用于檢測(cè)氨基葡萄糖的金屬-有機(jī)大環(huán)化合物的合成及光譜分析

吳紅梅，郭 宇，曹建芳，陳強(qiáng)強(qiáng)，張志華

(遼寧工業(yè)大學(xué)化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院，遼寧錦州 121001)

1 引 言

氨基葡萄糖(Glu)又叫葡萄糖胺，是葡萄糖的羥基被氨基取代的產(chǎn)物，卻與葡萄糖有著不同的生理活性。氨基葡萄糖是脂類糖基化反應(yīng)和蛋白質(zhì)的前體、關(guān)節(jié)軟骨的營(yíng)養(yǎng)素，能夠幫助維護(hù)和修復(fù)軟骨，促進(jìn)軟骨蛋白聚糖的合成和軟骨細(xì)胞的生長(zhǎng)，對(duì)骨關(guān)節(jié)炎具有特殊的治療作用。而且，它具有抗衰老、抑菌、促進(jìn)減肥、吸收體內(nèi)的自由基、調(diào)節(jié)內(nèi)分泌等多種功能，在醫(yī)藥、保健品、化妝品和食品等領(lǐng)域有著重要的應(yīng)用［1-5］。因此，開發(fā)能夠高靈敏度、快速檢測(cè)氨基葡萄糖的技術(shù)，將對(duì)靶向性藥物開發(fā)、新型食品和化妝品等產(chǎn)品添加劑的合成具有重要的意義。

然而，由于糖類化合物體積大，而且每種糖類結(jié)構(gòu)間差別細(xì)微，僅通過(guò)羥基(—OH)或氨基(—NH2)活性基團(tuán)來(lái)識(shí)別和區(qū)分不同糖類化合物具有很大的難度［6-7］。大環(huán)(或籠狀)化合物具有花樣繁多的空間結(jié)構(gòu)和穩(wěn)定、豐富的光(電)信號(hào)，它特定幾何形狀的空腔及大量的分支和橋聯(lián)基團(tuán)為目標(biāo)分子提供了弱作用環(huán)境，在分子、離子識(shí)別和催化方面具有絕對(duì)的優(yōu)勢(shì)，是模擬酶催化和生物分子識(shí)別過(guò)程的重要模型［8-9］。國(guó)內(nèi)外科學(xué)家利用大環(huán)(或籠狀)化合物的特點(diǎn)，在生物分子檢測(cè)識(shí)別方面做出了諸多有價(jià)值的工作［10-12］。Davis等［13］利用富含芳環(huán)和酰胺的籠狀立體結(jié)構(gòu)和氫鍵的協(xié)同作用，實(shí)現(xiàn)了對(duì)二糖和單糖光譜識(shí)別。Fujita等［14］利用球形籠狀立體結(jié)構(gòu)研究了對(duì)糖類分子的識(shí)別;大連理工大學(xué)的段春迎課題組［15］將喹啉基團(tuán)與酰胺基團(tuán)引入到八面體籠狀化合物結(jié)構(gòu)中，實(shí)現(xiàn)了對(duì)氨基葡萄糖的識(shí)別與傳感，這些工作充分顯現(xiàn)了大環(huán)和籠狀化合物的魅力所在。

由于酰胺基團(tuán)中的羰基和氨基能夠分別與富含氫鍵位點(diǎn)的客體形成不同類型的氫鍵，而且在氫鍵形成過(guò)程中會(huì)引起主體分子骨架的電子再分配，進(jìn)而產(chǎn)生特征的識(shí)別信號(hào)，有助于對(duì)生物分子的識(shí)別研究。因此，本文首先在有機(jī)配體中引入酰胺基團(tuán)，以5-氨基異酞酸為初始原料，通過(guò)酯化、肼解和席夫堿等反應(yīng)合成含有酰胺基團(tuán)的雙三齒配體LD，再通過(guò)兩側(cè)的三齒(酰胺基團(tuán)的O、席夫堿的N和吡啶N)配位點(diǎn)與Zn2+(六配位)自組裝構(gòu)筑金屬(鋅)-有機(jī)三元大環(huán)化合物L(fēng)D-Zn，通過(guò)大環(huán)的限域作用及主客體間的氫鍵作用，并利用紫外光譜法、核磁、電噴霧質(zhì)譜等手段研究LD-Zn對(duì)氨基葡萄糖的識(shí)別作用。

