畜禽糞肥添加及干濕交替強度對土壤微生物功能多樣性的影響

李江濤，羅甜甜，杜滿聰，倪 杰，龔建周

（廣州大學地理科學學院，廣東 廣州 510006）

有機肥管理和水分管理是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的重要管理措施[1-2]。一直以來有機肥都是我國農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的主要肥源之一，它含有多種作物可被吸收利用的微量元素和有機物，以及有益微生物和各種活性酶，在保持、改善和提高土壤肥力、活化土壤養(yǎng)分、增強微生物活性、促進農(nóng)作物高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)以及降低農(nóng)產(chǎn)品成本等方面有著不可替代的作用[3-4]。許多研究表明，與不施肥和施用化肥比較，施用有機肥能夠顯著提高土壤有機質(zhì)含量，明顯改善土壤孔隙狀況、以及土壤團聚作用[5-7]。另外，有機肥也是控制土壤微生物生物量活性和多樣性的關(guān)鍵因素[8]。施用有機肥既能夠顯著提高土壤中碳源的數(shù)量和種類，也可以顯著地增加了多種養(yǎng)分，從而明顯改變土壤微生物群落的生物活性和多樣性[7，9-10]。然而隨著集約化、規(guī)?；F(xiàn)代養(yǎng)殖業(yè)的出現(xiàn)，現(xiàn)代集約化畜禽有機糞肥對農(nóng)業(yè)土壤生態(tài)系統(tǒng)的影響受到質(zhì)疑，甚至成為農(nóng)田污染物的重要來源之一。因此，進一步關(guān)注現(xiàn)代集約化畜禽糞肥施用影響具有重要意義。

干濕交替循環(huán)是農(nóng)業(yè)土壤上非常自然的過程，降雨或者農(nóng)業(yè)灌溉能夠迅速濕潤土壤，而重力排水和自然蒸發(fā)作用土壤又會逐漸變得干燥[11]。干濕交替過程是土壤水勢迅速變化的過程，土壤水勢的快速變化極易導致土壤中不適應(yīng)環(huán)境變化的微生物死亡或者失去活性[12]，因此干濕交替循環(huán)能夠影響土壤微生物生物量數(shù)量和活性[13]。干濕交替不僅影響了土壤微生物生物量活性，也能夠改變土壤微生物群落的組成[14]。

本研究通過探討添加不同畜禽糞肥及其干濕交替強度變化如何影響土壤微生物群落功能多樣性，旨在為畜禽糞肥農(nóng)業(yè)利用提高進一步的數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試土壤于2011年采自于江蘇省海安縣長期施用化肥的稻麥輪作土壤的犁底層（15～25 cm），土壤類型為河流沉積相發(fā)育而成的潮土基礎(chǔ)上形成的水稻土。試驗前仔細去除土壤樣品中的根系、石礫和動植物殘體，全部通過2 mm土壤篩后，自然風干備用。供試土壤有機碳含量為8.55 g/kg，全氮、全磷和全鉀含量分別為0.92、0.63、15.87 g/kg，土壤pH值為6.85，土壤容重為1.44 g/cm3，土壤粘粒、粉粒和砂粒含量分別為83.39、201.21、715.40 g/kg。土壤微生物碳、氮含量分別為274.78、23.15 mg/kg，土壤基礎(chǔ)呼吸速率為17.53 mg/kg·d （CO2-C）。

1.2 試驗方法

試驗前將供試土壤含水量調(diào)節(jié)至60%田間持水量，并將供試土壤置于25℃的培養(yǎng)室中預(yù)培養(yǎng)1周，以促進風干供試土壤中的微生物群落的恢復。預(yù)培養(yǎng)結(jié)束后，將已經(jīng)制備好的豬糞和雞糞等兩種畜禽糞肥干樣品按干重2%的量分別添加到預(yù)培養(yǎng)土壤中，混合均勻。

