載，山慈菇為中國藥典收載的常用中藥，中醫(yī)臨床上常用于治療乳腺癌、食管癌、胃癌等惡性腫瘤等[2，3]，但其對于肝癌的作用效果鮮有研究，限制其在臨床上的應用。其是否通過增強免疫作用抗腫瘤也不清楚。本研究首先采用醇提法制備泰山山慈菇提取液。體外觀察泰山山慈菇提取液是否對H22細胞具有促凋亡作用，在此基礎上制備小鼠H22實體瘤肝癌模型，體內檢測其對H22荷瘤小鼠腫瘤生長的影響及對血清TNF-α、IL-2和IFN-γ含量的影響，探討其可能的抗腫瘤免疫作用機制。

1材料與方法

1.1動物與試劑

1.1.1動物 健康雄性C57BL/6小鼠，鼠齡8周齡，體重18～22 g，購自北京維通利華驗動物技術有限公司。飼養(yǎng)于泰山醫(yī)學院實驗動物中心，所有動物實驗均得到泰山醫(yī)學院動物倫理委員會許可。

1.1.2細胞及試劑 H22肝癌細胞株購自上海素爾生物科技有限公司。5-氟尿嘧啶（5-fluorouracil，5-Fu）購自上海邁瑞爾化學技術有限公司。小鼠TNF-α、IL-2和IFN-γ ELISA試劑盒均購自eBioscience公司。胎牛血清（杭州四季青生物工程材料公司），DMEM液體培養(yǎng)基（Gibco公司），AnnexinV/7-AAD雙染細胞凋亡檢測試劑盒（Biolegend公司），其他試劑均為國產分析純。泰山山慈菇購自山東省泰安市金泰聯藥店。

1.2方法

1.2.1泰山山慈菇乙醇提取液 制備參照文獻報道方法[2]，并加以改進。制備方法：將150 g泰山山慈菇粉碎，加入500 ml雙蒸水煮沸后過濾，藥渣再煮2次，合并3次濾液。將3次濾液煎熬濃縮成500 ml，藥液冷卻后，邊攪拌邊緩慢加入無水乙醇至藥液含醇量為50%～60%，4 ℃密封48 h后過濾，然后用95%乙醇洗滌沉淀，收集濾液。濾液經旋轉蒸發(fā)儀回收得深棕色浸膏。用DMEM培養(yǎng)基溶解成10 mg/ml的溶液，0.22 μm的濾器過濾除菌后分裝存于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2流式細胞術檢測細胞凋亡 將H22細胞置于5%CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中，用含10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，將傳代后2 d處于對數生長期的細胞以1×105 cells/ml密度接種于96孔平底培養(yǎng)板中，每孔100 μl，培養(yǎng)24 h后，將細胞分成5組（空白對照組，5-Fu陽性對照組，山慈菇低、中、高劑量組），每組5個復孔，對照組加入5-Fu（終濃度0.5 mg/ml），泰山山慈菇低、中、高劑量組（終濃度分別為0.5 mg/ml、1 mg/ml、2 mg/ml），空白組加入等體積培養(yǎng)基。處理12 h后，按照AnnexinV/7-AAD試劑盒說明書操作，對細胞進行處理及染色，流式細胞儀（AriaⅡ，BD公司）檢測細胞凋亡。

1.2.3小鼠H22肝癌模型的建立 參照文獻方法[4]，用DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)H22肝癌細胞，于細胞對數期收集細胞，用生理鹽水將細胞濃度調整為1×107 cells/ml制成細胞懸液，接種200 μl于小鼠右腋窩皮下，接種后出現米粒大的鼓包視為接種成功。

1.2.4動物分組及處理 將小鼠分為模型組，山慈菇多糖低、中、高劑量組，5-Fu陽性對照組，每組10只。模型組接種H22肝癌細胞24 h后，灌胃0.2 ml生理鹽水，泰山山慈菇低、中、高劑量組分別灌胃300 mg/kg、600 mg/kg和900 mg/kg山慈菇提取液0.2 ml，陽性對照組灌胃5-Fu 25 mg/kg溶液0.2 ml。1次/d，連續(xù)給藥10 d。

1.2.5抑瘤率的檢測 停藥后次日，摘眼球取血后，頸椎脫臼處死小鼠，立即完整剝離瘤塊，稱量瘤塊重量，計算各組平均瘤塊重量及抑瘤率，抑瘤率（%）=[1-（給藥組平均瘤重/模型對照組平均瘤重）]×100%。

1.2.6酶聯免疫吸附試驗（ELISA）檢測血清細胞因子含量 停藥次日摘除眼球法取血，常規(guī)方法分離血清，按照小鼠TNF-α、IL-2和IFN-γ ELISA試劑盒說明操作，酶標儀（Tecan，Infinite M200 Pro）測定小鼠血清中TNF-α、IL-2和IFN-γ的含量。

1.3統計學分析 采用SPSS18.0軟件系統進行分析，實驗數據用（x±s）表示，組間比較采用單因素方差分析。P<0.05為差異具有統計學意義，P<0.01為統計學意義顯著。

2結果

2.1泰山山慈菇對H22肝癌細胞早期凋亡作用的影響 為了探討泰山山慈菇是否具有抗肝癌的作用，我們首先培養(yǎng)肝癌細胞株H22細胞，然后用泰山山慈菇處理H22肝癌細胞，Annexin V、7-AAD染色，流式細胞儀檢測對細胞凋亡的影響，發(fā)現藥物處理細胞12 h后，5-Fu陽性對照組細胞早期凋亡率為27.00%，高于空白對照組，統計學意義顯著（P<0.01）。泰山山慈菇低、中、高劑量組細胞早期凋亡率分別為15.80%、20.20%和25.40%，均高于空白對照組自發(fā)凋亡率，差異有統計學意義（P<0.05），且呈現明顯的劑量依賴性。其中高劑量組細胞早期凋亡率與陽性對照組相當。結果見圖1。本研究結果提示，泰山山慈菇體外可以通過促進H22肝癌細胞的凋亡而發(fā)揮抗腫瘤作用。

