高效液相色譜－示差折光檢測(cè)器法測(cè)定?；撬犷w粒和滴眼液中?；撬岷?/h1>
2018-08-29 11:34:26仵淑紅王麗霞
中國(guó)藥業(yè) 2018年17期
仵淑紅，王麗霞
（北京市東城區(qū)食品藥品安全監(jiān)控中心，北京 100050）
牛磺酸（taurine）廣泛分布于人體內(nèi)各組織、器官，是人體生長(zhǎng)、發(fā)育必需的氨基酸。?；撬釋?duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)、視覺(jué)發(fā)育系統(tǒng)有重要作用，還具有增強(qiáng)心肌收縮力、抗心律失常、鈣流動(dòng)調(diào)控、促進(jìn)膽汁分泌、解毒、提高機(jī)體免疫等生物學(xué)功能［1］。?；撬犷w粒作為解熱鎮(zhèn)痛藥，可緩解感冒初期的發(fā)熱，適用于感冒、扁桃體炎、支氣管炎、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等。?；撬岬窝垡河糜谂；撬岽x失調(diào)引起的白內(nèi)障治療，也可用于急性結(jié)膜炎、皰疹性結(jié)膜炎、病毒性結(jié)膜炎的輔助治療。由于?；撬岬淖贤馕蛰^弱，2015 年版《中國(guó)藥典（二部）》［2］對(duì)?；撬崞瑒?、膠囊劑和散劑采用中和滴定方法測(cè)?；撬岷?，方法衍生步驟比較煩瑣，同時(shí)要求在反應(yīng)管中進(jìn)行，對(duì)儀器的配置要求較高。其他測(cè)定方法還有高效液相色譜－蒸發(fā)光散射檢測(cè)法［3］、自動(dòng)電位滴定法［4］、分光光度法［5］、質(zhì)譜法［6］等。國(guó)家藥品標(biāo)準(zhǔn)［7］采用苯乙烯共聚體與磺基（Ca－配位）結(jié)合的凝膠為填充劑，內(nèi)消旋肌醇為內(nèi)標(biāo)物的高效液相色譜－示差折光檢測(cè)器法可對(duì)復(fù)方?；撬岬窝垡褐信；撬岢煞诌M(jìn)行分析。本研究中采用示差折光檢測(cè)器，NH2柱為分析柱，建立了?；撬犷w粒和牛磺酸滴眼液中?；撬岷康母咝б合嗌V分析方法。現(xiàn)報(bào)道如下。
1 儀器與試藥
儀器：Agilent 1260 Infinity高效液相色譜儀，Agilent 1260示差折光檢測(cè)器（1260－RID）；XP205型電子天平（梅特勒－托利多）；Satorius 611DI純化水系統(tǒng)；FB15065型超聲波清洗器（Fisher Scientific）。
試藥：?；撬釋?duì)照品（批號(hào)為111616－201605，含量為 100．0% ），丙氨酸對(duì)照品（批號(hào)為 140680－200803，含量為99．9%），均購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院；?；撬犷w粒（A廠，批號(hào)為160601；B廠，批號(hào)為20160522；C廠，批號(hào)為 151108），規(guī)格均為每袋0．4 g；牛磺酸滴眼液（A 廠，批號(hào)為 16011501，規(guī)格為每支 0．4 g∶8 mL）；?；撬岬窝垡海˙廠，批號(hào)為161204，規(guī)格為每支0．5 g∶10 mL）；?；撬岬窝垡海–廠，批號(hào)為 161001，規(guī)格為0．5 g ∶10 mL）；乙腈為 Fisher Chemical色譜純，試驗(yàn)用水為超純水。
2 方法與結(jié)果
2．1 溶液制備
取?；撬釋?duì)照品適量，精密稱定，置容量瓶中，加流動(dòng)相溶解，制成質(zhì)量濃度為1．6 g／L的?；撬釋?duì)照品貯備液；精密量取5 mL，置20 mL容量瓶中，加流動(dòng)相稀釋至刻度，得質(zhì)量濃度為0．4 g／L的對(duì)照品溶液。
