HPLC-DAD法測(cè)定復(fù)合維生素B片中5種組分的含量

胡曉琴，韓 春

（長(zhǎng)治學(xué)院 化學(xué)系，山西 長(zhǎng)治 046011）

復(fù)合維生素B片（Vitamin B Compound Tablets）處方源于《衛(wèi)生部頒藥品標(biāo)準(zhǔn)》化學(xué)藥品及制劑第一冊(cè) WS1-73（B）-89[1]，由維生素 B1（Vitamin B1）、維生素 B2（Vitamin B2）、煙酰胺（Nicotinamide）、維生素 B6（Vitamin B6）和泛酸鈣（Calcium Pantothenate）等5種功效組分加工而成，臨床用于預(yù)防和治療B族維生素缺乏導(dǎo)致的營(yíng)養(yǎng)不良、口角炎、神經(jīng)系統(tǒng)等疾病[2]。現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)《衛(wèi)生部頒藥品標(biāo)準(zhǔn)》化學(xué)藥品及制劑第一冊(cè)WS1-73（B）-89分別使用重量法測(cè)定維生素B1、分光光度法測(cè)維生素B2、滴定法測(cè)煙酰胺[1]，方法操作繁瑣、誤差較大，并且未對(duì)維生素B6和泛酸鈣進(jìn)行評(píng)價(jià)。現(xiàn)有文獻(xiàn)中常用高效液相色譜法或超高效液相色譜法測(cè)定維生素B1、維生素B2、煙酰胺和維生素B6含量[3-12]；但未見同時(shí)測(cè)定復(fù)合維生素B片5種有效組分的報(bào)道，且對(duì)于該藥中泛酸鈣的含量測(cè)定報(bào)道甚少。本研究采用HPLC-DAD法，選擇以乙腈緩沖液（6 mmol/L己烷磺酸鈉，1 mmol/L庚烷磺酸鈉混合溶液，用冰醋酸調(diào)節(jié)pH值至4.5）（20:80）為流動(dòng)相，同時(shí)測(cè)定復(fù)合維生素B片5種有效組分，可為復(fù)合維生素B片質(zhì)量控制提供參考。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試藥

島津LC-20AT型高效液相色譜儀，配有SPD-M20A二極管陣列檢測(cè)器（DAD）和LabSolutions色譜工作站（日本島津公司）。維生素B1（批號(hào)：100390-201505，含量：100%，100 mg/支）、維生素B2（批號(hào)：100369-201504，含量：100%，100 mg/支）、煙酰胺（批號(hào)：100115-201604，含量：100%，100 mg/支）、維生素 B6（批號(hào)：100116-201404，含量：100%，100 mg/支）、泛酸鈣（批號(hào)：100370-201402，含量：100%，100 mg/支）均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院。復(fù)合維生素B片（山西 ****有限公司，批號(hào)：140602、140603、140604、140605、140606、140607、160102、160706）；甲醇、乙腈為色譜純，冰乙酸、無水乙醇為分析純，鹽酸為優(yōu)級(jí)純，水為超純水。

1.2 色譜條件

色譜柱：Shim-pack VP-ODS C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相：乙腈緩沖液（6 mmol/L 己烷磺酸鈉，1 mmol/L庚烷磺酸鈉混合溶液，用冰醋酸調(diào)節(jié) pH 值至 4.5）（20:80）；柱溫：30℃；流速：1 ml/min；進(jìn)樣量：10 μL；檢測(cè)波長(zhǎng)：265 nm（維生素B1、維生素B2和煙酰胺）和210 nm（維生素B6和泛酸鈣）。

1.3 溶液配制

對(duì)照品儲(chǔ)備液：分別精密稱取維生素B1對(duì)照品24.32 mg、維生素B2對(duì)照品12.53 mg、煙酰胺對(duì)照品80.46mg和泛酸鈣對(duì)照品10.25 mg，置10 ml量瓶中，加適量1%冰醋酸，振搖溶解后定容，作為對(duì)照品儲(chǔ)備液（1）；另精密稱取維生素B6對(duì)照品15.87 mg，置100 ml量瓶中，加適量1%冰醋酸，振搖溶解后定容，作為對(duì)照品儲(chǔ)備液（2），避光低溫保存。

