肺癌根治術(shù)中胸膜腔沖洗液腫瘤細(xì)胞檢查的研究進(jìn)展

陳東來 付冉冉 石平凡 覃塽 陳昶

隨著2017年1月第8版肺癌腫瘤-淋巴結(jié)-轉(zhuǎn)移（tumornode-metastasis,TNM）分期的實(shí)施，肺癌根治術(shù)前被發(fā)現(xiàn)存在惡性胸水的患者被列為M1a期，往往喪失了手術(shù)機(jī)會(huì)[1]。而長期以來，雖然有大量研究聚焦于肺癌根治術(shù)中胸膜腔沖洗液內(nèi)腫瘤細(xì)胞的檢測[2-6]，并已證實(shí)無論肺切除前或切除后的沖洗液中檢出腫瘤細(xì)胞均與預(yù)后有關(guān)[7,8]，但迄今胸膜腔沖洗液中腫瘤細(xì)胞的存在仍未被列為TNM分期的參考指標(biāo)，其預(yù)后意義也眾說紛紜。近年來，亦有學(xué)者開始關(guān)注胸膜腔沖洗液中腫瘤相關(guān)指標(biāo)與預(yù)后的關(guān)系[9,10]。此外，目前就使用何種液體進(jìn)行術(shù)中胸膜腔沖洗尚未達(dá)成專家共識，相關(guān)研究也鮮有報(bào)道。本文就近年來術(shù)中胸膜腔沖洗液腫瘤細(xì)胞檢查的研究進(jìn)展作一綜述。

1 胸膜腔沖洗液細(xì)胞學(xué)檢查

胸膜腔沖洗液細(xì)胞學(xué)檢查（pleural lavage cytology,PLC）是一種用于檢測腫瘤細(xì)胞亞臨床播散的技術(shù)，其結(jié)果不作為影響手術(shù)切除決策的依據(jù)[11,12]。目前，學(xué)界尚無明確標(biāo)準(zhǔn)將腫瘤細(xì)胞胸膜播散和PLC陽性結(jié)果進(jìn)行區(qū)分，但既往研究均指出PLC陽性與預(yù)后不良相關(guān)。

在當(dāng)前已發(fā)表的臨床研究中，研究者們對術(shù)中行PLC的時(shí)機(jī)進(jìn)行了分類，大致可分為：①進(jìn)胸后行肺切除前行PLC；②肺切除并行淋巴結(jié)清掃后立刻行PLC；③關(guān)胸前行PLC[8]三類。亦有研究者將其分為：①肺切除前行PLC；②肺切除后行PLC[7]或①進(jìn)胸后立刻行PLC；②關(guān)胸前行PLC[13]。在肺癌根治術(shù)中，進(jìn)胸后肺切除前的PLC檢測結(jié)果陽性往往提示腫瘤細(xì)胞的早期播散[6]，肺切除后關(guān)胸前的PLC檢測結(jié)果相比肺切除前行PLC不僅具有更大的預(yù)后價(jià)值[7,13,14]，而且可以作為指導(dǎo)術(shù)后輔助治療的參考[8,15]。盡管目前學(xué)界對PLC能否納入TNM分期尚存爭議[11]，然而其檢測結(jié)果對接受肺癌根治術(shù)患者的預(yù)后分層作用及治療指導(dǎo)意義已愈發(fā)受到臨床醫(yī)生的認(rèn)可與重視。

2010年國際PLC協(xié)作組對先前來自22個(gè)醫(yī)學(xué)中心發(fā)表的31篇臨床研究進(jìn)行了薈萃分析，結(jié)果提示PLC可被推薦為非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer,NSCLC）手術(shù)患者的常規(guī)檢查項(xiàng)目，其陽性結(jié)果為患者術(shù)后生存的獨(dú)立風(fēng)險(xiǎn)因素，且PLC陽性的I期-III期NSCLC患者T分期應(yīng)上升一個(gè)等級[16]。2014年又一項(xiàng)基于日本肺癌登記數(shù)據(jù)庫的研究[17]在納入4,171例患者進(jìn)行回顧性分析后，亦給出了相同的結(jié)論。遺憾地是，由于上述薈萃分析的文獻(xiàn)異質(zhì)性及研究的回顧性特質(zhì)，各研究團(tuán)隊(duì)納入的患者在術(shù)中行PLC的時(shí)機(jī)可能存在差異，因此與術(shù)后病理分期升級關(guān)系最密切的PLC結(jié)果不得而知。