取?；撬犷w粒細(xì)粉適量（相當(dāng)于?；撬?00 mg），精密稱定，置50 mL容量瓶中，加流動(dòng)相溶解并稀釋至刻度，搖勻，濾過(guò)，制成質(zhì)量濃度為2 g／L的牛磺酸顆粒供試品貯備液；精密量取續(xù)濾液5 mL，置25 mL容量瓶中，加流動(dòng)相稀釋至刻度，制成質(zhì)量濃度為0．4 g／L的?；撬犷w粒供試品溶液A。精密量取?；撬岬窝垡? mL（相當(dāng)于?；撬?00 mg），置50 mL容量瓶中，加流動(dòng)相溶解并稀釋至刻度，搖勻，濾過(guò)，制成質(zhì)量濃度為2 g／L的?；撬岬窝垡嘿A備液；精密量取續(xù)濾液5 mL，置25 mL容量瓶中，加流動(dòng)相稀釋至刻度，制成質(zhì)量濃度為0．4g／L的供試品溶液B。取流動(dòng)相，即得空白溶液。
取?；撬岷捅彼釋?duì)照品各約10 mg，精密稱取，置25 mL容量瓶中，加流動(dòng)相溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得系統(tǒng)適用性試驗(yàn)溶液。
2．2 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)
色譜柱：Waters NH2柱（250 mm ×4．6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：水 －乙腈（40 ∶60）；流速：0．8 mL ／min；柱溫：35．0 ℃；參比池溫度：35．0 ℃；檢測(cè)池溫度：35．0 ℃；進(jìn)樣量：20 μL。分別取 2．1 項(xiàng)下 5 種溶液，按擬訂色譜條件進(jìn)樣，?；撬岜Ａ魰r(shí)間為6．217 min，丙氨酸保留時(shí)間為 6．873 min，丙氨酸與?；撬嵬耆蛛x，分離度為2．66，?；撬岱謇碚摪鍞?shù)為11 614。在供試品溶液A色譜圖中，牛磺酸保留時(shí)間為 6．273 min，5．601 min 處出現(xiàn)一峰，兩峰分離度為3．03，該峰對(duì)?；撬岬臏y(cè)定無(wú)干擾；供試品溶液B色譜圖中，除溶劑外未發(fā)現(xiàn)干擾峰。色譜圖見(jiàn)圖1。
圖1 高效液相色譜圖
2．3 方法學(xué)考察
線性關(guān)系考察：取?；撬釋?duì)照品約50 mg，精密稱定，置25 mL容量瓶中，加流動(dòng)相溶解并稀釋至刻度，搖勻；分別精密量取 5．00，4．00，3．00，2．00，1．00，0．50，0．25 mL，置 10 mL 容量瓶中，制成質(zhì)量濃度為 1．00，0．80，0．60，0．40，0．20，0．10，0．05 g ／L 的?；撬釋?duì)照品溶液。按擬訂色譜條件，進(jìn)樣20 μL，記錄峰面積，以質(zhì)量濃度（X）為橫坐標(biāo)、峰面積（Y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程 Y＝195 768．56X ＋1 085．93，r＝0．998 58（n ＝7）。結(jié)果表明，?；撬豳|(zhì)量濃度在 0．05 ～1．00 g／L范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。
精密度試驗(yàn)：分別取線性關(guān)系考察項(xiàng)下質(zhì)量濃度為1．00，0．40，0．05 g／L 的對(duì)照品溶液，按擬訂色譜條件進(jìn)樣 20 μL，結(jié)果的 RSD 分別為 0．31% ，0．37% ，0．36%（n＝5），表明儀器精密度良好。