對(duì)照品溶液：分別精密量取上述對(duì)照品儲(chǔ)備溶液（1）1.0 ml、對(duì)照品儲(chǔ)備溶液（2）2.0 ml，置 25 ml量瓶中，加1%冰醋酸溶液稀釋至刻度，搖勻，作為混合對(duì)照品溶液。

供試品溶液：取本品20片，精密稱定，研細(xì)，精密稱取適量（約相當(dāng)于3mg維生素B1），置50 ml量瓶中，加入1%冰醋酸 40 ml超聲（300 W，45 kHz）處理15 min，放冷，用1%冰醋酸定容，用微孔濾膜（0.45 μm）過濾，避光保存。

2 結(jié)果與分析

2.1 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

精密吸取“1.3”項(xiàng)下的混合對(duì)照品溶液和供試品溶液，按“1.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，記錄色譜圖（如圖1）。由圖1可知，供試品與對(duì)照品中維生素B1、維生素B2、煙酰胺、維生素B6和泛酸鈣色譜峰的保留時(shí)間相對(duì)應(yīng)。維生素B1、維生素B2、煙酰胺、維生素B6和泛酸鈣的保留時(shí)間分別為11.3 min、9.2 min、6.3 min、7.6 min 和 3.6 min。

圖1 供試品溶液和對(duì)照品溶液色譜圖

2.2 線性試驗(yàn)

分別精密吸取“1.3”項(xiàng)下對(duì)照品貯備液（1）0.05 ml、0.1 ml、0.2 ml、0.5 ml、1.0 ml分別置 5 ml量瓶中，依次加入“1.3”項(xiàng)下對(duì)照品貯備液（2）0.1 ml、0.2 ml、0.4 ml、1.0 ml、2.0 ml，加 1%冰醋酸定容，搖勻，得系列混合對(duì)照品溶液。按“1.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，以各組分的濃度x為橫坐標(biāo)，相應(yīng)峰面積y為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程及r，同時(shí)計(jì)算5種有效組分的檢測(cè)限和定量限，結(jié)果見表1。

表1 回歸方程、檢測(cè)限和定量限

2.3 精密度、穩(wěn)定性和重復(fù)性試驗(yàn)

精密吸取“1.3”項(xiàng)下的混合對(duì)照品溶液，按“1.2”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，計(jì)算得維生素B1、維生素B2、煙酰胺、維生素B6和泛酸鈣峰面積的RSD分別為0.56%、0.73%、0.48%、0.96%和0.87%，表明方法精密度良好。

精密吸取同一供試品溶液，分別于 0、2、4、8、10 h，按“1.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，測(cè)定峰面積，結(jié)果維生素B1、維生素B2、煙酰胺、維生素B6和泛酸鈣峰面積的RSD分別為0.74%、1.08%、0.95%、1.25%和0.96%，表明供試品溶液在10 h內(nèi)穩(wěn)定。

取同一批次復(fù)合維生素B片（批號(hào)：140605），按“1.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，共6份，分別進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果維生素B1、維生素B2、煙酰胺、維生素B6和泛酸鈣含量的RSD分別為0.57%、0.70%、0.82%、1.16%和0.61%，色譜峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD分別為1.08%、0.93%、0.96%、0.85%和0.47%，表明方法重復(fù)性良好。

2.4 加樣回收率試驗(yàn)

