華宏軍 葉曉華 陳 媛 陳燕萍
胰腺癌被稱為“癌中之王”,是一種惡性程度很高而且在所有惡性腫瘤中預(yù)后最差的腫瘤。由于胰腺癌的早期確診率很低且腫瘤擴(kuò)散很快,因此胰腺癌的手術(shù)成功率很低,五年生存率不足1%[1]。對(duì)于胰腺癌患者而言,系統(tǒng)性化療是不可或缺的治療方案[2]。5-氟尿嘧啶是一種嘧啶類廣譜抗腫瘤藥物,能抑制腫瘤細(xì)胞中的胸腺嘧啶核苷酸合成酶,從而干擾DNA合成,誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡。臨床上用于消化道腫瘤、乳腺癌、卵巢癌等多種惡性腫瘤的治療[3-4]。然而5-氟尿嘧啶的長(zhǎng)期大劑量使用會(huì)造成患者較大的毒副反應(yīng)。本研究探討青蒿琥酯對(duì)5-氟尿嘧啶抗胰腺癌的協(xié)同作用及機(jī)制。
1.1 細(xì)胞培養(yǎng) 人胰腺癌細(xì)胞系Capan-2購(gòu)于美國(guó)模式培養(yǎng)物保存中心(ATCC),培養(yǎng)在含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中,在37°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)并通入5%CO2。細(xì)胞每2~3天傳代1次,傳代時(shí),用胰酶消化液使細(xì)胞進(jìn)入懸浮狀態(tài)并用DMEM培養(yǎng)基洗滌2次,將細(xì)胞懸液按1:3稀釋后傳代。
1.2 試 劑 5-氟尿嘧啶(批號(hào)559911)、青蒿琥酯(批號(hào) A3731)、噻唑藍(lán)(MTT)(批號(hào) M2128)和凋亡檢測(cè)試劑盒(批號(hào)APOAF)購(gòu)于德國(guó)Sigma-Aldrich。Survivin(批號(hào) 2808)、細(xì)胞色素 C(批號(hào) 4280)、凋亡誘導(dǎo)因子(批號(hào)5318)和GAPDH抗體(批號(hào)5174)購(gòu)于美國(guó)Cell Signaling。線粒體分離試劑盒(批號(hào)C3106)和JC-1(批號(hào)C2005)購(gòu)于碧云天生物科技有限公司。ECL顯色試劑盒(批號(hào)32106)購(gòu)于美國(guó)Pierce。Lipofectamine2000(批號(hào) 11668019)購(gòu)于美國(guó)Invitrogen。
1.3 Survivin基因強(qiáng)制過表達(dá)和轉(zhuǎn)染 將Survivin基因的開放閱讀框架序列經(jīng)PCR擴(kuò)增后以分子克隆的方法與pcDNA3.1連接后構(gòu)建成Survivin重組質(zhì)粒。Capan-2細(xì)胞接種在6孔板中孵育過夜使之貼壁。將Survivin重組質(zhì)粒(終濃度為 2μg/mL)用Lipofectamine2000進(jìn)行包裹后將其加入到無(wú)血清培養(yǎng)基進(jìn)行混合。將貼壁的Capan-2細(xì)胞置于該無(wú)血清培養(yǎng)基孵育6h,之后棄去無(wú)血清培養(yǎng)基加入新鮮的含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)24h。收集細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。對(duì)照細(xì)胞為L(zhǎng)ipofectamine2000(含空質(zhì)粒,終濃度為 2μg/mL)孵育 6h。
1.4 細(xì)胞活力抑制率檢測(cè) 將Capan-2細(xì)胞按5×103/孔接種在96孔板上孵育過夜,使之貼壁進(jìn)行分組實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組(空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞不加藥物培養(yǎng)48h)、青蒿琥酯組(空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞加入10μg/mL青蒿琥酯培養(yǎng)48h)、5-氟尿嘧啶組(空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞加入5μmol/L 5-氟尿嘧啶培養(yǎng)48h)、5-氟尿嘧啶+青蒿琥酯組(空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞加入5μmol/L 5-氟尿嘧啶和10μg/mL青蒿琥酯培養(yǎng)48h)和5-氟尿嘧啶+青蒿琥酯+Survivin質(zhì)粒組(Survivin質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞加入5μmol/L 5-氟尿嘧啶和10μg/mL青蒿琥酯培養(yǎng)48h)。分組培養(yǎng)完畢后在每個(gè)培養(yǎng)孔中加入0.1mg MTT并將細(xì)胞繼續(xù)置于37°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4h。小心吸走孔內(nèi)培養(yǎng)基,加入100μL二甲亞砜,充分震蕩混勻后在570nm波長(zhǎng)下測(cè)定OD值。細(xì)胞活力抑制率=(OD對(duì)照組-OD藥物處理組)/OD對(duì)照組×100%。