穩(wěn)定性試驗(yàn)：取質(zhì)量濃度為0．4 g／L的對(duì)照品溶液，室溫放置，按擬訂色譜條件分別在制備后0，1，2，4，6，20，24 h 時(shí)進(jìn)樣 20 μL。結(jié)果的 RSD 為 0．28%（n ＝7），表明對(duì)照品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。
表1 牛磺酸加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n＝9）
檢測(cè)限確定：取質(zhì)量濃度為0．4 g／L的?；撬釋?duì)照品溶液，逐步稀釋，按擬訂色譜條件進(jìn)樣20 μL，記錄色譜圖。結(jié)果信噪比為 3 ／1 時(shí)，檢測(cè)限為 0．5 μg ／mL。
加樣回收試驗(yàn)：分別精密量取2．1項(xiàng)下?；撬犷w粒供試品貯備液 1．6，2．0，2．4 mL，共 9 份，分別置 10 mL容量瓶中，分別加入?；撬釋?duì)照品貯備液 2．0，2．5，3．0 mL，加流動(dòng)相稀釋至刻度，按擬訂色譜條件分別進(jìn)樣20 μL，記錄色譜圖，計(jì)算回收率。結(jié)果見(jiàn)表1。精密量取2．1項(xiàng)下牛磺酸滴眼液供試品貯備液2 mL，共9份，分別置10 mL容量瓶中，以80%，100%，120%3個(gè)水平濃度精密加入牛磺酸對(duì)照品貯備液2．0，2．5，3．0 mL，加流動(dòng)相稀釋至刻度，按擬訂色譜條件分別進(jìn)樣20 μL，記錄色譜圖，計(jì)算回收率。結(jié)果見(jiàn)表1。
2．4 樣品含量測(cè)定
取3批?；撬犷w粒、?；撬岬窝垡汉团；撬釋?duì)照品適量，精密稱定，依法制備供試品溶液和對(duì)照品溶液，按擬訂色譜條件分別進(jìn)樣20 μL，記錄色譜圖，按外標(biāo)法計(jì)算含量。結(jié)果3批牛磺酸顆粒樣品（批號(hào)分別為160601，20160522，151108）的?；撬岷糠謩e為98．33%，103．42%，100．54%；3批?；撬岬窝垡簶悠罚ㄅ?hào)分別為 16011501，161204，161001）的?；撬岷糠謩e為93．67%，96．65%，99．08% 。
3 討論
?；撬峄瘜W(xué)結(jié)構(gòu)式H2N—CH2—CH2—SO3H，相對(duì)分子量為125．15，易溶于水，不溶于無(wú)水乙醇、乙醚和丙酮。由于?；撬岱肿恿肯鄬?duì)較小，無(wú)苯基類疏水集團(tuán)，在藥物分析常用的十八烷基硅膠柱上的保留能力較弱，試驗(yàn)初期采用C18柱，水－乙腈不同比例分析，其保留時(shí)間比較短。分子中具有極性氨基、磺基親水基團(tuán)，在水和乙腈體系流動(dòng)相中，能與氨基柱的氨基基團(tuán)達(dá)到保留，增大流動(dòng)相中乙腈的比例，牛磺酸的保留時(shí)間增加，水－乙腈（40∶60）流動(dòng)相條件下，氨基柱對(duì)?；撬岬谋Ａ魰r(shí)間達(dá)到6 min，理論板數(shù)達(dá)11 614，分離效果良好。由于?；撬崛芙饽芰ο拗?，繼續(xù)增加流動(dòng)相中乙腈比例至水－乙腈（30∶70），?；撬岵荒艹浞秩芙?，因此選擇水－乙腈（40∶60）為流動(dòng)相，氨基柱為分析柱。
2015 年版《中國(guó)藥典》［2］、美國(guó)藥典 USP35 －NF30［8］和日本藥典JP17［9］，未收載明確的?；撬犭s質(zhì)。參考2015 年版《中國(guó)藥典》［2］和文獻(xiàn)［10］，選擇丙氨酸和?；撬嶙鳛橄到y(tǒng)適用性溶液考察方法的專屬性，分離度良好。專屬性試驗(yàn)表明，在?；撬嵘V峰處無(wú)干擾峰。加樣回收試驗(yàn)結(jié)果表明，回收率滿足要求。