試驗設(shè)添加雞糞肥（CM）、豬糞肥（PM）和不添加糞肥（CK）3個處理。同時設(shè)置3個干濕交替強度處理：（1）60%田間持水量恒定培養(yǎng)（CWC）；（2）弱干濕交替處理（LWD），土壤樣品飽和濕潤24 h后，干燥1周使土壤含水量回到60%～80%田間持水量；（3）強干濕交替處理（SWD），土壤樣品飽和濕潤24 h后，干燥1周使土壤含水量低于8%（約為-1.5 MPa下土壤含水量）。整個培養(yǎng)試驗干濕交替周期為4次，解除干濕交替脅迫后將土壤含水量調(diào)節(jié)至田間持水量60%左右持續(xù)培養(yǎng)1周后完成培養(yǎng)試驗。培養(yǎng)試驗結(jié)束后，破壞性采集土壤樣品，立即測定土壤微生物功能多樣性。

1.3 土壤微生物功能多樣性測定方法

土壤微生物功能多樣性采用美國BIOLOG公司生產(chǎn)的ECO微孔板測定。具體方法為：稱取相當于5 g干土重的新鮮土壤樣品加入到 45 mL 0.85%生理鹽水中，恒溫震蕩 30 min取出靜置 10 min后，吸取土壤上清液 1 mL到 9 mL的培養(yǎng)管中，將稀釋液接種到ECO微孔板上，每孔接入量為 125 μL。接種后每間隔12 h在590 nm處測定各孔的吸光值（OD）。每孔平均顏色變化率（AWCD）、香農(nóng)指數(shù)（H′）、辛普森指數(shù)（D）以及 McIntoch 指數(shù)（U）等土壤微生物群落功能多樣性計算公式如下：

式中，C表示各孔溶度的吸光值，R表示A1未加碳源對照孔的吸光值，n表示碳源的種類香，M為反應(yīng)孔溶液吸光值總和，Pi表示第i 孔溶液相對吸光值與M的比率，mi為第i孔溶液相對吸光值 （C - R）。

1.4 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析

采用SPSS19.0軟件對試驗數(shù)據(jù)進行方差分析、相關(guān)分析、主成分分析、聚類分析和對應(yīng)分析；差異顯著性采用LSD等方法進行檢驗，采用Origin 8.5軟件繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 畜禽糞肥添加及干濕交替強度處理土壤的平均顏色變化率

由圖1可知，無添加畜禽糞肥對照土壤微孔板中每孔的平均顏色變化率（AWCD）很低，平均值僅為0.09，而添加雞糞肥和豬糞肥處理土壤其AWCD值分別為對照的4.5倍和5.9 倍，極顯著高于對照土壤。干濕交替明顯改變了AWCD值，恒定含水量下培養(yǎng)土壤的AWCD值最低；弱干濕交替脅迫顯著提高了對照和添加雞糞肥處理土壤AWCD值，但對添加豬糞肥處理土壤沒有明顯影響。對照AWCD值沒有受強干濕交替脅迫的影響，但強干濕交替能顯著改善添加畜禽糞肥土壤AWCD值（圖1A）。

BIOLOG微孔板中A1孔沒有添加碳源，其OD值的變化和大小代表著土壤微生物群落活性。由圖1B可知，AWCD值隨著A1孔OD值的增大成指數(shù)型增長（r = 0.91，P＜ 0.01）。

圖1 畜禽糞肥添加及干濕交替培養(yǎng)對AWCD的影響（A）及A1孔OD值與各孔AWCD的關(guān)系（B）

2.2 畜禽糞肥添加及干濕交替強度處理土壤微生物群落碳源利用動態(tài)

圖2顯示了畜禽糞肥添加和干濕交替培養(yǎng)后土壤微生物群落對ECO微孔板中31種碳源的平均利用率。由圖2可知，無添加對照土壤微生物群落利用碳源能力最弱，AWCD均值低于0.6；與對照比較，添加畜禽糞肥均能明顯提高土壤微生物對碳源的利用能力。

