潞黨參根際一株產(chǎn)ACC脫氨酶細(xì)菌的鑒定及促生長特性

任嘉紅，常 欣，白變霞，豐 敏

（長治學(xué)院 生物科學(xué)與技術(shù)系，山西 長治 046011）

1 引言

黨參是一種性平味甘的重要中藥，是桔?？浦参稂h參（Codonopsis pilosula（Franch.）Nannf）的干燥根，其性味甘平、無毒，有補(bǔ)中益氣、生津止渴、活血化淤等功效[1]。黨參分布區(qū)域廣，產(chǎn)地多，質(zhì)量差異較大，山西潞黨參為道地藥材[2]。潞黨參主要產(chǎn)于現(xiàn)山西長治和晉城的平順、陵川、黎城、武鄉(xiāng)、長治等縣[3]。營養(yǎng)需求和施肥管理是黨參人工栽培的理論基礎(chǔ)，目前施肥是人工栽培用來提高黨參產(chǎn)量和品質(zhì)的主要措施[4-5]。目前，以微生物為基礎(chǔ)開發(fā)的各種微生物肥料已經(jīng)在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中得到廣泛應(yīng)用，該類肥料具有肥效高、本身無毒、不污染環(huán)境、成本低、節(jié)約能源等特點(diǎn)，是化學(xué)肥料的最有效替代品[6]。

乙烯是植物體內(nèi)的內(nèi)源激素，植物大部分時(shí)候只需要低水平度乙烯，大量乙烯的生成會(huì)阻礙植物生長[7]。ACC 脫氨酶（ACC deaminase，1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸脫氨酶）可以降解乙烯合成的直接前體ACC使乙烯水平降低，就有可能解除高濃度乙烯對(duì)植物生長的抑制，從而促進(jìn)植物的生長，有利于植物去抵抗逆境，ACC脫氨酶活性細(xì)菌可以分解植物根際產(chǎn)生的ACC[8，9]，該類菌不少菌株還具有一定的產(chǎn)生長素能力、解磷能力、產(chǎn)嗜鐵素能力，進(jìn)而促進(jìn)植物根的生長。近年來，ACC脫氨酶已成為國內(nèi)外的研究熱點(diǎn)之一，具有ACC脫氨酶活性的微生物作為植物根際促生菌（PGPR）的潛力菌株，諸多實(shí)驗(yàn)室開展了關(guān)于ACC脫氨酶活性細(xì)菌的篩選分離和ACC脫氨酶活性細(xì)菌功能作用等方面的研究。目前關(guān)于黨參根際產(chǎn)ACC脫氨酶菌株的研究未見報(bào)道。

本研究以前期從潞黨參根際土壤中分離出的一株具有ACC脫氨酶活性的菌株M01為研究對(duì)象，通過形態(tài)、生理生化、基于16S rDNA序列的系統(tǒng)發(fā)育分析等對(duì)該菌株進(jìn)行鑒定，以確定其分類地位，并對(duì)其產(chǎn)ACC脫氨酶能力進(jìn)行定性測(cè)定，同時(shí)還對(duì)該菌株解磷、產(chǎn)IAA、嗜鐵素能力等進(jìn)行測(cè)定。本研究為黨參專用生物肥料的開發(fā)提供了良好的潛力菌株。以期為黨參生物肥料開發(fā)提供優(yōu)良菌種，進(jìn)而為黨參的人工栽培及野生資源保護(hù)以及我國植物資源多樣性保護(hù)提供理論基礎(chǔ)和技術(shù)支持。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 材料

2.1.1 材料

菌株M01分離自山西省長治陵川潞黨參根際土壤中，該菌株目前保藏于本實(shí)驗(yàn)室。

2.1.2 培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基，牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，NB種子培養(yǎng)基，富集DF培養(yǎng)基，加富培養(yǎng)基ADF培養(yǎng)基[10]，鑒定培養(yǎng)基蒙金娜固體培養(yǎng)基、CAS培養(yǎng)基、MKB培養(yǎng)基[11]。

2.2 方法

2.2.1 菌株ACC脫氨酶活性測(cè)定方法

（1）將供試菌株接入50 mL LB液體培養(yǎng)基，28℃培養(yǎng)24 h進(jìn)行活化后，按1%接種量接種至50 mL LB液體培養(yǎng)基，28℃擴(kuò)大培養(yǎng)24 h，離心（9000 r/min，4℃）10 min收集菌體。用不加（NH4)2SO4的DF液體培養(yǎng)基離心洗滌菌體2次，重懸于25 mL ADF培養(yǎng)基中，28℃培養(yǎng)48 h，9000 r/min（4℃）離心10 min，收集菌體。用pH7.6的 Tris-Hcl緩沖液（0.1 mol/L）離心洗滌菌體2次。

