補腎健脾活血方干預沉默DKK1、Sost骨細胞對細胞活性和相關蛋白的影響研究

萬雷 黃宏興 張志海 王吉利 柴爽 劉少津 黃佳純

1.廣州中醫(yī)藥大學附屬骨傷科醫(yī)院，廣東 廣州 510240 2.廣州中醫(yī)藥大學，廣東 廣州 510405

骨質疏松癥(osteoporosis，OP)是一種隨年齡增長，骨量逐漸丟失，骨微結構破壞，因骨質脆弱而易發(fā)生骨折的全身性骨代謝疾病，其發(fā)病與多種因素有關，且發(fā)病率逐年升高。據統(tǒng)計[1]現(xiàn)在全世界約有2億骨質疏松患者，其發(fā)病率已躍居世界各種常見病的第七位，我國40歲以上人群骨質疏松癥發(fā)病率24.62%，約1.4億人罹患該病，男性與女性每10年骨質疏松癥的增長率分別約為15%和20%。骨質疏松癥及其伴隨骨折所造成的醫(yī)療費用與癌癥相似甚或過之[2-3]。增齡所導致的骨質疏松等慢性退行性骨病是目前危害骨骼健康的重要問題，也是國內外醫(yī)學界研究的熱點。研究發(fā)現(xiàn)[4]Wnt信號通路是與骨代謝關系密切的一條重要細胞信號通路，已發(fā)現(xiàn)眾多的胞內蛋白質分子參與Wnt信號的轉導與調節(jié)。而Dickkopf (DKK)1和骨硬化蛋白Sclerostin(Sost)是Wnt信號通路的抑制因子，在Wnt信號通路介導的骨形成和骨代謝過程中發(fā)揮重要作用，被視為骨相關疾病如骨質疏松、骨修復的治療靶點[5]。補腎健脾活血方是我院骨質疏松課題組多年來臨床防治骨質疏松癥的經驗方，前期研究證實其臨床療效顯著，且具有促進骨形成和抑制骨吸收的雙向調節(jié)作用。為了研究補腎健脾活血方是否通過調控DKK1、Sost進而影響成骨細胞的代謝，故開展本實驗研究。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

1.1.1實驗動物：6月齡SPF級健康雌性未孕SD大鼠16只，體重約240～260 g [南方醫(yī)科大學實驗動物中心提供，實驗動物質量合格證號：SCXK(粵)2011-0015]。

1.1.2實驗藥物：補腎健脾活血方由補骨脂、制淫羊藿、黃芪、丹參等10味中藥組成。其提取物中含生藥量1.43 g/mL，由廣州中醫(yī)藥大學附屬骨傷科醫(yī)院制劑室提供。

1.1.3主要試劑和儀器(見表1)。

表1 主要試劑和儀器及生產廠家Table 1 Main reagents, equipment and manufacturers

1.2 含藥血清制備

實驗大鼠隨機分為空白血清組和含藥血清組(補腎健脾活血方，4.8 g/kg)，每組8只。每天灌胃兩次，連續(xù)灌胃3 d，最后一次灌胃后2 h 進行腹主動脈取血，在3 000 r/min條件下離心取血清，放置-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 細胞培養(yǎng)

MG63細胞培養(yǎng)于含10% FBS的DMEM高糖培養(yǎng)基中，置于37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細胞生長至80%～95%融合時，棄舊液，加入0.25%胰酶消化液2 mL，再加入4 mL培養(yǎng)液終止消化，然后移至無菌離心管中，在1 000 r/min條件下離心4 min，棄上清，以1∶4～1∶6比例移至新培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)。

1.4 細胞轉染

細胞培養(yǎng)24 h后分為空白對照組(NC組)、沉默DKK1(Ad-shDKK1)組、沉默Sost (Ad-shSost)組，用包裝好的空載腺病毒和沉默DKK1、Sost重組腺病毒分別轉染三組細胞，感染復數(MOI)為50。