2 實(shí) 驗(yàn)

2.1 儀器與試劑

儀器:熔點(diǎn)用X-6顯微熔點(diǎn)測(cè)定儀測(cè)定(美國(guó)SRS公司);電噴霧質(zhì)譜使用HPLC-Q-Tof MS型質(zhì)譜儀測(cè)定，流動(dòng)相為甲醇(美國(guó) Agilent公司);C、H、N元素分析使用Vario ELⅢ元素分析儀測(cè)定(德國(guó)Elementar公司);1H NMR使用Varian INOVA 400核磁共振譜儀測(cè)定(TMS為內(nèi)標(biāo)，美國(guó)Varian公司);紅外光譜使用Nicolet NEXUS 670 FT-IR光譜儀測(cè)定(美國(guó)Nicolet公司);紫外-可見光譜使用HP8453紫外-可見光譜儀測(cè)定(美國(guó)Agilent公司)。

試劑:5-氨基異酞酸、亞硫酰氯、芐基溴、80%的水合肼、2-吡啶甲醛、氨基葡萄糖、葡萄糖、碳酸鉀、冰醋酸、乙腈、甲醇、二氯甲烷、無(wú)水硫酸鎂。上述試劑均為分析純。

2.2 實(shí)驗(yàn)過(guò)程

2.2.1 配體LD的合成

配體LD的合成過(guò)程見圖1，具體實(shí)驗(yàn)步驟如下。

化合物L(fēng)-1的合成:向250 mL三頸燒瓶中加入5-氨基異酞酸(44.2 mmol，8 g)和 160 mL 甲醇，并用恒壓漏斗滴加過(guò)量的亞硫酰氯(SOCl2)，室溫反應(yīng)20 h，得到目標(biāo)產(chǎn)物L(fēng)-1(白色固體)。

化合物L(fēng)-2的合成:在乙腈溶液中，化合物L(fēng)-1(9.6 mmol，2 g)與芐基溴(24.1 mmol，4.1 g)在K2CO3(19.6 mmol，2.7 g)催化下反應(yīng) 6 h(反應(yīng)溫度為80℃)，冷卻后將乙腈除去后，用 H2O/CH2Cl2萃取，有機(jī)相用無(wú)水MgSO4干燥24 h，過(guò)濾、旋干，得到化合物L(fēng)-2(白色固體)。

化合物 L-3的合成:稱取化合物 L-2(5.1 mmol，2 g)放入燒瓶中，分別加入120 mL甲醇及過(guò)量的水合肼(80%)回流反應(yīng)24 h，得到目標(biāo)產(chǎn)物L(fēng)-3(白色固體)。

配體 LD的合成:稱取 2-吡啶甲醛(11.9 mmol，1.27 g)、化合物 L-3(5.1 mmol，2 g)放入燒瓶中，向其中加入甲醇溶劑，再加入幾滴冰醋酸回流反應(yīng)24 h，得到產(chǎn)物L(fēng)D(白色固體)。熔點(diǎn):189.1～190.9 ℃;元素分析(LD(C34H29O2N7)+CH3OH)計(jì)算值:C，70.10%;N，16.35%;H，5.55%;實(shí)驗(yàn)值:C，69.34%;N，16.48%;H，5.35%。電噴霧質(zhì)譜:m/z calcd 590.3歸屬于物種［LD+Na+］，m/z calcd 568.2歸屬于物種［LD+H+］。1H NMR(d6-DMSO):4.84(4H，s)，7.28(7H，m)，7.35(4H，d，J=7.2 Hz)，7.43(3H，t，J=15.6 Hz)，7.68(1H，s)，7.90(2H，t)，7.97(2H，d，J=7.6 Hz)，8.47(2H，s)，8.62(2H，d，J=8.4 Hz)，12.03(2H，s，HCONH)。IR(KBr 壓片):695(w)，742(w)，1 157(w)，1 246(w)，1 346(w)，1 494(m)，1 579(s)，1 468(m)，1 661(s)，1692(m)，2 833(w)，2 923(s)，3 434(m)cm－1。