（2）將菌體重懸于600 uL 0.1 mol/L Tris-Hcl緩沖液（pH=8.5）中，加入30 uL甲苯，迅速振蕩30 s，破碎細(xì)胞，即為粗酶液，取100uL粗酶液，4℃貯存，用于蛋白測(cè)定，其余粗酶液立即用于ACC脫氨酶活性測(cè)定。

（3）取200 uL粗酶液于1.5 mL離心管，加入20 uL 0.5 mol/L ACC混勻，置于30℃水浴15 min，隨即加入1 mL 0.56 mol/L Hcl終止反應(yīng)。并設(shè)2組平行對(duì)照，不加粗酶液和不加ACC。12000 r/min離心5 min，取上清。

（4）在10 mL管中，每1 mL上清液加800 uL 0.56 mol/L HCl和300 vuL 0.2%2，4-二硝基苯肼溶液（濃硫酸中溶解），30℃保溫30 min，加入2 mol/L NaOH混勻，540 nm測(cè)吸光值。

（5）繪制α-酮丁酸標(biāo)準(zhǔn)曲線，使用Bradford蛋白定量試劑盒定量測(cè)定蛋白質(zhì)，以牛血清蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)蛋白做標(biāo)準(zhǔn)曲線[12]。采用下列公式計(jì)算ACC脫氨酶比活力：

2.2.2 菌株鑒定

（1）形態(tài)和生理生化鑒定

將M01接種于牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基平板上，28℃培養(yǎng)24 h，觀察其菌落形態(tài)特征。并對(duì)該菌株分別進(jìn)行革蘭氏染色、芽孢染色及鞭毛染色。并參照《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)》（第9版）及《常見細(xì)菌鑒定手冊(cè)》開展M01菌株的生理生化鑒定[13～15]。

（2）16SrDNA序列的測(cè)定與系統(tǒng)發(fā)育分析

采用修改CTAB法提取M01菌株的基因組DNA。以基因組DNA為模板，用細(xì)菌的16S rDNA通用引物對(duì)細(xì)菌基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增[16]。引物分別為：PA（5-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3）和 PB（5-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3）；采用50uL體系進(jìn)行擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?4℃2 min,94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1.5 min，30個(gè)循環(huán)，72℃7min。2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)獲得目的條帶（1500bp左右），將該條帶切膠回收后與pMD19-T載體連接，轉(zhuǎn)入大腸桿菌JM109感受態(tài)細(xì)胞中，采用藍(lán)白斑篩選和菌落PCR檢測(cè)，挑選出陽性克隆斑后送至北京華大基因進(jìn)行測(cè)序，將得到的16S rDNA序列進(jìn)行BLAST，并用MEGA 5.0構(gòu)建該菌株系統(tǒng)發(fā)育樹。并將該序列提交至GenBank數(shù)據(jù)庫獲取基因登錄號(hào)。

2.2.3 M01菌株的促生潛力測(cè)定（1）溶磷能力的鑒定

將M01菌株點(diǎn)接種于蒙金娜固體培養(yǎng)基平板上，30℃培養(yǎng)7 d，觀察解磷圈，并統(tǒng)計(jì)解磷圈直徑（D）與菌落直徑（d）的比值，初步判定其解磷能力的大小。

將M01菌株活化后接種于NB種子培養(yǎng)基，30℃振蕩培養(yǎng)18～24 h制成種子液，取0.5 mL種子液接種于含50 mL蒙金娜液體培養(yǎng)基的100 mL三角瓶中，以接0.5 mL空白種子液的蒙金娜液體培養(yǎng)基為對(duì)照，每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)，30℃，180 r/m振蕩培養(yǎng) 4 d后，發(fā)酵液（4℃，12857×g）離心 10 min，采用鉬銻抗比色法測(cè)定上清液有效磷含量[17]，同時(shí)計(jì)算溶磷率[18]；

（2）產(chǎn)生長素測(cè)定

參照文獻(xiàn)[19]中的方法對(duì)M01菌株進(jìn)行分泌生長素（IAA）能力的定性定量鑒定。（3）產(chǎn)嗜鐵素測(cè)定

在CAS培養(yǎng)基上，對(duì)M01菌株進(jìn)行點(diǎn)接種，30℃培養(yǎng)72 h，如果菌株周邊有黃綠色暈圈產(chǎn)生，即表明該菌株具有產(chǎn)嗜鐵素的能力。并對(duì)M01菌株產(chǎn)嗜鐵素進(jìn)行定量測(cè)定，按1%的量接入到30 mL液體MKB培養(yǎng)基中，28℃、200 r/min培養(yǎng) 24 h后，離心（10,000 r/min，10℃）15 min取上清液，與等體積CAS藍(lán)色檢測(cè)液混勻。以不接菌的MKB培養(yǎng)液為對(duì)照。室溫下充分1h后，測(cè)定樣品（As）與對(duì)照（Ar）OD630的值，用如下公式計(jì)算鐵載體產(chǎn)量：

