解毒化濁方誘導(dǎo)HER-2陽(yáng)性乳腺癌SK-BR-3細(xì)胞凋亡的研究

谷煥鵬 胡升芳

乳腺癌是高度異質(zhì)性的惡性腫瘤，HER-2陽(yáng)性乳腺癌，惡性程度高、生存率低、病情進(jìn)展迅速、易發(fā)生轉(zhuǎn)移、預(yù)后差[1]。HER-2陽(yáng)性乳腺癌西醫(yī)治療以單克隆抗體曲妥珠單抗為主，其顯著降低HER-2陽(yáng)性乳腺癌死亡率[2]，將疾病無(wú)進(jìn)展生存期延長(zhǎng)12.6周[3]，但25%患者出現(xiàn)心臟毒性[4]。“解毒化濁方”是本課題組總結(jié)多年臨床經(jīng)驗(yàn)方，用于治療HER-2陽(yáng)性乳腺癌，取得較好的療效，具備一定的理論和臨床療效基礎(chǔ)[5-6]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)“解毒化濁方”中藥干預(yù)乳腺癌細(xì)胞，探討中藥誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 動(dòng)物及細(xì)胞株 雌性Wistar大鼠，SPF級(jí),體質(zhì)量200±20g，購(gòu)自浙江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK（滬）2012-0002。人乳腺癌細(xì)胞株SK-BR-3細(xì)胞（中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞研究所編號(hào)TCHu225）。

1.2 藥物及試劑 “解毒化濁方”由蛇六谷、懷牛膝、半枝蓮各30g，黃芪15g，白術(shù) 9g，茯苓12g組成。以上中藥飲片均由浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院中藥房提供（批號(hào)151102），按傳統(tǒng)煎煮方法制成中藥水煎劑，濃縮為3.2g/mL（含生藥量）。HER-2抑制劑Mubritinib（TAK-165）（MCE 公司，批號(hào) 15426）；DMEM 培養(yǎng)基（美國(guó)Gibco公司，批號(hào)1801040206）；胎牛血清（美國(guó) Gibco 公司，批號(hào) 10099141）；Annexin V/PI（美國(guó)BD 公司，批號(hào) 6301518）。

1.3 儀 器 流式細(xì)胞儀（FC500），美國(guó)BECKMAN公司；CO2培養(yǎng)箱（3111），美國(guó) THERMO FISHER；熒光倒置顯微鏡（IX70-S8F），日本奧林帕斯公司，日本三洋電器有限公司；超凈工作臺(tái)（SW-CJ-1FD），蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 動(dòng)物分組及劑量設(shè)置 將8只雌性Wistar大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、中藥組（解毒化濁方組）、西藥組（HER-2抑制劑組）、聯(lián)合組（解毒化濁方+HER-2抑制劑組），每組2只。按“實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與人的體表面積比”中人鼠等效藥量換算方法計(jì)算給藥劑量，中藥給藥劑量18.8g/（kg·d）（均為生藥量）。中藥組大鼠給予解毒化濁方水煎劑灌胃，每天2次，每次3mL/只；對(duì)照組大鼠等量生理鹽水灌胃，每天2次，每次3mL/只；西藥組大鼠給予HER-2抑制劑Mubritinib（灌胃），每天2次，每次2mg/只；聯(lián)合組大鼠給予解毒化濁方水煎劑灌胃每次3mL/只，Mubritinib每次2mg/只，每天2次。