1.5 線粒體膜電位測(cè)定 按1.4所述進(jìn)行分組培養(yǎng)后收集細(xì)胞,用生理鹽水洗滌2次,加入終濃度為2μg/mL的JC-1染料孵育Capan-2細(xì)胞。20min后,再用生理鹽水將Capan-2細(xì)胞洗滌3次,之后采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)JC-1發(fā)出的紅色熒光,紅色熒光強(qiáng)度越強(qiáng),則表示線粒體膜電位越高[5]。
1.6 線粒體分離 按1.4所述進(jìn)行分組培養(yǎng)后收集細(xì)胞,用生理鹽水洗滌2次,再使用線粒體分離試劑盒按說明所示步驟分離移除Capan-2細(xì)胞中的線粒體,收集無(wú)線粒體的細(xì)胞質(zhì)用以檢測(cè)其中的細(xì)胞色素C和凋亡誘導(dǎo)因子。無(wú)線粒體的細(xì)胞質(zhì)中的細(xì)胞色素C和凋亡誘導(dǎo)因子蛋白水平越高,則說明線粒體的細(xì)胞色素C和凋亡誘導(dǎo)因子的釋放水平越高。
1.7 Western Blot試驗(yàn) 按1.4所述進(jìn)行分組培養(yǎng)后收集細(xì)胞,用生理鹽水洗滌2次,用蛋白提取液提取Capan-2細(xì)胞中的總蛋白質(zhì)。將等量的總蛋白質(zhì)或1.6所述所得樣品用10%SDS-PAGE進(jìn)行電泳分離。分離完畢后通過電轉(zhuǎn)方法將蛋白質(zhì)從分離膠上轉(zhuǎn)到PVDF膜上。用5%脫脂奶粉對(duì)PVDF進(jìn)行封閉孵育2h,之后再將PVDF膜用Survivin、細(xì)胞色素C、凋亡誘導(dǎo)因子和GAPDH抗體進(jìn)行孵育過夜。一抗孵育完畢后的PVDF膜再用帶辣根過氧化物酶的二抗孵育2h,蛋白條帶用ECL試劑盒顯色發(fā)光。
1.8 細(xì)胞凋亡試驗(yàn) 按1.4所述進(jìn)行分組培養(yǎng)后收集細(xì)胞,用生理鹽水洗滌2次,按照凋亡檢測(cè)試劑盒說明書步驟用Annexin-V和碘化丙啶(PI)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染色孵育20min。之后采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)Capan-2細(xì)胞的凋亡,凋亡率用Annexin-V陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)占總細(xì)胞數(shù)的百分比表示。
2.1 青蒿琥酯對(duì)5-氟尿嘧啶有協(xié)同抗胰腺癌活性MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,青蒿琥酯單獨(dú)處理僅能輕微抑制Capan-2細(xì)胞的細(xì)胞活力,然而將其與5-氟尿嘧啶進(jìn)行聯(lián)合處理可有效提高5-氟尿嘧啶對(duì)Capan-2細(xì)胞的殺傷活性(表1)。另外,流式細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,5-氟尿嘧啶+青蒿琥組Capan-2細(xì)胞的凋亡率顯著高于5-氟尿嘧啶組(表1)。結(jié)果表明青蒿琥酯對(duì)5-氟尿嘧啶有協(xié)同抗胰腺癌活性。
2.2 青蒿琥酯通過對(duì)Survivin表達(dá)的抑制發(fā)揮對(duì)5-氟尿嘧啶的協(xié)同作用 Western Blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,青蒿琥酯能明顯抑制Capan-2細(xì)胞中Survivin的表達(dá)水平(圖1),表明Survivin是青蒿琥酯的作用靶點(diǎn)。另外,轉(zhuǎn)染Survivin表達(dá)質(zhì)粒能使Capan-2細(xì)胞中的Survivin發(fā)生強(qiáng)制過表達(dá),廢除青蒿琥酯對(duì)Survivin的抑制(圖1)。MTT和流式細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染Survivin表達(dá)質(zhì)粒后,青蒿琥酯對(duì)5-氟尿嘧啶的協(xié)同作用受到明顯抑制,兩者聯(lián)合引起的細(xì)胞活力抑制和細(xì)胞凋亡明顯減弱(表1)。結(jié)果表明青蒿琥酯是通過抑制Capan-2細(xì)胞Survivin表達(dá)提高其對(duì)5-氟尿嘧啶的敏感性。