2 PLC陽性結(jié)果的影響因素

在不同研究及同一研究的不同患者群組中，PLC的陽性檢出率差異極大，大致在3.7%-38.6%之間[11]，但上述相去甚遠(yuǎn)的陽性檢出率既可歸因于腫瘤自身屬性如大小、病理類型、侵襲性等；亦與行PLC的時(shí)機(jī)及獲取樣本的方法有關(guān)[11]。在肺切除前PLC陽性檢出率差異可達(dá)2.7%-22.6%，切除后亦可達(dá)3.7%-13.5%；而沖洗時(shí)使用的生理鹽水量在不同研究中差異可達(dá)20 mL-2,000 mL不等[7,8,12,18]，在沖洗液標(biāo)本的具體檢測方法和陽性判斷標(biāo)準(zhǔn)上也可存在差異。近十年來多數(shù)研究[8,12-15,19-21]均采取Papanicolaou方法進(jìn)行PLC的判定，根據(jù)Papanicolaou的結(jié)果可將沖洗液標(biāo)本分為5個(gè)等級：I-III為陰性，IV-V為陽性。

2.1 肺切除前PLC陽性 表1總結(jié)了近十年來文獻(xiàn)中分析得出的與肺切除前PLC陽性相關(guān)的因素。從中我們不難看出肺切除前PLC陽性率與腫瘤的病理直徑（T分期）、胸膜浸潤情況、淋巴結(jié)累及情況（N分期）和病理分期（P分期）高度相關(guān)，且可能與病理類型、脈管侵犯情況相關(guān)，甚至可能與患者年齡相關(guān)。同時(shí)亦有文獻(xiàn)報(bào)道肺切除前PLC陽性率或與性別、術(shù)前CEA水平相關(guān)[22]。此外，連同表1內(nèi)所列的多項(xiàng)研究[8,13,19,20,22,23]均一致指出術(shù)前PLC可作為NSCLC手術(shù)患者的獨(dú)立預(yù)后因素。

關(guān)于肺切除前PLC陽性檢出率與NSCLC病理亞型的相關(guān)性，目前有兩種不同論調(diào)：一種觀點(diǎn)認(rèn)為肺切除前PLC陽性更多見于腺癌這一病理類型[6,22,24]，并歸因于腫瘤本身的高侵襲性；另一種觀點(diǎn)則認(rèn)為鱗癌更易出現(xiàn)肺切除前PLC陽性[25,26]，但亦有人指出鱗癌患者的陽性結(jié)果或由沖洗液中呈團(tuán)簇狀的間皮細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞混淆而引起[27]，即存在假陽性。Li等[28]的薈萃分析則指出病理類型與肺切除前PLC陽性結(jié)果之間無明確相關(guān)性。

肺切除前PLC陽性與胸膜浸潤的相關(guān)性已見諸表1中多篇文獻(xiàn)。肺切除前PLC常見于胸膜浸潤分級為p2的患者中（腫瘤細(xì)胞侵犯至臟層胸膜表面）[29,30]，這或與沖洗過程中液體的機(jī)械力將腫瘤細(xì)胞從臟層胸膜剝離有關(guān)，且可能造成人為的腫瘤細(xì)胞胸膜腔播散；而在p0（腫瘤細(xì)胞未侵及臟層胸膜彈力纖維層）和p1（腫瘤細(xì)胞突破臟層胸膜彈力纖維層）患者中亦有肺切除前PLC陽性報(bào)道[4,6,27]；但p3患者（腫瘤細(xì)胞侵犯至壁層胸膜）中此類報(bào)道則并不常見。亦有研究[25]認(rèn)為肺切除前PLC陽性與臟層胸膜浸潤并無明確相關(guān)性，而與腫瘤累及胸壁密切相關(guān)（T3分期腫瘤）。

2.2 肺切除后PLC陽性 表2總結(jié)了近十年來文獻(xiàn)中所列的與肺切除后PLC陽性相關(guān)的因素，如表2所示，肺切除后沖洗液用量顯著高于切除前，而500 mL以上的用量可造成結(jié)果假陰性[18]。迄今為止，多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)肺切除后PLC陽性與N分期、胸膜浸潤情況、淋巴管及微血管侵犯以及病理分期有關(guān)[7,8,13,31]，但亦有不同觀點(diǎn)認(rèn)為肺切除后PLC陽性與TNM分期、胸膜浸潤和淋巴管侵犯無關(guān)[24,32]。此外，Dresler等提出肺切除后PLC陽性可能與腫瘤分化程度相關(guān)，而Enatsu等[7]的一項(xiàng)大規(guī)模前瞻性研究發(fā)現(xiàn)肺切除后PLC陽性與手術(shù)切除徹底性（無切緣陽性、進(jìn)行系統(tǒng)性淋巴結(jié)清掃為徹底切除）成負(fù)相關(guān)。另一不容忽視的影響因素是手術(shù)操作本身亦可引起肺切除后PLC陽性，且術(shù)前經(jīng)胸壁穿刺活檢[11]或行結(jié)節(jié)穿刺定位亦為造成腫瘤細(xì)胞脫落至胸膜腔內(nèi)的危險(xiǎn)因素。若研究者同時(shí)納入肺切除前后PLC結(jié)果[7,13]，則研究流程本身就使肺切除后的PLC結(jié)果不可避免地受切除前沖洗的影響。

