ERK5在小鼠骨質(zhì)疏松性骨折愈合過程中作用的實驗研究

盛曉赟 郭來威 閆亮 萬浪 姜金 夏亞一,*

1. 蘭州大學(xué)第二醫(yī)院關(guān)節(jié)外科，甘肅 蘭州 7300002. 甘肅省骨關(guān)節(jié)疾病研究重點實驗室，甘肅 蘭州 730000

骨骼是人體內(nèi)具有生物活性的重要組織器官，它具有負重、參與運動、支撐、保護內(nèi)臟器官及存儲礦物質(zhì)等眾多生理功能，并與身體力學(xué)特性密切相關(guān)。骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis，OP)是一種以全身骨含量減少，骨的微結(jié)構(gòu)破壞，骨組織相關(guān)蛋白種類及含量改變，從而導(dǎo)致骨組織缺乏、骨密度(bone mineral density，BMD) 減低、骨骼脆性增加，進而引起骨痛、骨折風(fēng)險增高的一種慢性代謝性骨病[1-2]。OP及由其引起的病理性骨折已發(fā)展為世界上患病率最高、醫(yī)療費用消耗最大的慢性基礎(chǔ)性疾病之一[3]。

ERK5是MAPK信號通路家族的重要成員，可被各種應(yīng)激刺激(高滲刺激、低氧刺激、應(yīng)力刺激等)所激活[4]，從而使磷酸化ERK5高表達，進而促進骨鈣蛋白(osteocalcin，OCN)、骨橋蛋白(osteopontin，OPN)、堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)、成骨相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2(runt-related transcription factor 2，Runx2)等成骨相關(guān)蛋白活性及表達增加；而ERK5的活性被抑制劑阻斷后，成骨細胞ALP活性、OCN、OPN和Runx2表達明顯被抑制[5]。而由于目前尚無特異性ERK5體內(nèi)激動劑，因此通過ERK5特異性阻斷劑XMD8-92在體研究ERK5與成骨細胞增殖和分化及骨骼組織的成骨作用，對于探索新的措施預(yù)防和治療骨質(zhì)疏松及骨質(zhì)疏松性骨折的發(fā)生具有重要意義[6]。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

健康成年昆明系雌性小鼠，6周齡，SPF級別，體重(20±2)g，購于甘肅省中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心，實驗單位使用許可證號：SYXK(甘)2015-0005。

1.2 實驗方法

1.2.1實驗分組：將108只小鼠采用隨機數(shù)字表法將其隨機分為4組：正常單純股骨骨折組(Fracture組)、正常骨折+腹腔注射XMD8-92組(Fracture+XMD8-92組)、骨質(zhì)疏松+骨折組(OVX+Fracture組)、骨質(zhì)疏松+骨折+腹腔注射XMD8-92組(OVX+Fracture+XMD8-92組)，每組各27只小鼠。

1.2.2模型建立：(1)骨質(zhì)疏松模型構(gòu)建。通過切除小鼠雙側(cè)卵巢，并定期檢測小鼠BMD值來構(gòu)建骨質(zhì)疏松動物模型。(2)股骨骨折模型構(gòu)建。OVX組小鼠BMD值下降達到要求后，使用2%戊巴比妥鈉溶液，5 mL/kg麻醉各組小鼠，麻醉滿意后于超凈工作手術(shù)臺上，小鼠取仰臥位固定四肢，常規(guī)備皮、消毒，于小鼠右股骨外側(cè)行0.5 cm縱行切口，暴露股骨中段，用剪刀剪斷造成股骨中段橫行骨折，然后自髕骨旁內(nèi)側(cè)小切口，暴露股骨髁，由髁間窩處將14號尖針逆行植入髓腔，作為髓內(nèi)固定針固定骨折斷端，檢查骨折斷端固定良好后縫合切口。

1.2.3實驗處理及術(shù)后護理：小鼠股骨骨折術(shù)后室溫(22 ℃～24 ℃)蘇醒恢復(fù)活動后，XMD8-92處理組小鼠腹腔注射ERK5特異性阻斷劑XMD8-92，50 mg/kg[7-8]，連續(xù)注射4 w，其余兩組小鼠以同法于腹腔注射同等量生理鹽水，清潔環(huán)境下單籠飼養(yǎng)；術(shù)后3 d自由給水及飲食，并定時對手術(shù)切口局部注射青霉素鈉預(yù)防傷口感染，3 d后適度限制飲食控制體重。

1.3 實驗標本采集

實驗小鼠自建立股骨骨折模型術(shù)后第1、2、4周后分別隨機選取該組實驗小鼠總數(shù)的1/3，并頸椎脫臼法處死，用于后續(xù)實驗結(jié)果檢測。