1.5 細胞增殖檢測

用空載腺病毒和沉默DKK1、Sost重組腺病毒分別轉染培養(yǎng)好的NC組、Ad-shDKK1組和Ad-shSost組細胞，再分別用空白血清和含藥血清干預。轉染24、48、72 h 后，加入100 μL含10% CCK-8的培養(yǎng)基、在37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中孵育1.5～2.5 h，于酶標儀450 nm處檢測各孔的吸光度(A)值。

1.6 ALP活性檢測

空白血清和含藥血清分別干預轉染的細胞72 h，裂解、提取、檢測細胞總蛋白，加入雙蒸水、酚標準應用液、緩沖液、基質液，37 ℃孵育15 min，再加入顯色劑，于酶標儀處檢測各孔的吸光度(A)值，并計算ALP活性。

1.7 骨相關蛋白檢測

上述三組細胞轉染72～96 h后，棄舊培養(yǎng)基，消化收集細胞，提取細胞總蛋白，并測定蛋白濃度，上樣、電泳、轉膜、免疫反應，化學發(fā)光顯色后，掃描存檔膠片，用Image J軟件處理系統(tǒng)分析目標帶的光密度值。

1.8 統(tǒng)計方法

2 結果

2.1 血清干預后各組細胞活性變化(見表2)

表2顯示血清干預重組腺病毒轉染的細胞后，細胞活性在培養(yǎng)24、48、72 h均有增強；三組含藥血清干預后的細胞活性均強于同時間點的空白血清干預后的細胞活性。NC組在24、48和72 h含藥血清干預比空白血清干預的細胞活性分別提高了1.07、1.216、1.187倍。Ad-shDKK1組在24、48、72 h含藥血清干預比空白血清干預的細胞活性分別提高了1.076、1.166、1.192倍。Ad-shSost組在24、48、72 h含藥血清干預比空白血清干預的細胞活性分別提高了1.115、1.189、1.183倍。進一步分析發(fā)現(xiàn)，含藥血清在24、48、72 h對Ad-shDKK1組、Ad-shSost組的細胞活性作用稍強于NC組，在72 h時含藥血清對Ad-shDKK1組的細胞活性作用更強，與同組空白血清比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

表2 血清干預后的各組細胞活性變化Table 2 The changes of cell activity of in each group after serum

注：同組含藥血清與空白血清比較，*P<0.05。

2.2 血清干預后各組細胞ALP活性變化(見表3)

表3顯示三組含藥血清干預與空白血清干預比較ALP活性均明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；空白血清干預后，與NC組比較，其余兩組ALP活性均顯著升高,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，與Ad-shDKK1組比較，Ad-shSost組ALP活性升高不明顯。含藥血清干預后，與NC組比較，其余兩組ALP活性均顯著升高,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，Ad-shDKK1組和Ad-shSost組比較ALP活性升高不明顯。說明兩種血清均能升高沉默重組腺病毒轉染后細胞ALP活性，其中補腎健脾活血方含藥血清升高細胞ALP活性明顯，可顯著促進沉默DKK1、Sost重組腺病毒轉染細胞ALP活性的升高。

表3 各組ALP活性變化 Table 3 ALP activity changes in each

注：同組含藥血清與空白血清比較，**P<0.01；空白血清：與NC組比較，▲▲P<0.01；含藥血清：與NC組比較，△△P<0.01。

2.3 血清干預后各組骨細胞相關蛋白表達變化(見表4，圖1)

表4，圖1顯示與空白血清干預比較，含藥血清干預后NC組、Ad-shDKK1組和Ad-shSost組的CTGF、OPG、OPN均升高，Ad-shDKK1組低密度脂蛋白受體相關蛋白5(low density lipoprotein receptor related protein,Lrp5)表達稍降低，其余兩組Lrp5表達升高。進一步分析發(fā)現(xiàn)NC組和Ad-shDKK1組CTGF、OPG比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05和P<0.01)，Ad-shSost組CTGF比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)?？瞻籽甯深A后，與NC組比較，Ad-shDKK1組和Ad-shSost組的Lrp5、OPG、OPN差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05和P<0.01)。含藥血清干預后，與NC組比較，Ad-shDKK1組OPG、OPN差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05和P<0.01)，Ad-shSost組CTGF、OPG、OPN差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。說明含藥血清能進一步上調沉默DKK1、Sost腺病毒轉染細胞CTGF、OPG、OPN的表達。