3 結(jié)果與分析

3.1 M01菌株產(chǎn)ACC酶菌株能力的測(cè)定

對(duì)M01菌株進(jìn)行產(chǎn)ACC酶活力測(cè)定，測(cè)定發(fā)現(xiàn)該菌株所產(chǎn)的ACC脫氨酶的活性為11.5 U/mg。這說明該菌株產(chǎn)ACC脫氨酶能力較強(qiáng)。

3.2 M01菌株的鑒定

菌株M01接種于牛肉膏蛋白胨平板上培養(yǎng)24h后，長出的菌落不透明，較小，污白色，有光澤，圓形，邊緣整齊。該菌株桿狀，革蘭氏陽性，好氧、具運(yùn)動(dòng)性，不產(chǎn)芽孢；生理生化特征分別是：KOH實(shí)驗(yàn)陰性、接觸酶陽性、氧化鎂陰性、卵磷脂酶陰性、油脂水解陰性、淀粉水解陰性、丙二酸鹽利用陽性、吲哚試驗(yàn)陰性、甲基紅陽性、V·P陰性、硝酸鹽還原陽性。

3.3 M01細(xì)菌的16S rDNA序列分析結(jié)果與系統(tǒng)發(fā)育分析

以M01菌株16S rDNA的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠（2%）電泳檢測(cè)，如圖1所示，在1500 bp附近有目的條帶。將該條帶進(jìn)行切膠回收后與T載體連接，轉(zhuǎn)入大腸桿菌JM109感受態(tài)細(xì)胞中，采用藍(lán)白斑篩選和菌落PCR檢測(cè)，挑選出陽性克隆斑，送交測(cè)序公司進(jìn)行測(cè)序。對(duì)M01菌株測(cè)序得到的16S rDNA序列進(jìn)行BLAST比對(duì)，能在數(shù)據(jù)庫中找到同源性非常高的相似菌株系列，與Pseudomonas brassicacearum（EU391388）菌株的同源性達(dá)到99%。構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，可見菌株M01與模式菌株 Pseudomonasbrassicacearum（EU391388)處于同一分支上。因此，結(jié)合M01菌株的形態(tài)特征和生理生化鑒定的結(jié)果，可將其鑒定為Pseudomonas brassicacearum。將M01菌株的16S rDNA序列提交至GenBank數(shù)據(jù)庫，獲取登錄號(hào)為MG687531。

圖1M01菌株16S rDNA PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果Fig.1 Result of 2%agarose gel electrophoresis of 16S rDNA PCR product of strain M01

圖2 菌株M01的16S rDNA全序列的系統(tǒng)發(fā)育樹形圖Fig.2 Phylogenetic tree of strain M01 based on its 16S rDNA sequences

3.4 M01菌株的促生長特性

3.4.1 M01菌株溶磷能力的鑒定

具有溶磷能力的菌株表現(xiàn)為在菌落周圍形成透明的溶磷圈。將M01菌株點(diǎn)接種于蒙金娜培養(yǎng)基檢測(cè)平板上，從圖3可以看出，平板上出現(xiàn)明顯的解磷透明圈。透明圈直徑（D）與菌落生長直徑（d）的比值表示解磷菌相對(duì)解磷能力的指標(biāo)，可初步測(cè)定菌株解有機(jī)磷的效果[20]。M01菌株的D/d比為1.5。對(duì)其解磷能力進(jìn)行定量測(cè)定，結(jié)果表明該菌株的對(duì)有機(jī)磷的解磷率可達(dá)到18.35%。這說明M01菌株是一株解有機(jī)磷能力強(qiáng)的產(chǎn)ACC脫氨酶菌株。

圖3.M01菌株產(chǎn)生的解磷圈Fig.3 The phosphate-dissolving zone of M01 strain

3.4.2 產(chǎn)生長素（IAA）能力

通過產(chǎn)IAA定性鑒定，由圖4可見，M01菌株具有一定的產(chǎn)生長素能力。對(duì)M01進(jìn)行產(chǎn)生長素（IAA）定量測(cè)定，該菌株的產(chǎn)生的IAA可以達(dá)到5.381μg/mL。