1.4 檢測方法

1.4.1X線檢查：各實驗組小鼠分別隨機選取3只，行術(shù)側(cè)股骨X線片拍片檢查，觀察股骨骨折斷端骨折愈合及骨折端骨痂生長情況。

1.4.2微計算機斷層掃描(micro computed tomography，micro-CT)檢查：各組分別隨機選取3只小鼠，將術(shù)側(cè)股骨標本小心取下，對術(shù)側(cè)股骨標本行micro-CT掃描及3D重建檢查，比較股骨骨折水平骨折愈合及骨痂中骨小梁的微結(jié)構(gòu)差異。

1.4.3HE染色檢查：各組分別隨機選取3只小鼠，將術(shù)側(cè)股骨標本小心取下，剔除股骨上附著的肌肉組織，置于4%的多聚甲醛中固定。然后使用10%中性福爾馬林溶液100 mL加EDTA 5.5 g配置的溶液浸泡標本進行脫鈣，以尖針扎入股骨標本的難易度定期檢查脫鈣是否完成。脫鈣完成后使用濃度梯度酒精對標本脫水，然后用二甲苯溶液透明處理。透明完成后將股骨骨痂標本組織塊置于溶化的石蠟中充分包埋并凝固成塊，專用切片機進行切片，厚度約6 μm。然后用二甲苯脫蠟、水化，染色，最后用中性樹膠封片，顯微鏡下觀察。

1.4.4免疫組織化學(xué)染色檢查：各組分別隨機選取3只小鼠，將術(shù)側(cè)股骨標本小心取下，股骨骨痂石蠟切片，60 ℃烤箱烘烤約120 min，然后用二甲苯、梯度酒精、PBS及蒸餾水脫蠟至水，高壓處理抗原修復(fù)，PBS液漂洗10 min×3次，3% H2O2室溫孵育30 min，以消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性，再次用PBS漂洗10 min×3次，5%～10%正常山羊血清封閉，室溫孵育30 min，分別加ALP、Runx2、ERK5一抗工作液，放于4 ℃冰箱過夜處理，再次PBS漂洗10 min×3次，滴加適量辣根酶工作液，室溫孵育約2 h，PBS漂洗10 min×3次，DAB顯色3～10 min，自來水沖洗，復(fù)染，脫水，透明，封片，顯微鏡下觀察。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理

圖1 術(shù)后小鼠股骨X線片。A：小鼠骨折術(shù)后第1周各組股骨X線片結(jié)果；B：小鼠骨折術(shù)后第2周各組股骨X線片結(jié)果；C：小鼠骨折術(shù)后第4周各組股骨X線片結(jié)果Fig.1 Femoral X-ray in postoperative mice. A: The results of femoral X-ray in each group after 1 week of fracture; B: The results of femoral X-ray in each group after 2 weeks of fracture; C: The results of femoral X-ray in each group after 4 weeks of fracture.

實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差表示，結(jié)果使用SPSS 19.0軟件行統(tǒng)計學(xué)分析，各時間點的組間數(shù)據(jù)比較采用獨立樣本t檢驗，P<0.05時認為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 骨質(zhì)疏松模型建立結(jié)果

小鼠骨質(zhì)疏松模型建立前股骨BMD值平均為(0.11±0.01)g/cm2，此后每間隔一周復(fù)測一次BMD，至12 w時測得小鼠股骨BMD降至(0.08±0.00)g/cm2，降低了約27.3%(P<0.05)，證明小鼠骨質(zhì)疏松模型建立成功。

2.2 X線檢查結(jié)果

小鼠股骨骨折術(shù)后第1周，單純Fracture組、Fracture+XMD組、OVX+Fracture組及OVX+Fracture+XMD8-92組股骨骨折處水平無明顯骨痂生長，骨折端比較銳利，骨折線較明顯，仍清晰可見(圖1 A)。

小鼠股骨骨折術(shù)后第2周，單純Fracture組股骨骨折線水平可見骨痂生長，包繞骨折斷端周圍，骨折線較模糊，F(xiàn)racture+XMD組、OVX+Fracture組及OVX+Fracture+XMD8-92組骨折斷端仍無明顯骨痂生長，骨折斷端仍較明顯，骨折線仍清晰可見(圖1B)。

小鼠股骨骨折術(shù)后第4周，單純Fracture組股骨骨折線水平見骨痂進一步增多，包繞骨折斷端周圍及骨皮質(zhì)，骨折線消失或模糊不清；而Fracture+XMD組和OVX+Fracture組骨折斷端可見少量骨痂，骨折線較模糊，OVX+Fracture+XMD8-92組骨折斷端骨痂生長更少，骨折斷端略模糊或仍可見明顯骨折線(圖1C)。