干濕交替脅迫強度能明顯改變土壤微生物群落對碳源的利用能力（圖2）。與恒定含水量培養(yǎng)條件比較，干濕交替脅迫均顯著提高了對照和添加雞糞肥處理土壤中微生物群落對碳源的平均利用能力（圖2A、B）；干濕交替脅迫后添加豬糞肥土壤對碳源利用能力表現(xiàn)為前期促進而后期有抑制作用（圖2C）。

由圖3可知，對照土壤微生物群落對胺類碳源利用率非常低，胺類碳源幾乎沒有被微生物利用；畜禽糞肥的添加顯著提高了土壤微生物對胺類碳源的利用能力，而豬糞肥的效果明顯好于雞糞肥的添加。干濕交替培養(yǎng)對土壤微生物群落利用胺類碳源的利用能力產(chǎn)生了影響，但主要表現(xiàn)在添加雞糞肥土壤上，對添加豬糞肥土壤影響甚微。

圖2 畜禽糞肥添加及干濕交替強度處理對所有碳源利用率的影響

圖3 畜禽糞肥添加及干濕交替強度處理對胺類碳源利用率的影響

從圖4可以看出，對照土壤微生物群落對氨基酸類碳源利用率較低，僅為添加畜禽糞肥土壤AWCD均值的1/2左右；與添加豬糞肥比較，雞糞肥添加對土壤AWCD值有一定程度的提高。干濕交替強度能明顯提高土壤微生物群落對氨基酸類碳源的利用能力，其中在添加雞糞肥處理土壤上表現(xiàn)最為明顯。

圖4 畜禽糞肥添加及干濕交替強度處理對氨基酸類碳源利用率的影響

由圖5可知，添加畜禽糞肥顯著提高了土壤中微生物群落對碳水化合物類碳源的利用能力，添加雞糞肥和豬糞肥處理土壤AWCD值均為無添加對照土壤的3倍以上。干濕交替強度處理也能明顯影響土壤微生物群落對碳水化合物類碳源的利用能力，但主要表現(xiàn)在添加畜禽糞肥處理土壤上，其中在添加雞糞肥土壤上，干濕交替處理AWCD值明顯高于恒定含水量培養(yǎng)處理土壤。干濕交替強度對無添加對照土壤微生物利用碳水化合物類碳源的利用影響較小。

與添加畜禽糞肥土壤比較，對照土壤微生物群落對聚合物類碳源利用能力最低（圖6）。干濕交替顯著地改變了土壤微生物對聚合物類碳源的利用能力。在對照土壤上，弱干濕交替能激活土壤微生物對聚合物類碳源的利用，AWCD值表現(xiàn)為最大（圖6A）；在添加雞糞肥土壤上，干濕交替均能顯著改善土壤微生物群落對聚合物類碳源的利用，但強干濕交替處理極顯著地促進了微生物群落對聚合物類碳源的利用（圖6B）；然而在添加豬糞肥土壤上，強干濕交替處理培養(yǎng)前期AWCD最高，但84 h后該處理土壤微生物群落對聚合物碳源的持續(xù)利用能力明顯下降（圖6C）。

圖5 畜禽糞肥添加及干濕交替強度處理對碳水化合物類碳源利用率的影響

圖6 畜禽糞肥添加及干濕交替強度處理對聚合物類碳源利用率的影響

與對其他碳源利用情況比較，土壤微生物對羧酸類和其他雜類碳源利用能力偏低。但是添加畜禽糞肥還是促進了土壤微生物對該類碳源的利用，添加雞糞肥和豬糞肥土壤AWCD值均高于對照（圖7、圖8）。

2.3 畜禽糞肥添加及干濕交替強度處理土壤微生物群落功能多樣性指數(shù)