2.3 青蒿琥酯促進(jìn)5-氟尿嘧啶誘導(dǎo)的線粒體途徑凋亡 流式細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示青蒿琥酯能明顯促進(jìn)5-氟尿嘧啶誘導(dǎo)的Capan-2細(xì)胞線粒體的失能,明顯降低其線粒體膜電位(圖2)。Western Blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,青蒿琥酯能明顯促進(jìn)5-氟尿嘧啶誘導(dǎo)的Capan-2細(xì)胞的細(xì)胞色素C和凋亡誘導(dǎo)因子從線粒體中釋放到細(xì)胞質(zhì)中(圖1)。然而,當(dāng)在Capan-2細(xì)胞中轉(zhuǎn)染Survivin質(zhì)粒使其強(qiáng)制表達(dá)后,青蒿琥酯對(duì)5-氟尿嘧啶誘導(dǎo)的線粒體途徑凋亡的促進(jìn)作用明顯減弱(圖1~2)。結(jié)果表明在胰腺癌細(xì)胞中,青蒿琥酯輔助治療能通過抑制Survivin表達(dá)促進(jìn)5-氟尿嘧啶誘導(dǎo)的線粒體途徑凋亡。
圖1 青蒿琥酯、5-氟尿嘧啶和Survivin質(zhì)粒處理對(duì)Capan-2細(xì)胞Survivin表達(dá)水平及細(xì)胞色素C和凋亡誘導(dǎo)因子釋放水平的影響
圖2 青蒿琥酯、5-氟尿嘧啶和Survivin質(zhì)粒處理對(duì)Capan-2細(xì)胞線粒體膜電位的影響
5-氟尿嘧啶是臨床上治療胰腺癌的重要化療藥物,然而胰腺癌細(xì)胞對(duì)5-氟尿嘧啶的化療抵抗性是目前亟待解決的課題。研究[6-7]發(fā)現(xiàn),將化療藥物與一些天然藥物活性成分進(jìn)行聯(lián)合治療能降低腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的抵抗性,有效提高化療藥物的療效,因此本研究探討是否可能通過天然藥物聯(lián)合治療途徑提高5-氟尿嘧啶對(duì)胰腺癌細(xì)胞的殺傷活性。
表1 青蒿琥酯、5-氟尿嘧啶對(duì)Capan-2細(xì)胞活力抑制率和凋亡率的影響(%,±s)
表1 青蒿琥酯、5-氟尿嘧啶對(duì)Capan-2細(xì)胞活力抑制率和凋亡率的影響(%,±s)
注:與 5-氟尿嘧啶組比較,*P<0.05;與青蒿琥組比較,△P<0.05;與 5-氟尿嘧啶+青蒿琥組比較,▲P<0.05
孔數(shù) 細(xì)胞活力抑制率組別對(duì)照組青蒿琥組5-氟尿嘧啶組5-氟尿嘧啶+青蒿琥組5-氟尿嘧啶+青蒿琥+Survivin質(zhì)粒組33333 0 7.1±0.7 20.7±2.1 68.5±5.9*△26.8±2.5▲凋亡率1.8±0.2 5.4±0.6 11.3±1.5 37.9±3.2*△14.5±1.7▲
青蒿琥酯是提取自菊科植物黃花蒿葉的天然活性成分,臨床主要用于瘧疾的治療。然而近期的研究[8-9]發(fā)現(xiàn),青蒿琥酯除抗瘧作用外,還具有一定的抗腫瘤活性,青蒿琥酯是否對(duì)胰腺癌的5-氟尿嘧啶化療有輔助治療作用,至今仍不清楚。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),青蒿琥酯能明顯增強(qiáng)5-氟尿嘧啶對(duì)胰腺癌細(xì)胞的殺傷活性(P<0.05),表明青蒿琥酯可以作為輔助治療藥物降低胰腺癌對(duì)5-氟尿嘧啶的抵抗性,增強(qiáng)其療效。
Survivin是新發(fā)現(xiàn)的抗凋亡蛋白家族成員,在腫瘤細(xì)胞中對(duì)線粒體途徑凋亡起負(fù)向調(diào)節(jié)作用。研究[10-12]發(fā)現(xiàn)Survivin在多種腫瘤細(xì)胞中高表達(dá),并且Survivin表達(dá)水平越高,腫瘤患者的預(yù)后越差,病程進(jìn)展越快。此外,Survivin的過表達(dá)還會(huì)造成腫瘤的化療抵抗[13],因此Survivin可作為腫瘤治療的潛在靶點(diǎn)。本研究結(jié)果表明,青蒿琥酯能明顯抑制胰腺癌細(xì)胞中Survivin蛋白的表達(dá)水平,從而減弱了胰腺癌細(xì)胞對(duì)凋亡信號(hào)的抵抗性。在青蒿琥酯的協(xié)同作用下,胰腺癌細(xì)胞中抗凋亡蛋白Survivin表達(dá)減少,使5-氟尿嘧啶依賴的凋亡信號(hào)更易使胰腺癌細(xì)胞進(jìn)入線粒體途徑的凋亡,表現(xiàn)為腫瘤細(xì)胞線粒體膜電位的顯著下降,線粒體失能,從而使細(xì)胞色素C和凋亡誘導(dǎo)因子等凋亡活性分子[14-15]從線粒體中釋放到細(xì)胞質(zhì)中,誘導(dǎo)胰腺癌細(xì)胞發(fā)生凋亡性死亡。
綜上所述,本研究結(jié)果顯示青蒿琥酯能通過抑制Survivin的表達(dá)協(xié)同5-氟尿嘧啶殺傷胰腺癌細(xì)胞。