2.2泰山山慈菇對H22荷瘤小鼠抑瘤率的影響 為了探討泰山山慈菇體內是否對肝癌有治療作用，我們首先建立了H22荷瘤小鼠模型，然后灌胃不同劑量的泰山山慈菇進行治療。結果發(fā)現，5-Fu陽性對照組抑瘤率達50.63%，與模型組相比，統計學意義顯著（P<0.01）。山慈菇低、中、高劑量組對小鼠肝癌的抑瘤率分為30.95%、38.67%、45.53%。與模型組比較，差異均具有統計學意義（P<0.05），且隨著劑量的增加，抑瘤率增加，呈現明顯的劑量-效應依賴關系，其中高劑量組抑瘤率稍低于陽性對照組。結果見表1。本研究提示泰山山慈菇對 H22 荷瘤小鼠腫瘤的生長具有明顯的抑制作用。

2.3泰山山慈菇對H22荷瘤小鼠血清TNF-α、IL-2和IFN-γ含量的影響 為了探討泰山山慈菇抗肝癌的免疫相關機制，我們采用ELISA方法檢測了小鼠血清中可能與抗腫瘤有關的幾種細胞因子的含量。結果發(fā)現，與模型組小鼠相比，5-Fu陽性對照組可增加荷瘤小鼠TNF-α、IL-2和IFN-γ的含量，統計學意義顯著（P<0.01）；泰山山慈菇低、中、高劑量均可提高荷瘤小鼠的血清TNF-α、IL-2和IFN-γ含量，與模型組比較，差異具有統計學意義（P<0.05），且均呈現一定的劑量依賴性，結果見表2。本研究提示，泰山山慈菇可能通過增加抗腫瘤細胞因子的分泌而發(fā)揮抗肝癌作用。

3討論

肝癌是死亡率較高的腫瘤疾病之一，其惡性程度極高，五年生存率僅10.1%，是我國人群主要癌癥中最低的[1]。目前，肝癌的治療主要有手術、放療、化療等治療方法。放療、化療對機體毒副作用較大，探討中藥對肝癌的治療作用是一個有前景的研究方向。山慈菇是常用的抗腫瘤中藥之一。山慈菇在臨床上以復方的形式廣泛應用于口腔癌、食管癌、胃癌、甲狀腺癌、乳腺癌等惡性腫瘤的治療[2]，其是否對肝癌有治療作用及作用的免疫機制并不十分清楚。

誘導細胞凋亡是目前研究最為熱點的中藥抗腫瘤機制之一，而凋亡也是中藥抑制腫瘤細胞增殖的一條很重要的途徑[5]。本研究發(fā)現，泰山山慈菇提液體外可誘導H22肝癌細胞早期凋亡，且具有劑量依賴性，其中高劑量組與5-Fu陽性對照組作用相當，提示泰山山慈菇體外可以通過促進H22肝癌細胞的凋亡而發(fā)揮抗腫瘤作用。

我們進一步探討了泰山山慈菇體內是否對肝癌有治療作用，通過建立了H22荷瘤小鼠模型，然后灌胃不同劑量的泰山山慈菇進行治療，結果發(fā)現，泰山山慈菇可有效抑制腫瘤的生長，且具有劑量依賴性，其中高劑量組抑瘤率與5-Fu陽性對照組相當。提示泰山山慈菇對H22荷瘤小鼠腫瘤的生長具有明顯的抑制作用。

增強機體的免疫功能是目前抗腫瘤治療的主要方法之一，進一步我們探討了泰山山慈菇抗肝癌的可能的免疫作用機制。我們采用ELISA方法檢測了小鼠血清中可能與抗腫瘤有關的幾種細胞因子包括TNF-α、IL-2和IFN-γ的含量。IL-2 參與細胞免疫，能夠通過促進T細胞增殖和分化等作用提高機體的免疫功能[6]。本研究結果表明，泰山山慈菇提取液可增加荷瘤鼠血清中的IL-2水平，效果與5-Fu相當，表明其可能增強H22荷瘤小鼠的細胞免疫。TNF-α具有抑制腫瘤細胞增殖、促進其溶解、增強機體抗腫瘤免疫反應等作用，是迄今為止發(fā)現的抗腫瘤作用最強的細胞因子。本研究結果表明，泰山山慈菇提取液能明顯提高H22荷瘤鼠血清TNF-α水平，由此可能促進腫瘤細胞凋亡、阻止腫瘤生長。IFN-γ是一種糖蛋白，主要由輔助性T細胞（Th1）和自然殺傷（NK）細胞產生，具有較強的免疫調節(jié)功能，能增強細胞功能[7，8]。本研究發(fā)現，泰山山慈菇提取液能明顯提高H22荷瘤鼠血清IFN-γ水平，通過增強細胞免疫功能發(fā)揮抗腫瘤作用。本研究結果表明泰山山慈菇提液可通過提高H22荷瘤鼠的血清IL-2、TNF-α和IFN-γ水平，增強機體細胞免疫力，達到抑制腫瘤生長的作用，但其具體機理尚有待于進一步研究。本研究結果與文獻報道較一致且更加完善[6，8]。

綜上所述，本研究為臨床使用山慈菇抗肝癌提供了理論依據。山慈菇的藥理作用及抗癌機制目前研究得還不夠充分，還有待進一步深入的研究。

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收稿日期：2018-1-8；修回日期：2018-3-9

編輯/楊倩