由表1可知，對照土壤的豐富度較低，平均僅為4.11，畜禽糞肥添加明顯提高了土壤微生物群落豐富度，添加雞糞肥和豬糞肥土壤微生物豐富度指數(shù)分別為15.00和19.67，為對照土壤的3.65倍和4.78倍。干濕交替培養(yǎng)能明顯提高土壤微生物種群豐富度，除添加豬糞肥土壤弱干濕培養(yǎng)土壤外，干濕交替培養(yǎng)土壤豐富度均顯著高于恒定含水量培養(yǎng)土壤。

辛普森（Simpson）多樣性指數(shù)通常用來評價某些常見種的優(yōu)勢度。從表1可以看出，添加畜禽糞肥有利于土壤微生物 Simpson多樣性指數(shù)的提高，與對照比較，添加雞糞肥和豬糞肥土壤辛普森指數(shù)分別提高124.56%和164.29%。干濕交替過程對土壤微生物辛普森指數(shù)有明顯改善作用，所有處理均達到顯著水平。

多樣性包括利用基質(zhì)的豐富度和均勻度兩個方面，香農(nóng)指數(shù)（Shannon）同時包含了基質(zhì)利用豐富度和均勻度的信息。表1結(jié)果顯示，添加畜禽糞肥顯著提高了土壤微生物功能多樣性Shannon指數(shù)和均勻度；干濕交替處理對添加畜禽糞肥土壤Shannon多樣性指數(shù)和均勻度也有明顯改善作用。

圖7 畜禽糞肥添加及干濕交替強度處理對羧酸類碳源利用率的影響

圖8 畜禽糞肥添加及干濕交替強度處理對其他雜類碳源利用率的影響

表1 畜禽糞肥添加及干濕交替強度處理對土壤微生物功能多樣性指數(shù)的影響（60 h）

McIntoch多樣性指數(shù)常用于評價微生物群落物種均一性，也同時包含了基質(zhì)利用豐富度和均勻度的信息。與未添加畜禽糞肥比較，添加雞糞肥和豬糞肥顯著地提高了土壤微生物群落McIntoch多樣性指數(shù)；干濕交替培養(yǎng)對土壤微生物功能McIntoch多樣性指數(shù)也產(chǎn)生明顯的正效應(yīng)。但是畜禽糞肥添加對土壤微生物McIntoch均勻度沒有明顯影響，而干濕交替培養(yǎng)對McIntoch均勻度的影響也僅表現(xiàn)在添加豬糞肥處理，但差異較?。ū?）。

2.4 土壤微生物群落功能多樣性差異分析

分別利用因子分析（圖9）和聚類分析（圖10）對畜禽糞肥添加和干濕交替培養(yǎng)對土壤微生物群落功能多樣性影響因素進行分析。因子分析和聚類分析結(jié)果一致表明，添加畜禽糞肥是導致土壤微生物群落功能多樣性改變的主要因子，其次為干濕交替強度，不同畜禽糞肥間也有一定的影響。

圖9 畜禽糞肥添加及干濕交替培養(yǎng)對土壤微生物群落功能多樣性因子分析

圖10 畜禽糞肥添加及干濕交替培養(yǎng)對土壤微生物群落功能多樣性聚類分析

由于畜禽糞肥的添加和干濕交替培養(yǎng)作用，土壤微生物群落對6類31種碳源的利用產(chǎn)生了明顯的改變。因子分析結(jié)果（圖11）表明，對土壤微生物群落功能多樣性產(chǎn)生明顯影響的第一主要影響碳源13種，分屬于5類碳源：（1）碳水化合物類碳源，有β-甲基-D-葡萄糖苷（A2）、D-木糖/戊醛糖（B2）、D-甘露醇（D2）、N-乙酰-D葡萄糖氨（E2）、D-纖維二糖（G1）；（2）聚合物類碳源，包括吐溫40（C1）、吐溫 80（D1）；（3）羧酸類碳源，有D-半乳糖醛酸（B3）、D-蘋果酸（H3）；（4）氨基酸類碳源，包括L-天門冬酰胺（B4）、L-苯丙氨酸（C4）；（5）其他類碳源，有1-磷酸葡萄糖（G2）、D，L-α-磷酸甘油（H2）；第二主要影響碳源有4種，D-葡糖胺酸（F2）和苯乙胺（G4）分屬羧酸類和胺類，L-精氨酸（A4）和L-絲氨酸（D4）則屬于氨基酸類；第三主要影響碳源有2種為氨基酸類碳源的L-蘇氨酸（E4）和甘氨酰-L-谷氨酸（F4）。由此可見，碳水化合物類和氨基酸類碳源是影響土壤微生物功能多樣性的主要碳源。