2.3 micro-CT檢查結(jié)果

小鼠股骨骨痂的Micro-CT掃描三維立體結(jié)構(gòu)可以看出，XMD8-92處理會影響小鼠股骨骨折的骨痂生長，影響骨折斷端的愈合，使骨痂結(jié)構(gòu)變得疏松，尤其在骨折愈合的第2和第4周較明顯(圖2 A～C)。第1周時，各組均無明顯骨痂生長，骨折端清晰可見，為避免增加系統(tǒng)誤差影響實驗的可靠性，未行骨痂BMD及骨微結(jié)構(gòu)參數(shù)統(tǒng)計。第2周時，單純Fracture組骨痂開始生長，包繞骨折斷端，骨折線開始模糊。而Fracture+XMD組、OVX+Fracture組及OVX+Fracture+XMD8-92組骨折處仍無明顯骨痂生長或僅有少量骨痂，骨折線仍較清晰，OVX+Fracture+XMD8-92組更為顯著；與單純Fracture組相比，F(xiàn)racture+XMD組、OVX+Fracture組及OVX+Fracture+XMD8-92組的骨痂區(qū)BMD分別減少了約11.0%、13.7%和24.7%，而骨組織參數(shù)骨體積分數(shù)(bone volume fraction，BV/TV)分別減少了約50.5%、42.9%和64.5%，骨小梁數(shù)目(number of trabecular bone，Tb.N)分別減少了約52.9%、47.1%和76.5%，骨小梁厚度(thickness of trabecular bone，Tb.Th)分別減少了約52.9%、35.3%和70.6%，而骨小梁間隙(space of trabecular bone，Tb.Sp)分別增高了約150.0%、90.0%和250.0%(圖2D～G)。第4周時，單純Fracture組骨痂進一步增多，包裹骨折斷端及其周圍骨皮質(zhì)，骨折線消失，骨痂骨小梁變得致密；Fracture+XMD組、OVX+Fracture組骨折斷端骨痂較少，骨折斷端較模糊，骨痂骨小梁較少而疏；而OVX+Fracture+XMD8-92組骨折端骨痂則更少，骨折線較清晰，骨痂骨小梁更為稀少且疏松。與單純Fracture組相比，XMD8-92處理后的Fracture+XMD組BMD、BV/TV、Tb.N、Tb.Th分別降低了約29.8%、30.3%、39.3%和30.8%，而Tb.Sb增高了約162.5%。由此表明，腹腔注射XMD8-92可以抑制小鼠骨折愈合過程中骨痂生長，減低骨痂BMD值及骨小梁數(shù)目。另外，OVX+Fracture+XMD8-92組與OVX+Fracture組相比，則具有更低的BMD(-13.9%，P<0.05)、BV/TV(-38.3%，P<0.05)、Tb.N(-55.6%，P<0.05)、Tb.Th(-54.5%，P<0.05)，具有更高的Tb.Sb(82.4%，P<0.05)(圖2H～K)。這表明XMD8-92能夠影響小鼠骨質(zhì)疏松性骨折的愈合過程，抑制骨痂生長，降低骨小梁厚度及數(shù)目，使骨痂微結(jié)構(gòu)變得更為疏松。

圖2 術(shù)后小鼠股骨骨痂的Micro-CT 掃描及3D重建結(jié)果。A～C：小鼠股骨冠狀層面及重建掃描結(jié)果(A、B、C分別為第1、2、4周結(jié)果)；D～K：骨痂骨小梁各指標定量分析結(jié)果(D～G為第2周結(jié)果；H～K為第4周結(jié)果)。BV/TV：骨體積分數(shù)，Tb.N：骨小梁數(shù)目，Tb.Th：骨小梁厚度，Tb.Sp：骨小梁間隙。*表示兩者間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，n=3)Fig.2 Micro-CT scan and 3D reconstruction of femoral callus in postoperative mice. A-C: The femoral coronal plane scan and reconstruction results in mice at the 1st (A), 2nd (B), and 4th (C) week; D-K: Quantitative analysis of trabecular bone in the bone callus (D-G: the results of the 2nd week; H-K: the results of the 4th week). BV/TV: bone volume fraction, Tb.N: number of trabecular bone, Tb.Th: thickness of trabecular bone, Tb.Sp: space of trabecular bone. * Indicates a statistically significant difference between the two groups (P<0.05, n=3).