仵淑紅，王麗霞
（北京市東城區(qū)食品藥品安全監(jiān)控中心，北京 100050）
牛磺酸（taurine）廣泛分布于人體內(nèi)各組織、器官，是人體生長(zhǎng)、發(fā)育必需的氨基酸。?；撬釋?duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)、視覺(jué)發(fā)育系統(tǒng)有重要作用，還具有增強(qiáng)心肌收縮力、抗心律失常、鈣流動(dòng)調(diào)控、促進(jìn)膽汁分泌、解毒、提高機(jī)體免疫等生物學(xué)功能［1］。?；撬犷w粒作為解熱鎮(zhèn)痛藥，可緩解感冒初期的發(fā)熱，適用于感冒、扁桃體炎、支氣管炎、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等。?；撬岬窝垡河糜谂；撬岽x失調(diào)引起的白內(nèi)障治療，也可用于急性結(jié)膜炎、皰疹性結(jié)膜炎、病毒性結(jié)膜炎的輔助治療。由于?；撬岬淖贤馕蛰^弱，2015 年版《中國(guó)藥典（二部）》［2］對(duì)?；撬崞瑒?、膠囊劑和散劑采用中和滴定方法測(cè)?；撬岷?，方法衍生步驟比較煩瑣，同時(shí)要求在反應(yīng)管中進(jìn)行，對(duì)儀器的配置要求較高。其他測(cè)定方法還有高效液相色譜－蒸發(fā)光散射檢測(cè)法［3］、自動(dòng)電位滴定法［4］、分光光度法［5］、質(zhì)譜法［6］等。國(guó)家藥品標(biāo)準(zhǔn)［7］采用苯乙烯共聚體與磺基（Ca－配位）結(jié)合的凝膠為填充劑，內(nèi)消旋肌醇為內(nèi)標(biāo)物的高效液相色譜－示差折光檢測(cè)器法可對(duì)復(fù)方?；撬岬窝垡褐信；撬岢煞诌M(jìn)行分析。本研究中采用示差折光檢測(cè)器，NH2柱為分析柱，建立了?；撬犷w粒和牛磺酸滴眼液中?；撬岷康母咝б合嗌V分析方法。現(xiàn)報(bào)道如下。
1 儀器與試藥
儀器：Agilent 1260 Infinity高效液相色譜儀，Agilent 1260示差折光檢測(cè)器（1260－RID）；XP205型電子天平（梅特勒－托利多）；Satorius 611DI純化水系統(tǒng)；FB15065型超聲波清洗器（Fisher Scientific）。
試藥：?；撬釋?duì)照品（批號(hào)為111616－201605，含量為 100．0% ），丙氨酸對(duì)照品（批號(hào)為 140680－200803，含量為99．9%），均購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院；?；撬犷w粒（A廠，批號(hào)為160601；B廠，批號(hào)為20160522；C廠，批號(hào)為 151108），規(guī)格均為每袋0．4 g；牛磺酸滴眼液（A 廠，批號(hào)為 16011501，規(guī)格為每支 0．4 g∶8 mL）；?；撬岬窝垡海˙廠，批號(hào)為161204，規(guī)格為每支0．5 g∶10 mL）；?；撬岬窝垡海–廠，批號(hào)為 161001，規(guī)格為0．5 g ∶10 mL）；乙腈為 Fisher Chemical色譜純，試驗(yàn)用水為超純水。
2 方法與結(jié)果
2．1 溶液制備
取?；撬釋?duì)照品適量，精密稱定，置容量瓶中，加流動(dòng)相溶解，制成質(zhì)量濃度為1．6 g／L的?；撬釋?duì)照品貯備液；精密量取5 mL，置20 mL容量瓶中，加流動(dòng)相稀釋至刻度，得質(zhì)量濃度為0．4 g／L的對(duì)照品溶液。