聚類分析結(jié)果（圖12）表明，影響微生物功能多樣性6類碳源可以分為三大類，一是以氨基酸類為主包括聚合物類、羧酸類和其他雜類碳源；二是碳水化合物類碳源；三是胺類碳源。由于ECO板中胺類碳源僅有2種，因此，影響土壤微生物功能多樣性碳源主要為兩類，碳水化合物類和氨基酸代表類，與因子分析結(jié)果一致。

為了進一步了解畜禽糞肥添加和干濕交替培養(yǎng)分別主要影響土壤微生物群落對特別碳源的利用，我們對不同處理和31種碳源進行了對應(yīng)分析。分析結(jié)果（圖13）顯示，不同添加畜禽糞肥和干濕交替培養(yǎng)土壤得到了較好的分開，第1象限為添加雞糞肥干濕交替培養(yǎng)土壤，其主要利用吐溫 40（C1）、i-赤蘚糖醇（C2）、2-羥基苯甲酸（C3）、D-木糖/戊醛糖（B2）、D-半乳糖醛酸（B3）、γ-羥丁酸（E3）、L-蘇氨酸（E4）、衣康酸（F3）、甘氨酰-L-谷氨酸（F4）、β-甲基-D-葡萄糖苷（A2）和D，L-α-磷酸甘油（H2）等碳源；第4象限為添加豬糞肥培養(yǎng)土壤，其主要利用α-環(huán)式糊精（E1）、D-葡糖胺酸（F2）、α-D-乳糖（H1）、L-精氨酸（A4）、苯乙胺（G4）、4-羥基苯甲酸（D3）和D-半乳糖酸γ-內(nèi)酯（A3）等碳源；第2和第3象限主要包括對照土壤和恒定含水量培養(yǎng)土壤，主要利用的碳源較少有α-丁酮酸（G3）、4-羥基苯甲酸（D3）、丙酮酸甲酯（B1）、肝糖（F1）等碳源。

圖11 畜禽糞肥添加及干濕交替培養(yǎng)對6類碳源的利用分析

圖12 影響微生物功能多樣性6類碳源的聚類分析

3 結(jié)論與討論

圖13 畜禽糞肥添加及干濕交替強度處理與6類碳源利用的對應(yīng)分析

土壤微生物群落是土壤質(zhì)量和功能的關(guān)鍵組成[15]。通過了解土壤微生物群落活性、組成和功能多樣性有助于我們更好地了解和調(diào)控生態(tài)功能，因為生態(tài)系統(tǒng)抵抗外界嚴重擾動的能力部分地取決于生態(tài)系統(tǒng)內(nèi)部微生物組成部分[16]。土壤生物在土壤碳循環(huán)、有機物的分解和土壤肥力的保持等方面起著非常關(guān)鍵的作用，因此，保持和提高土壤微生物多樣性是非常必要的。BIOLOG微孔板中的碳源代表一系列復合物可以用于估計土壤微生物代謝功能多樣性的相對潛力[17]。平均顏色變化反映了Biolog微孔板中土壤微生物對單一碳源的氧化利用能力，可以作為反映土壤微生物活性和群落功能多樣性的指標[18]。