2.4 HE染色結(jié)果

第1周各組骨折處骨痂骨量較少且骨小梁生長無明顯差異。第2周可見單純Fracture組骨痂量及骨小梁較其他3組增多，而OVX+Fracture組與OVX+Fracture+XMD8-92組相比，骨小梁生長均較少且差異不明顯。第4周可見Fracture+XMD組、OVX+Fracture組及OVX+Fracture+XMD8-92組骨折端骨痂的量及骨小梁較單純Fracture組少，骨小梁菲??；且與OVX+Fracture組相比，OVX+Fracture+XMD8-92組骨痂的量及骨小梁數(shù)目則更為稀少且菲薄(圖3)。

圖3 術(shù)后小鼠股骨骨痂的HE染色結(jié)果。A：第1周各組骨痂及骨小梁的結(jié)果；B：第2周各組骨痂及骨小梁的結(jié)果；C：第4周各組骨痂及骨小梁的結(jié)果Fig.3 HE results of postoperative femoral callus in mice. A: The results of callus and trabecular bone in the first week; B: The results of callus and trabecular bone in the second week; C: The results of callus and trabecular bone in the fourth week.

2.5 免疫組織化學(xué)染色結(jié)果

第1周各組骨痂標本中ALP表達量無明顯差異(P>0.05)，但ERK5、Runx2的表達OVX+Fracture+XMD8-92組卻低于其他3組(P<0.05)(圖4 A、D)。第2周可見單純Fracture+XMD組的ERK5、ALP、Runx2表達較其他3組高(P<0.05)，且OVX+Fracture組各蛋白表達均高于OVX+Fracture+XMD8-92組(P<0.05)(圖4 B、E)。第4周可見Fracture+XMD組、OVX+Fracture組及OVX+Fracture+XMD8-92組骨折端骨痂中ERK5、ALP、Runx2表達較單純Fracture組少(P<0.05)；且與OVX+Fracture組相比，OVX+Fracture+XMD8-92組ERK5、ALP、Runx2表達則更少(P<0.05，圖4 C、F)。

3 討論

骨質(zhì)疏松癥與高血壓、糖尿病、腫瘤及動脈粥樣硬化共同被稱作是當前的5大嚴重慢性疾病。BMD檢查是目前醫(yī)療界診斷OP的“金標準”，并可以通過該檢查預(yù)測骨質(zhì)疏松性骨折發(fā)生風(fēng)險的高低，可以作為OP病程檢測及治療藥物療效評價的簡單而準確的定量指標[9-10]。骨的強度大小與BMD和骨含量有關(guān)，而骨強度的大小約70%是由BMD決定的[11-13]，當BMD值降低1個標準差時，骨強度的降低引起骨折風(fēng)險將增加1.5～2.6倍[14]。OP患者的骨組織顯微結(jié)構(gòu)顯示成骨細胞功能明顯減弱，而破骨細胞數(shù)量增多，功能活躍，進而導(dǎo)致骨丟失增多，骨的形成明顯減少，骨小梁數(shù)目減少，厚度變薄，骨小梁間距增寬，其抗應(yīng)力能力下降，因而極易導(dǎo)致微骨折的發(fā)生。

ERK5是MAPK信號通路家族的重要成員[15]，可被各種應(yīng)激刺激(高滲刺激、低氧刺激、應(yīng)力刺激等)所激活[4]，激活后的ERK5可進一步刺激下游多種轉(zhuǎn)錄因子信號的表達，其中最常作用于肌細胞增強因子(myocyte enhancer factor，MEF)家族中的MEF2A,C,D位點[16-18]，進而參與細胞相應(yīng)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及調(diào)控。而ERK5的這些上下游信號通路可被多種抑制劑如BIX02188、BIX02189以及ERK5特異性抑制劑XMD8-92所干擾阻斷[8，19-20]，因而提供了ERK5信號轉(zhuǎn)到通路上特定的可控作用靶點。

ALP是成骨細胞早期活性指標，屬于早期的成骨相關(guān)性蛋白，可在成骨細胞增殖及分化早期檢測到[21-24]。Runx2是成骨分化過程中一個非常重要的轉(zhuǎn)錄因子，可調(diào)節(jié)ALP、OCN、OPN等基因轉(zhuǎn)錄和表達[25]，進而發(fā)揮成骨作用。實驗研究顯示，流體剪切力(fluid shear stress，F(xiàn)SS)可以刺激并激活成骨細胞ERK5信號通路，使磷酸化ERK5高表達，進而調(diào)節(jié)成骨細胞增殖與分化功能，參與成骨作用[19，26-28]。間歇性的FSS施于成骨細胞后，刺激ERK5高表達并發(fā)生磷酸化，增強ALP、OCN、OPN活性及表達增加；而ERK5的活性被抑制劑阻斷后，成骨細胞ALP活性、OCN、OPN和Runx2表達明顯被抑制[5]。由此可見，ERK5與成骨細胞增殖和分化及骨骼組織的成骨作用密切相關(guān)。