取已知各組分含量（維生素B1、維生素B2、煙酰胺、維生素B6和泛酸鈣含量分別為 3.11、1.54、10.17、0.21 和 1.04 mg/片，平均片重：0.0743 g）的復(fù)合維生素B片20片，研細(xì)，精密稱取0.07 g，共18份，分別置50 ml量瓶中，依次加入“1.3”項(xiàng)下對(duì)照品儲(chǔ)備液（1）、（2）0.6、1.2、2.0 ml各 6 份，按“1.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別進(jìn)樣分析，計(jì)算回收率。結(jié)果見表2，RSD<2.7%，加樣回收率均滿足要求。

表2 加樣回收率測(cè)定結(jié)果（%）

2.5 樣品含量的測(cè)定

按“1.3”項(xiàng)下方法制備8個(gè)批次樣品的供試品溶液，按“1.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，分別計(jì)算5種組分的含量，同時(shí)與《衛(wèi)生部頒藥品標(biāo)準(zhǔn)》化學(xué)藥品及制劑第一冊(cè)WS1-73(B)-89收載方法比較，檢測(cè)結(jié)果基本相符，相對(duì)偏差在1.0%范圍內(nèi)，說明該方法能夠滿足復(fù)合維生素B中有效組分含量測(cè)定的要求，結(jié)果見表3。

表3 含量測(cè)定結(jié)果（n=3）

3 討論

3.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

采用島津SPD-M20A二極管陣列檢測(cè)器（PDA），按本文色譜條件對(duì)混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行200～600 nm全波長(zhǎng)掃描，提取5種物質(zhì)的紫外吸收?qǐng)D譜?？芍S生素B1在248、254 nm處有較強(qiáng)的吸收峰；維生素B2在254、267、270 nm處有較強(qiáng)的吸收峰；煙酰胺在254 nm處有最大吸收峰，維生素B6在210、280 nm處有較強(qiáng)的吸收峰，泛酸鈣在210 nm處有最大吸收峰；為兼顧多種組分同時(shí)檢測(cè)，并綜合考慮靈敏度、分離度等因素，分別考察各波長(zhǎng)處的色譜圖，發(fā)現(xiàn)維生素B1、維生素B2和煙酰胺在265 nm處，維生素B6和泛酸鈣在210 nm峰形好，分離度滿足要求，各組分在相應(yīng)保留時(shí)間處有較強(qiáng)吸收，色譜圖見圖1。所以，本試驗(yàn)采用了不同波長(zhǎng)檢測(cè)，維生素B1、維生素B2和煙酰胺的檢測(cè)波長(zhǎng)為265 nm及維生素B6和泛酸鈣的檢測(cè)波長(zhǎng)為210 nm。

3.2 流動(dòng)相的選擇

試驗(yàn)過程中分別考察了乙腈水、甲醇水、甲醇1%冰醋酸及緩沖鹽、乙腈0.05 mol/L磷酸二氫鉀溶液、乙腈緩沖液（己烷磺酸鈉和庚烷磺酸鈉混合溶液）等流動(dòng)相體系，結(jié)果顯示，以乙腈緩沖液（己烷磺酸鈉和庚烷磺酸鈉混合溶液）為流動(dòng)相時(shí)的總體分離效果較好，但個(gè)別組分色譜分離度欠佳；在此基礎(chǔ)上調(diào)整了流動(dòng)相的比例、己烷磺酸鈉和庚烷磺酸鈉的濃度，以及緩沖液的pH值，最終選定以乙腈緩沖液（6 mmol/L己烷磺酸鈉，1 mmol/L庚烷磺酸鈉混合溶液，用冰醋酸調(diào)節(jié)pH值至4.5）（20:80）為流動(dòng)相，等度洗脫，各色譜峰的對(duì)稱性良好、分離度滿足要求。

3.3 提取溶劑的考察

根據(jù)5種組分的性質(zhì)，考慮到維生素B2、泛酸鈣在酸性強(qiáng)度大時(shí)不穩(wěn)定，而維生素B1酸度弱時(shí)提取不完全，對(duì)比了不同酸度的冰醋酸溶液對(duì)5種組分的提取效率，最終，選用1%冰醋酸溶液作為溶劑。