許多研究表明，施用有機物料能夠刺激土壤微生物群落的生長。本研究結(jié)果表明，與未添加畜禽糞肥土壤比較，畜禽糞肥的添加顯著地增加了AWCD值，也顯著提高了土壤微生物群落豐富度、辛普森指數(shù)以及香農(nóng)指數(shù)。說明添加畜禽糞肥刺激了土壤微生物群落的生長、提高了微生物活性，也提高了土壤微生物群落的功能多樣性。Gomez等[19]研究發(fā)現(xiàn)添加有機肥顯著提高了土壤微生物AWCD和香農(nóng)指數(shù)。Wada等[20]研究表明施用農(nóng)家肥后土壤微生物多樣性明顯提高。Perucci[21]和 Marinari等[22]通過測定脫氫酶活性來表征土壤微生物多樣性，結(jié)果表明施用堆肥能顯著地提高土壤微生物多樣性。畜禽糞肥的添加之所以能夠提高土壤微生物活性及功能多樣性可能與畜禽糞肥施用增加了土壤活性有機質(zhì)含量和提高了微生物基質(zhì)的有效性，從而刺激了不同微生物生物量生長，而畜禽糞肥的不同種類則影響土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的組成。另外本試驗在干濕交替脅迫解除之后，土壤均在60%～80%的田間持水量條件下進行了為期7 d的恒溫培養(yǎng)。適宜的生存環(huán)境以及干燥過程死亡的微生物、微生物釋放的胞內(nèi)活性基質(zhì)養(yǎng)分、土壤膠體的分解以及有機質(zhì)暴露為存活和休眠微生物提供了充足的碳源和能量，使得干濕交替培養(yǎng)處理土壤微生物群落生物量、活性和群落功能多樣性顯著提高。

本研究結(jié)果表明，干濕交替能顯著地改變土壤微生物功能多樣性。與恒定含水量培養(yǎng)土壤比較，干濕交替培養(yǎng)土壤顯著提高了AWCD、群落豐富度、辛普森指數(shù)以及香農(nóng)指數(shù)，并且有隨著干濕交替強度增加而提高的趨勢。干濕交替是通過改變土壤水勢來對土壤微生物產(chǎn)生脅迫的[12]。土壤水勢的快速變化導致土壤中不適應(yīng)環(huán)境變化微生物死亡或者失去活性，而通過自身調(diào)整經(jīng)受住了濕交替脅迫的土壤微生物得以存活并保持活性，從而可能影響土壤微生物生物量數(shù)量和組成[23]。這些在干濕交替過程中得以存活下來的土壤微生物群落，可能對土壤中某些碳源具有優(yōu)先利用的偏好，從而使得土壤微生物群落表現(xiàn)出對碳源的利用能力的差異[24]，另外對土壤中碳源利用能力的變化也可能是土壤微生物群落對干濕交替環(huán)境的變化的一種適應(yīng)。畜禽糞肥的差異也影響了土壤微生物群落適應(yīng)干濕交替脅迫的能力[25]。干濕交替脅迫后，添加雞糞和豬糞肥土壤微生物群落功能多樣性明顯提高。畜禽糞肥中有機和無機養(yǎng)分的差異可能是改變土壤微生物群落適應(yīng)干濕交替脅迫能力的重要原因，養(yǎng)分元素的差異能夠影響微生物對養(yǎng)分的吸收和利用，從而改變土壤微生物細胞壁組成和體內(nèi)的滲透壓[10]，影響其應(yīng)對干濕交替脅迫的適應(yīng)能力。

總之，添加畜禽糞肥能夠顯著改善土壤微生物群落功能多樣性，微生物碳源利用能力提高了4～5倍，添加畜禽糞肥處理土壤微生物多樣性指數(shù)均明顯高于對照土壤。干濕交替強度對微生物群落功能多樣性也產(chǎn)生了明顯的影響。因子分析和聚類分析結(jié)果顯示，添加畜禽糞肥是土壤微生物群落功能多樣變化的主控因子，而干濕交替脅迫是第二控制因子。添加畜禽糞肥主要是通過改變土壤中碳水化合物和氨基酸類碳源來影響土壤微生物群落功能多樣性，而干濕交替主要是通過調(diào)整微生物群落來影響其功能多樣性。