取?；撬犷w粒細(xì)粉適量（相當(dāng)于?；撬?00 mg），精密稱定，置50 mL容量瓶中，加流動(dòng)相溶解并稀釋至刻度，搖勻，濾過(guò)，制成質(zhì)量濃度為2 g／L的牛磺酸顆粒供試品貯備液；精密量取續(xù)濾液5 mL，置25 mL容量瓶中，加流動(dòng)相稀釋至刻度，制成質(zhì)量濃度為0．4 g／L的?；撬犷w粒供試品溶液A。精密量取?；撬岬窝垡? mL（相當(dāng)于?；撬?00 mg），置50 mL容量瓶中，加流動(dòng)相溶解并稀釋至刻度，搖勻，濾過(guò)，制成質(zhì)量濃度為2 g／L的?；撬岬窝垡嘿A備液；精密量取續(xù)濾液5 mL，置25 mL容量瓶中，加流動(dòng)相稀釋至刻度，制成質(zhì)量濃度為0．4g／L的供試品溶液B。取流動(dòng)相，即得空白溶液。
取?；撬岷捅彼釋?duì)照品各約10 mg，精密稱取，置25 mL容量瓶中，加流動(dòng)相溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得系統(tǒng)適用性試驗(yàn)溶液。
2．2 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)
色譜柱：Waters NH2柱（250 mm ×4．6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：水 －乙腈（40 ∶60）；流速：0．8 mL ／min；柱溫：35．0 ℃；參比池溫度：35．0 ℃；檢測(cè)池溫度：35．0 ℃；進(jìn)樣量：20 μL。分別取 2．1 項(xiàng)下 5 種溶液，按擬訂色譜條件進(jìn)樣，?；撬岜Ａ魰r(shí)間為6．217 min，丙氨酸保留時(shí)間為 6．873 min，丙氨酸與?；撬嵬耆蛛x，分離度為2．66，?；撬岱謇碚摪鍞?shù)為11 614。在供試品溶液A色譜圖中，牛磺酸保留時(shí)間為 6．273 min，5．601 min 處出現(xiàn)一峰，兩峰分離度為3．03，該峰對(duì)?；撬岬臏y(cè)定無(wú)干擾；供試品溶液B色譜圖中，除溶劑外未發(fā)現(xiàn)干擾峰。色譜圖見(jiàn)圖1。
圖1 高效液相色譜圖
2．3 方法學(xué)考察
線性關(guān)系考察：取?；撬釋?duì)照品約50 mg，精密稱定，置25 mL容量瓶中，加流動(dòng)相溶解并稀釋至刻度，搖勻；分別精密量取 5．00，4．00，3．00，2．00，1．00，0．50，0．25 mL，置 10 mL 容量瓶中，制成質(zhì)量濃度為 1．00，0．80，0．60，0．40，0．20，0．10，0．05 g ／L 的?；撬釋?duì)照品溶液。按擬訂色譜條件，進(jìn)樣20 μL，記錄峰面積，以質(zhì)量濃度（X）為橫坐標(biāo)、峰面積（Y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程 Y＝195 768．56X ＋1 085．93，r＝0．998 58（n ＝7）。結(jié)果表明，?；撬豳|(zhì)量濃度在 0．05 ～1．00 g／L范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。
精密度試驗(yàn)：分別取線性關(guān)系考察項(xiàng)下質(zhì)量濃度為1．00，0．40，0．05 g／L 的對(duì)照品溶液，按擬訂色譜條件進(jìn)樣 20 μL，結(jié)果的 RSD 分別為 0．31% ，0．37% ，0．36%（n＝5），表明儀器精密度良好。