圖4 M01菌株的產(chǎn)IAA能力Fig.4.IAA producing effect of M01 strain

3.4.3 產(chǎn)嗜鐵素能力的鑒定

產(chǎn)生嗜鐵素的菌株表現(xiàn)為在CAS平板接種菌落周圍形成橘黃色暈圈。采用產(chǎn)嗜鐵素檢測(cè)CAS平板對(duì)對(duì)M01菌株進(jìn)行產(chǎn)嗜鐵素能力的定性測(cè)定，發(fā)現(xiàn)其具有非常明顯的產(chǎn)嗜鐵素能力，如圖5所示，M01菌株能在CAS平板形成橘黃色暈圈（嗜鐵圈），可合成嗜鐵素。對(duì)M01菌株在MKB液體培養(yǎng)基中的鐵載體產(chǎn)生能力進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果表明，該菌株在上清液中鐵載體含量為48.12%。

圖5 M01菌株的產(chǎn)嗜鐵素能力Fig.5.The production of siderophore by M01 strain

4 結(jié)論與討論

假單胞菌是報(bào)道的產(chǎn)ACC脫氨酶的常見屬[21-22]。國外學(xué)者已經(jīng)證實(shí)，以ACC為唯一碳源且可以產(chǎn)生ACC脫氨酶的假單胞菌都是植物根際促生菌[23]。本實(shí)驗(yàn)室前期從潞黨參根際分離篩選出一株具有ACC脫氨酶活性的細(xì)菌M01，經(jīng)形態(tài)特征、生理生化及16S rDNA序列的測(cè)定與系統(tǒng)發(fā)育分析將其鑒定為假單胞菌屬的Pseudomonas brassicacearum。通過測(cè)定M01菌株的其它促生機(jī)制后發(fā)現(xiàn)，該菌株除了具有溶有機(jī)磷能力，還具有明顯的產(chǎn)鐵載體和產(chǎn)IAA能力。總體而說，菌株M01除具有較強(qiáng)的ACC脫氨酶活性外，還具有其他的一些促生機(jī)制，這說明M01菌株是一株很有潛力的植物促生菌，同時(shí)表明該菌株可能通過幾種機(jī)制共同起作用來發(fā)揮其促生作用。而幾種機(jī)制共同作用對(duì)黨參的促生作用的效果有待后續(xù)的植物回接實(shí)驗(yàn)。另外，國內(nèi)外開展了不少關(guān)于植物內(nèi)生及根際產(chǎn)ACC脫氨酶細(xì)菌的研究，但是在該類菌的ACC脫氨酶作用機(jī)制、ACC脫氨酶活性影響因素等方面存在諸多欠缺，有待加強(qiáng)。

本研究首次開展了山西潞黨參根際具ACC脫氨酶活性菌株的相關(guān)研究。我們分離自潞黨參根際的M01菌株具有較好的ACC脫氨酶活性，這表明該菌株可利用乙烯的前體1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸（ACC）作為唯一氮源進(jìn)行生長，是典型的含ACC脫氨酶的根際促生菌。M01菌株在分類地位上隸屬于假單胞菌屬中的Pseudomonas brassicacearum。目前關(guān)于Pseudomonas brassicacearum大多是作為植物病害生防菌進(jìn)行報(bào)道[24-25]，我們的研究結(jié)果為其作為植物PGPR提供了更多證據(jù)。

通過對(duì)M01菌株其它促生機(jī)制的測(cè)定，發(fā)現(xiàn)該菌株具有較強(qiáng)的產(chǎn)嗜鐵素能力，這暗示該菌株一方面能通過分泌嗜鐵素，為植物生長提供鐵營養(yǎng)，植物達(dá)到更好生長的目的；另一方面產(chǎn)生的嗜鐵素結(jié)合鐵去競爭土壤中病原菌生存所需的鐵，從而抑制病原菌的生長。此外，M01產(chǎn)IAA能力和溶磷能力都很強(qiáng)，這暗示其可以在植物根際分泌較多的IAA和磷酸酯酶，促進(jìn)植物的生長和提供給植物更多可利用的磷。不少研究證明，IAA在促進(jìn)植物生長的同時(shí)還能提高植物的抗逆能力[26]。Bianco等發(fā)現(xiàn)接種高產(chǎn)IAA的苜蓿中華根瘤菌可以增強(qiáng)宿主的抗鹽性[27]。另外，關(guān)于M01菌株具體的定殖能力尚不確定，因而不能完全客觀的保證該菌株的實(shí)際利用和操作，只有通過開展進(jìn)一步的宿主植物定殖研究，才能更有效的去利用該菌株。