表4 各組骨細胞相關蛋白變化Table 4 The changes of bone cell related proteins in each

注：同組含藥血清與空白血清比較，*P<0.05，**P<0.01；空白血清：與NC組比較，▲P<0.05，▲▲P<0.01；含藥血清：與NC組比較，△P<0.05，△△P<0.01。

圖1 各組骨相關蛋白檢測結果Fig.1 Protein test results of bone related proteins in each group

3 討論

骨質疏松癥是一種退行性全身骨代謝疾病，其發(fā)病機制迄今仍未完全闡明，而且目前該病的治療方法不盡理想，臨床抗骨質疏松藥物主要靶向破骨細胞，抑制骨吸收，但這并不能有效降低骨折發(fā)生風險和增加骨密度，靶向成骨細胞和促進骨形成的藥物較少，尋找調控成骨細胞促進骨形成的藥物就顯得非常重要。現(xiàn)代臨床統(tǒng)計數據表明，中醫(yī)藥在治療骨質疏松中具有療效顯著，副作用小，安全性好的優(yōu)點。然而中醫(yī)用藥講究配伍和“君、臣、佐、使”，用現(xiàn)代醫(yī)藥的觀點來看是多種藥物聯(lián)合作用，具有多靶點協(xié)同作用的功效。補腎健脾活血方是我院骨質疏松課題組根據骨質疏松的腎虛、脾虛和血瘀中醫(yī)病機在補腎、健脾、活血治則基礎上選藥組方而成。筆者前期的體內實驗[6-7]已經證明補腎健脾活血方對去勢大鼠骨質疏松病理狀態(tài)有明顯的改善作用，促使更進一步研究補腎健脾活血方防治骨質疏松的作用機理。

DKK1是Dickkopfs基因家族中的一員，1998年在兩棲動物非洲蟾蜍胚胎細胞中被首次發(fā)現(xiàn)，并被編碼命名為DKK1[8]。在成年個體，DKK1主要在成骨細胞和成熟骨細胞中表達。由Sost基因表達的硬骨素(sclerostin,Sost)屬于胱氨酸結構超家族的一員[9]，也能夠特異性地在成熟骨骼的骨細胞中表達[10]。DKK1和Sost都是骨形成的負調控因子，它們在許多骨骼疾病和某些腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中起著非常重要作用，對Wnt/?-catenin信號通路也有抑制作用，其作用途徑大都通過Wnt/?-catenin信號通路來實現(xiàn)。兩者作用機理相同，都可以競爭性結合受體LRP5/6或與Kremen1/2、LRP5/6共同結合形成三聚體，通過誘導細胞內吞作用移除細胞膜上的LRP5/6，阻止Wnt信號轉導。Korvala等[11]研究認為DKK1基因的變異在原發(fā)性骨質疏松癥發(fā)病中起著重要作用。也有研究證實拮抗Sost蛋白可以緩解骨質疏松的癥狀。筆者前期研究[12]發(fā)現(xiàn)沉默DKK1、Sost重組腺病毒轉染具有人成骨細胞表型特征的MG63細胞后可促進細胞增殖、提高ALP活性，降低鈣離子濃度，尤以二者同時沉默時的作用最強。還發(fā)現(xiàn)[13]補腎健脾活血方可提高過表達DKK1轉染后的細胞活性，提高骨形態(tài)發(fā)生蛋白2(bone morphogenetic protein,BMP2)相對表達量，有利于成骨細胞的礦化。為了進一步研究補腎健脾活血方是否通過調控DKK1、Sost進而影響成骨細胞的代謝，筆者在前期沉默DKK1、Sost重組腺病毒轉染的成骨細胞模型上進行干預研究，結果發(fā)現(xiàn)含藥血清干預沉默DKK1、Sost重組腺病毒轉染的細胞后，細胞活性在培養(yǎng)24、48、72 h均進一步增強，高于同時間點空白血清干預后的細胞活性，尤其在72 h時含藥血清對Ad-shDKK1組的細胞活性促進作用更強。ALP是成骨細胞分化的早期特異性指標，也是礦化的先決條件，其含量的變化可預示骨細胞增殖程度。本實驗發(fā)現(xiàn)含藥血清可升高細胞ALP活性，也能顯著促進沉默DKK1、Sost重組腺病毒轉染細胞后ALP活性的升高。這說明補腎健脾活血方對沉默DKK1、Sost重組腺病毒轉染所引起的細胞增殖和ALP活性升高均有明顯促進作用。