圖1 配體LD的合成示意圖Fig.1 Synthetic route of ligand LD

2.2.2 金屬(鋅)-有機(jī)大環(huán)化合物L(fēng)D-Zn的合成

將配體 LD(0.30 mmol，170 mg) 溶解在10 mL乙腈/甲醇(2∶10，體積比)溶液中，再將Zn(NO3)2獉6H2O(0.30 mmol，89.2 mg) 溶解在2 mL甲醇中，二者混合后在室溫下攪拌30 min，再向其中加入六氟磷酸銨，得到淡黃色沉淀(LD-Zn)。元素分析(C102H87N21O6Zn3(PF6)4·3H2O·3CH3CN)計(jì)算值:C 48.84，H 3.87，N 12.66;實(shí)驗(yàn)值:C 48.51，H 3.68，N 12.62。IR(KBr 壓片):558(s)，845(s)，1 085(w)，1 156(m)，1 257(m)，1 294(m)，1 358(s)，1 384(s)，1 475(m)，1 535(m)，1 595(s)，1 631(m)，3 030(w)，3 434(m)cm－1。

2.3 LD-Zn對(duì)氨基葡萄糖的識(shí)別

2.3.1 配制溶液

將化合物L(fēng)D-Zn配制成1.0×10－3mol/L的DMF(N，N-二甲基甲酰胺)溶液，氨基葡萄糖和葡萄糖分別配制成1.0×10－2mol/L的水溶液，測(cè)試時(shí)用CH3CN/H2O(9∶1，體積比)的溶液稀釋到所需要的濃度。

2.3.2 紫外-可見光譜測(cè)試

向比色皿中加入2 mL化合物L(fēng)D-Zn溶液(1.0×10－5mol/L)，然后分別向其中加入客體分子(氨基葡萄糖或葡萄糖)，由低倍數(shù)到高倍數(shù)，直至平衡，測(cè)定LD-Zn對(duì)不同客體分子在260～600 nm之間的紫外-可見吸收光譜。

3 結(jié)果與討論

3.1 電噴霧質(zhì)譜測(cè)試

圖2是LD-Zn的電噴霧質(zhì)譜測(cè)試結(jié)果。從圖中可以觀察到6個(gè)峰，m/z calcd 632.350 1歸屬于物種［(LD-H+)3Zn3］3+，m/z calcd 680.691 1歸屬于物種［(LD-H+)3Zn3+PF6］3+，m/z calcd 947.534 1 歸屬于物種［(LD-2H+)3Zn3］2+，m/z calcd 978.526 1 歸屬于物種［(LD-2H+)3Zn3+NO3］2+，m/z calcd 1 021.027 2 歸屬于物種［(LDH+)3Zn3+PF6］2+，m/z calcd 1 093.033 9 歸屬于物種［(LD)3Zn3-5H++(PF6)2］2+，這些數(shù)據(jù)表明配體LD通過(guò)O、N、N雙三齒配位點(diǎn)與Zn2+(六配位)形成三元大環(huán)結(jié)構(gòu)，如圖3所示，該結(jié)構(gòu)在溶液中能夠穩(wěn)定存在。

圖2 金屬(鋅)-有機(jī)大環(huán)化合物L(fēng)D-Zn的ESI-MS譜圖Fig.2 ESI-MS of zinc-based macrocyclic compound LD-Zn