穩(wěn)定性試驗(yàn)：取質(zhì)量濃度為0．4 g／L的對(duì)照品溶液，室溫放置，按擬訂色譜條件分別在制備后0，1，2，4，6，20，24 h 時(shí)進(jìn)樣 20 μL。結(jié)果的 RSD 為 0．28%（n ＝7），表明對(duì)照品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。
表1 牛磺酸加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n＝9）
檢測(cè)限確定：取質(zhì)量濃度為0．4 g／L的?；撬釋?duì)照品溶液，逐步稀釋，按擬訂色譜條件進(jìn)樣20 μL，記錄色譜圖。結(jié)果信噪比為 3 ／1 時(shí)，檢測(cè)限為 0．5 μg ／mL。
加樣回收試驗(yàn)：分別精密量取2．1項(xiàng)下?；撬犷w粒供試品貯備液 1．6，2．0，2．4 mL，共 9 份，分別置 10 mL容量瓶中，分別加入?；撬釋?duì)照品貯備液 2．0，2．5，3．0 mL，加流動(dòng)相稀釋至刻度，按擬訂色譜條件分別進(jìn)樣20 μL，記錄色譜圖，計(jì)算回收率。結(jié)果見(jiàn)表1。精密量取2．1項(xiàng)下牛磺酸滴眼液供試品貯備液2 mL，共9份，分別置10 mL容量瓶中，以80%，100%，120%3個(gè)水平濃度精密加入牛磺酸對(duì)照品貯備液2．0，2．5，3．0 mL，加流動(dòng)相稀釋至刻度，按擬訂色譜條件分別進(jìn)樣20 μL，記錄色譜圖，計(jì)算回收率。結(jié)果見(jiàn)表1。
2．4 樣品含量測(cè)定
取3批?；撬犷w粒、?；撬岬窝垡汉团；撬釋?duì)照品適量，精密稱定，依法制備供試品溶液和對(duì)照品溶液，按擬訂色譜條件分別進(jìn)樣20 μL，記錄色譜圖，按外標(biāo)法計(jì)算含量。結(jié)果3批牛磺酸顆粒樣品（批號(hào)分別為160601，20160522，151108）的?；撬岷糠謩e為98．33%，103．42%，100．54%；3批?；撬岬窝垡簶悠罚ㄅ?hào)分別為 16011501，161204，161001）的?；撬岷糠謩e為93．67%，96．65%，99．08% 。
3 討論
?；撬峄瘜W(xué)結(jié)構(gòu)式H2N—CH2—CH2—SO3H，相對(duì)分子量為125．15，易溶于水，不溶于無(wú)水乙醇、乙醚和丙酮。由于?；撬岱肿恿肯鄬?duì)較小，無(wú)苯基類疏水集團(tuán)，在藥物分析常用的十八烷基硅膠柱上的保留能力較弱，試驗(yàn)初期采用C18柱，水－乙腈不同比例分析，其保留時(shí)間比較短。分子中具有極性氨基、磺基親水基團(tuán)，在水和乙腈體系流動(dòng)相中，能與氨基柱的氨基基團(tuán)達(dá)到保留，增大流動(dòng)相中乙腈的比例，牛磺酸的保留時(shí)間增加，水－乙腈（40∶60）流動(dòng)相條件下，氨基柱對(duì)?；撬岬谋Ａ魰r(shí)間達(dá)到6 min，理論板數(shù)達(dá)11 614，分離效果良好。由于?；撬崛芙饽芰ο拗?，繼續(xù)增加流動(dòng)相中乙腈比例至水－乙腈（30∶70），?；撬岵荒艹浞秩芙?，因此選擇水－乙腈（40∶60）為流動(dòng)相，氨基柱為分析柱。
2015 年版《中國(guó)藥典》［2］、美國(guó)藥典 USP35 －NF30［8］和日本藥典JP17［9］，未收載明確的?；撬犭s質(zhì)。參考2015 年版《中國(guó)藥典》［2］和文獻(xiàn)［10］，選擇丙氨酸和?；撬嶙鳛橄到y(tǒng)適用性溶液考察方法的專屬性，分離度良好。專屬性試驗(yàn)表明，在?；撬嵘V峰處無(wú)干擾峰。加樣回收試驗(yàn)結(jié)果表明，回收率滿足要求。