成骨細胞一方面合成骨基質，增加骨量，另一方面分泌OPG、OPN等調節(jié)破骨細胞形成、活化，影響骨吸收。OPG是腫瘤壞死因子受體家族成員，可通過與核因子κB受體活化因子配體結合，競爭性阻止核因子κB受體活化因子配體與破骨細胞中的核因子κB受體活化因子結合，抑制破骨細胞形成和活化[14]。OPN在骨基質礦化、吸收和骨重塑等過程中均發(fā)揮重要作用，介導骨組織細胞與骨基質間的橋接，廣泛參與了骨相關疾病的病程進展，顯示出多效的生物學活性[15]。Lrp5存在于成骨細胞表面,它的表達改變和功能丟失,可導致體外培養(yǎng)鼠頭蓋骨質密度減低,骨質厚度變薄，并在人的成長過程中影響骨質獲得[16]。CTGF是一種可刺激成纖維細胞增殖和分泌膠原的生長因子，還具有促細胞增殖、遷移及分化等作用[17]。本實驗對沉默DKK1、Sost重組腺病毒轉染的具有人成骨細胞表型特征的MG63細胞進行蛋白檢測，發(fā)現(xiàn)與空白血清干預比較，含藥血清干預后NC組、Ad-shDKK1組和Ad-shSost組的CTGF、OPG、OPN表達均升高，Ad-shDKK1組Lrp5表達稍降低，其余兩組Lrp5表達則有升高。結合DKK1和Sost是Wnt信號通路的抑制因子，可以競爭性結合Wnt信號通路中的共受體Lrp5/6來抑制該信號通路的正常信號傳導，二者沉默后可促進Wnt信號傳導，成骨細胞增殖分化能力相對增強，導致成骨細胞分泌的促骨形成蛋白表達升高。這說明補腎健脾活血方能進一步上調沉默DKK1、Sost腺病毒轉染細胞CTGF、OPG、OPN的表達，而對Lrp5的影響作用有待進一步實驗研究。

Wnt信號通路是調控成骨細胞分化和骨基質形成的關鍵途徑，DKKl和Sost僅在成骨細胞或骨細胞中表達，因此，系統(tǒng)處理DKKl和Sost將可能只影響骨組織Wnt信號通路，增強骨形成，而不影響其他器官。補腎健脾活血方含藥血清可提高細胞增殖和ALP活性，升高CTGF、OPG和OPN的表達，尤其在沉默DKK1和Sost重組腺病毒轉染細胞后，仍可促進細胞增殖、成熟和礦化，并上調上述蛋白的表達，這提示補腎健脾活血方可能具有調控DKK1和Sost的作用，為補腎健脾活血方治療骨質疏松癥提供了新的實驗依據。然而，本研究中含藥血清和空白血清都提高了細胞增殖和ALP活性，影響CTGF、Lrp5、OPG和OPN的表達，不能完全說明補腎健脾活血方是通過Wnt信號通路來影響成骨細胞的增殖，可能還存在其他未知的作用機制，有待進一步的研究證實。