圖4 術(shù)后小鼠股骨骨痂的免疫組織化學(xué)染色結(jié)果。A～C：分別為第1、2、4周小鼠骨痂免疫組化染色中ERK5、ALP、Runx2的表達結(jié)果；D～F：分別為第1、2、4周小鼠骨痂免疫組化染色中ERK5、ALP、Runx2的表達量以光密度轉(zhuǎn)換為具體數(shù)值行定量分析的結(jié)果。*表示兩者間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，n=3)Fig.4 Immunohistochemical staining results of postoperative femoral callus in mice. A-C: Immunohistochemical staining of the expression of ERK5, ALP and Runx-2 in callus at the 1st, 2nd and 4th week, respectively; D-F: Quantitative analysis of the expression of ERK5, ALP and Runx-2 in callus.* Indicates a statistically significant difference between the two groups (P<0.05, n=3).

本實驗將通過切除小鼠雙側(cè)卵巢(OVX)來構(gòu)建骨質(zhì)疏松動物模型，通過OVX術(shù)前測量BMD值作為骨密度的起始值，行OVX術(shù)后12 w小鼠股骨BMD值較術(shù)前降低明顯，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，證明通過切除小鼠雙側(cè)卵巢構(gòu)建絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松動物模型是可行的。然后分別構(gòu)建小鼠正常股骨骨折模型、骨質(zhì)疏松股骨骨折模型，并通過給小鼠腹腔注射ERK5特異性阻斷劑XMD8-92，可以發(fā)現(xiàn)XMD8-92使正常骨折骨痂形成速度減慢，且通過Micro-CT及HE染色結(jié)果可以觀察到，腹腔注射XMD8-92組小鼠，股骨骨折端骨痂變薄疏松，骨小梁數(shù)目減少，骨小梁較纖細且紊亂，這與X線片顯示的注射XMD8-92組小鼠股骨骨折端愈合差于單純骨折組相一致。另外，骨質(zhì)疏松性骨折模型組小鼠骨痂形成則更為緩慢，同樣通過Micro-CT及HE染色結(jié)果可以看到，腹腔注射XMD8-92的骨質(zhì)疏松組小鼠，股骨骨折端骨痂更加稀少菲薄，骨小梁數(shù)目極少，骨小梁細長且極其紊亂；而且通過X線片結(jié)果也可更直觀地看到骨質(zhì)疏松性骨折加腹腔注射XMD8-92組小鼠股骨骨折愈合相比其他各組明顯減慢且愈合明顯較差?？梢?，XMD8-92的阻斷抑制作用可進一步抑制骨質(zhì)疏松性骨折的成骨過程，影響骨折愈合。另外，通過小鼠股骨骨痂標本免疫組織化學(xué)染色，結(jié)果顯示XMD8-92處理組ERK5活性及表達減低，ERK5下游多種轉(zhuǎn)錄因子信號的合成及表達受阻，進而使成骨相關(guān)蛋白產(chǎn)物ALP、Runx-2的表達量也隨之減低；且骨質(zhì)疏松性骨折+XMD8-92組與單純骨質(zhì)疏松+骨折組相比，ERK5活性及ALP、Runx-2表達更低，進而嚴重阻滯了小鼠股骨骨折端成骨過程，使骨小梁的正常爬行生長秩序被打亂，骨小梁形成受阻，從而表現(xiàn)為骨折端骨痂生成的質(zhì)和量明顯受限?？梢?，阻斷ERK5后，骨質(zhì)疏松性骨折成骨相關(guān)蛋白表達受阻，骨小梁生成障礙，骨痂生長的速度和質(zhì)量減低，從而阻礙了骨折愈合的宏觀過程。

由此可見，ERK5參與骨折愈合過程成骨相關(guān)蛋白的合成表達，影響骨痂形成的速度和質(zhì)量，參與調(diào)控小鼠股骨骨折的早期愈合。因此，ERK5在促進骨質(zhì)疏松性的骨折愈合過程中起著十分重要的生理作用，但ERK5具體通過何種方式、何種信號通路調(diào)控骨質(zhì)疏松性骨折的愈合過程，以及ERK5與成骨形成過程中其他信號通路間是否具有協(xié)同或相互制約關(guān)系，并達到怎樣的平衡來共同調(diào)節(jié)成骨及骨質(zhì)疏松骨折愈合，有待進一步的探索及實驗研究來證實。