2.2 動(dòng)物采血及含藥血清制備 給藥連續(xù)3天后，當(dāng)夜禁食不禁水，第4天給藥1次，各給藥組在末次給藥后1h腹主動(dòng)脈采血，將血液注入無(wú)菌試管，加蓋。無(wú)菌分離血清，離心，3000r/min，5min。同組混合以消除個(gè)體差異，用0.22μm的濾膜過(guò)濾，56℃，30min水浴滅活，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 SK-BR-3細(xì)胞培養(yǎng)、細(xì)胞接種及給藥方法人乳腺癌細(xì)胞株SK-BR-3細(xì)胞用DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)，加入15%胎牛血清、1%青霉素與鏈霉素，37℃，5%CO2及飽和濕度培養(yǎng)。5d傳代1次，將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞以培養(yǎng)液調(diào)成1×105/mL，接種于6孔培養(yǎng)板上，200μL/孔，每組3孔，加入占培養(yǎng)基終濃度20%的含藥血清，按實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)分組為對(duì)照組、中藥組、西藥組、聯(lián)合組,分別加藥處理，在常規(guī)條件下培養(yǎng)，分別干預(yù)細(xì)胞24h和48h后流式儀檢測(cè)。

2.4 AnnexinV-FITC/PI法流式檢測(cè)細(xì)胞凋亡 將含藥血清作用SK-BR-3細(xì)胞后，用胰蛋白酶消化,并用磷酸鹽緩沖液洗滌,將待測(cè)細(xì)胞數(shù)調(diào)整為5×105/mL，離心15min，棄上清液，PBS洗滌，將細(xì)胞重懸于binding buffer 300μL，加入 Annexin V-FITC 10μL，輕輕搖勻，室溫反應(yīng)1h，加入PI 5μL，輕輕搖勻，室溫反應(yīng)放置15min，在流式細(xì)胞儀上進(jìn)行檢測(cè)，分析細(xì)胞凋亡率。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s） 表示，組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 解毒化濁方給藥血清作用24h對(duì)人乳腺癌細(xì)胞株SK-BR-3細(xì)胞凋亡的影響 中藥組與對(duì)照組比較早期、晚期凋亡率、總凋亡率增加，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；西藥組、聯(lián)合組與對(duì)照組比較早期凋亡率、總凋亡率明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；各組之間晚期凋亡率差異不明顯（P＞0.05）。見(jiàn)表 1、見(jiàn)圖 1（封四）。

3.2 解毒化濁方含藥血清作用48h對(duì)人乳腺癌細(xì)胞株SK-BR-3細(xì)胞凋亡的影響 與對(duì)照組比較，各用藥組早期凋亡率明顯增加（P＜0.05）；與對(duì)照組比較，西藥組、聯(lián)合組細(xì)胞凋亡率、總凋亡率明顯增加（P＜0.05）；中藥組與對(duì)照組比較晚期凋亡率、總凋亡率增加，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；西藥組與聯(lián)合組比較早、晚期凋亡率、總凋亡率變化不明顯，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。干預(yù)細(xì)胞48h與24h后比較，西藥組、聯(lián)合組較中藥組晚期細(xì)胞凋亡率明顯增加（P＜0.05）。見(jiàn)表 2、見(jiàn)圖 2（封四）。

表1 解毒化濁方含藥血清作用24h對(duì)人乳腺癌細(xì)胞SKBR-3細(xì)胞凋亡的影響（%，±s）

表1 解毒化濁方含藥血清作用24h對(duì)人乳腺癌細(xì)胞SKBR-3細(xì)胞凋亡的影響（%，±s）

注：與對(duì)照組比較，*P＜0.05

組別對(duì)照組中藥組西藥組聯(lián)合組孔數(shù)3333早期凋亡率1.03±0.23 2.43±0.33 4.76±0.63*6.93±0.76*晚期凋亡率1.50±0.34 2.33±1.09 2.23±1.13 2.23±1.13總凋亡率2.53±0.42 4.76±1.41 7.00±1.75*9.93±0.28*

表2 解毒化濁方含藥血清作用48h對(duì)人乳腺癌細(xì)胞SKBR-3細(xì)胞凋亡的影響（%，±s）

表2 解毒化濁方含藥血清作用48h對(duì)人乳腺癌細(xì)胞SKBR-3細(xì)胞凋亡的影響（%，±s）

注：與對(duì)照組比較，*P＜0.05

組別對(duì)照組中藥組西藥組聯(lián)合組孔數(shù)3333早期凋亡率1.60±0.10 4.76±0.23*8.56±0.64*6.80±0.10*晚期凋亡率1.93±0.20 4.40±0.32 32.90±2.00*22.86±9.74*總凋亡率3.53±0.13 9.16±0.21 41.46±1.93*34.83±6.51*