圖3 配體LD與Zn2+自組裝構(gòu)筑金屬(鋅)-有機(jī)大環(huán)化合物L(fēng)D-Zn(LD3Zn3)及包合氨基葡萄糖示意圖Fig.3 Formation schematic diagram of zinc-based macrocyclic compound LD-Zn for detection of glucosamine

向大環(huán)化合物L(fēng)D-Zn中加入氨基葡萄糖后，其電噴霧質(zhì)譜測(cè)試譜圖如圖4所示。圖中顯示了4 個(gè)正電荷峰，其中 m/z 632.350 1，947.534 1，1 021.027 2為大環(huán)化合物L(fēng)D-Zn的譜峰(見圖2)，m/z calcd 1 199.767 5二價(jià)正電荷峰歸屬為物種［(LD)3Zn3+PF6+Glu(氨基葡萄糖)+CH3OH+3CH3CN+H2O］2+，說(shuō)明大環(huán)化合物 LD-Zn以1∶1的比例包合了氨基葡萄糖分子。

圖4 向LD-Zn中加入氨基葡萄糖的ESI-MS譜圖Fig.4 ESI-MS spectra of LD-Zn in the presence of glucosamine

3.2 核磁光譜測(cè)試

大環(huán)化合物L(fēng)D-Zn對(duì)氨基葡萄糖識(shí)別的核磁光譜測(cè)試如圖5所示，其中(a)為大環(huán)LD-Zn的1H NMR核磁光譜，(b)為向大環(huán)LD-Zn中加入等摩爾氨基葡萄糖的1H NMR核磁光譜，(c)為氨基葡萄糖的1H NMR核磁光譜，從圖中可以看出氨基葡萄糖上的HC—H(—O—CH—OH)明顯向低場(chǎng)移動(dòng)，說(shuō)明氨基葡萄糖已經(jīng)進(jìn)入大環(huán)內(nèi)部［14］。

圖5 (a)LD-Zn的1H NMR譜;(b)向LD-Zn加入氨基葡萄糖后的1H NMR譜;(c)氨基葡萄糖的1H NMR譜，溶劑(d6-DMSO)。Fig.5 (a)1H NMR spectra of LD-Zn.(b)LD-Zn upon addition of glucosamine in a solution of d6-DMSO.(c)LD-Zn upon addition of glucosamine in a solution of d6-DMSO.

3.3 紫外光譜測(cè)試

圖6 (a)單純配體LD和金屬(鋅)-有機(jī)大環(huán)化合物L(fēng)D-Zn的紫外-可見吸收光譜圖;(b)在配體LD中加入氨基葡萄糖的紫外滴定光譜;(c)在LD-Zn(10#mol/L)中加入氨基葡萄糖的紫外滴定光譜;(d)在大環(huán)LD-Zn中加入葡萄糖的紫外滴定光譜;(e)在LD-Zn中加入三乙胺的紫外滴定光譜;(f)LD-Zn包合氨基葡萄糖的Benesi-Hildebrand擬合圖。Fig.6 (a)UV-Vis spectra of ligand LD and LD-Zn.(b)UV-Vis titration spectra of LD.(c)UV-Vis titration spectra of LD-Zn upon addition of glucosamine.(d)UV-Vis titration spectra of LD-Zn by adding glucose.(e)UV-Vis titration spectra of LD-Zn by adding triethylamine.(f)Benesi-Hildebrand fitting of UV-Vis titration upon addition of glucosamine into LD-Zn.

在 CH3CN/H2O(9∶1，體積比)溶液中，單純配體LD在303 nm處出現(xiàn)較強(qiáng)吸收峰，在373 nm處出現(xiàn)較弱吸收峰，當(dāng)與鋅離子配位后在269 nm處出現(xiàn)新的吸收峰，同時(shí)保留了303 nm和373 nm處的吸收峰，并且373 nm處吸收峰強(qiáng)度增強(qiáng)，如圖6(a)所示。圖6(b)是向配體LD中加入氨基葡萄糖的紫外-可見吸收光譜圖，從圖中可以看出LD對(duì)氨基葡萄糖沒有任何響應(yīng)。當(dāng)向大環(huán)化合物L(fēng)D-Zn中加入氨基葡萄后，373 nm處的吸收峰強(qiáng)度逐漸增加，269 nm和303 nm處的吸收峰強(qiáng)度逐漸降低，直至平衡，如圖6(c)所示，表明客體氨基葡萄糖進(jìn)入到大環(huán)LD-Zn內(nèi)部。在此基礎(chǔ)上，為了進(jìn)一步研究LD-Zn對(duì)氨基葡萄糖的響應(yīng)是否來(lái)源于糖環(huán)結(jié)構(gòu)或者氨基的堿性，分別對(duì)葡萄糖和三乙胺進(jìn)行了測(cè)試。圖6(d)和圖6(e)為分別向LD-Zn中加入葡萄糖和三乙胺后的紫外-可見光譜測(cè)試結(jié)果。從圖中可以看出LD-Zn對(duì)葡萄糖和三乙胺均沒有任何響應(yīng)，說(shuō)明相對(duì)葡萄糖而言，氨基葡萄糖的結(jié)構(gòu)與大環(huán)LD-Zn的空腔更匹配。這主要是由于LD-Zn對(duì)氨基葡萄糖的識(shí)別不是單純羥基(氫鍵)或者氨基(堿性)引起的，而是LD-Zn限域的空腔和與氨基的氫鍵等協(xié)同作用實(shí)現(xiàn)了對(duì)氨基葡萄糖的識(shí)別。這與He等［5］用富含酰胺氫鍵的八面體籠狀化合物識(shí)別氨基葡萄糖的機(jī)理相似，由于酰胺基團(tuán)與氨基葡萄糖之間形成氫鍵，導(dǎo)致大環(huán)LD-Zn骨架的電子變化，進(jìn)而紫外光譜有可視化的識(shí)別信號(hào)輸出。而且該研究利用更為簡(jiǎn)單的大環(huán)結(jié)構(gòu)實(shí)現(xiàn)了對(duì)氨基葡萄糖的識(shí)別，最低檢測(cè)限可達(dá)到5.0×10－6mol/L。以氨基葡萄糖加入量與373 nm處吸收峰強(qiáng)度的對(duì)應(yīng)關(guān)系，利用1∶1包合公式(1)進(jìn)行Benesi-Hildebrand擬合，如圖6(f)所示，得到LD-Zn包合氨基葡萄糖的平衡常數(shù) K=4.19 ×103mol－1·L。

其中，n為加入氨基葡萄糖的倍數(shù)，K為平衡常數(shù)，C0為L(zhǎng)D-Zn的濃度，A0為大環(huán)化合物L(fēng)D-Zn(濃度為C0)的吸光度值，A為在大環(huán)LD-Zn中加入一定量氨基葡萄糖后的吸光度值，Al為在大環(huán)LD-Zn中加入過(guò)量氨基葡萄糖的最大吸光度值。

4 結(jié) 論

通過(guò)雙三齒配體LD與鋅離子(Zn2+)自組裝構(gòu)筑了金屬(鋅)-有機(jī)大環(huán)化合物L(fēng)D-Zn，并研究其對(duì)氨基葡萄糖的識(shí)別作用。結(jié)果表明，大環(huán)LD-Zn能夠1∶1包合氨基葡萄糖分子，引起373 nm處的吸光度逐漸增強(qiáng)，269 nm和303 nm處的吸光度逐漸減弱，平衡常數(shù) K達(dá)到4.19×103mol－1·L，最低檢測(cè)限為 5.0 × 10－6mol/L，大環(huán)化合物L(fēng)D-Zn通過(guò)特定幾何性質(zhì)和尺寸的空腔和氫鍵的協(xié)同作用實(shí)現(xiàn)了對(duì)氨基葡萄糖的高靈敏度檢測(cè)。