4 討論

元·朱丹溪《丹溪心法·赤白濁》認(rèn)為，“濁主濕熱、有痰、有虛”，故治濁當(dāng)補(bǔ)虛清化，方從法立，根據(jù)健脾除濕化濁法，結(jié)合臨床體質(zhì)調(diào)查和癥藥數(shù)據(jù)挖掘，從本課題組前期已完成乳腺癌術(shù)后診療規(guī)律研究挖掘數(shù)據(jù)，選出最能體現(xiàn)療效的用藥頻次最高的六味藥組成的聚類方“解毒化濁方”。方中出現(xiàn)頻次，懷牛膝（1116次）、蛇六谷（1073次）、半枝蓮（1041次），黃芪（1082次）、白術(shù)（1179次）、茯苓（1179次）。解毒化濁方中的六味藥從邪之初、已成、熱結(jié)等三個(gè)層面，通過(guò)表托、內(nèi)利兩條途徑化解濁毒[7]，解毒化濁方尤其適用HER-2陽(yáng)性乳腺癌術(shù)后的治療。

本課題組根據(jù)HER-2陽(yáng)性乳腺癌脾虛濁毒易生的病機(jī)特點(diǎn)，在觀察臨床乳腺癌高危人群血漿凋亡相關(guān)基因產(chǎn)物變化的基礎(chǔ)上[8]，進(jìn)一步開(kāi)展了中藥調(diào)控乳腺癌細(xì)胞HER-2過(guò)表達(dá)后對(duì)PI3K/Akt通路的影響，研究[9]結(jié)果發(fā)現(xiàn)，乳癌術(shù)后方血清干預(yù)人乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-453細(xì)胞，用藥各組p-Akt蛋白表達(dá)含量均較對(duì)照組明顯降低，表明用藥組能夠通過(guò)抑制Akt蛋白的磷酸化水平發(fā)揮抗乳腺癌的作用。藥物干預(yù)細(xì)胞后，可以通過(guò)調(diào)控HER-2受體家族及其下游信號(hào)PI3K/Akt轉(zhuǎn)導(dǎo)通路以及改變調(diào)亡相關(guān)蛋白。前期研究發(fā)現(xiàn)解毒化濁方具有抑瘤作用，其作用機(jī)制有待于進(jìn)一步探討。

細(xì)胞凋亡是程序性的細(xì)胞死亡，能否誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡成為當(dāng)今藥物治療腫瘤效果的判定標(biāo)準(zhǔn)之一[10]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，解毒化濁方中藥血清干預(yù)SK-BR-3細(xì)胞24h后，各用藥組與對(duì)照組比較早期細(xì)胞凋亡率、總凋亡率明顯增加，西藥組、聯(lián)合組尤其明顯（P＜0.05），表明中藥具有協(xié)同抑制劑增效的作用。干預(yù)SK-BR-3細(xì)胞48h后，各用藥組與對(duì)照組比較早期細(xì)胞凋亡率明顯增加，表明中藥具有促進(jìn)細(xì)胞凋亡作用。干預(yù)細(xì)胞48h與24h后比較，西藥組、聯(lián)合組較中藥組晚期細(xì)胞凋亡率明顯增加，聯(lián)合組較單純抑制劑組晚期細(xì)胞凋亡率有所減少，表明聯(lián)合組具有降低抑制劑的毒性同樣發(fā)揮誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用。

綜上所述，解毒化濁方可能有誘導(dǎo)乳腺癌SKBR-3細(xì)胞凋亡，協(xié)同抑制劑減毒增效的發(fā)揮抑瘤作用。