表1 肺切除前胸腔沖洗液細(xì)胞學(xué)檢查陽性結(jié)果的相關(guān)因素Tab 1 Factors associated with positive pre-resectional PLC

3 PLC陽性的可能機(jī)制

目前惡性胸水形成的病理生理機(jī)制被總結(jié)為肺內(nèi)淋巴管的損傷及阻塞導(dǎo)致體液引流不暢形成的漏出液積聚，而PLC陽性不伴有惡性胸水的相關(guān)機(jī)制則尚待進(jìn)一步闡明。目前主流觀點(diǎn)認(rèn)為PLC陽性是由部分侵襲性高的腫瘤細(xì)胞經(jīng)胸膜下淋巴管或受累縱隔淋巴結(jié)穿透至胸膜腔內(nèi)引起的，或先到達(dá)胸膜表面再被人為操作剝落至沖洗液中[4,6,11,27,32]。這種解釋符合上述PLC陽性與脈管侵犯相關(guān)的病理發(fā)現(xiàn)，PLC陽性因此也被視為隱匿性的胸膜播散[11]。亦有觀點(diǎn)認(rèn)為腫瘤細(xì)胞可與被吸入的細(xì)顆粒物一樣經(jīng)外周肺實(shí)質(zhì)進(jìn)入胸膜腔[33]。而上文提到的p3患者中PLC陽性與壁層胸膜累及相關(guān)性的機(jī)制當(dāng)下仍存在爭議，有觀點(diǎn)認(rèn)為腫瘤細(xì)胞與壁層胸膜及胸壁之間可形成纖維粘附[27]，阻止腫瘤細(xì)胞在胸膜腔內(nèi)播散因而不易出現(xiàn)PLC陽性結(jié)果。此外，由穿刺針道引起的胸膜腔內(nèi)人為播散亦被視為引起PLC陽性的可能機(jī)制[34]，但亦有研究提出二者之間無明確相關(guān)性[5,24,35]。

表2 肺切除后胸腔沖洗液細(xì)胞學(xué)檢查陽性結(jié)果的相關(guān)因素Tab 2 Factors associated with positive post-resectional PLC

肺切除前PLC陽性往往與腫瘤的自然史相關(guān)，是腫瘤侵襲力增強(qiáng)、疾病進(jìn)展的體現(xiàn)；而肺切除后PLC陽性則被認(rèn)為與手術(shù)操作及沖洗液的機(jī)械性作用相關(guān)性更大[11]，且手術(shù)本身在清掃縱隔淋巴結(jié)的同時(shí)可能破壞被腫瘤細(xì)胞侵犯的淋巴管及小血管，造成脈管中腫瘤細(xì)胞被人為釋放到?jīng)_洗液中[34,36]。盡管這種人為造成腫瘤胸膜腔或胸壁播散的風(fēng)險(xiǎn)可被多次大量沖洗降至最低，但極易引起切除后PLC的陽性發(fā)現(xiàn)?？傊?，當(dāng)前關(guān)于PLC陽性的病理生理機(jī)制尚缺乏統(tǒng)一的認(rèn)識。

4 PLC陽性的臨床意義

表3匯總了近十年來探究肺切除前PLC與預(yù)后關(guān)系的研究及其結(jié)論。由表3可見肺切除前PLC陽性患者術(shù)后生存狀況顯著差于陰性患者，但其是否可作為獨(dú)立預(yù)后因素尚存爭議。一些研究還發(fā)現(xiàn)肺切除前PLC陽性對預(yù)后的不利影響在早期肺癌患者中更為顯著，而在晚期患者中則并不明顯，這或與晚期患者本身預(yù)后極差有關(guān)[24,29]。具體表現(xiàn)為其對I期和II期肺癌患者術(shù)后生存期的預(yù)測價(jià)值[4,22,24,26]，且已有日本的多中心大規(guī)?；仡櫺匝芯孔鳛橹魏万?yàn)證[37]，該項(xiàng)研究亦提出肺切除前的PLC陽性結(jié)果僅對I期和II期患者預(yù)后產(chǎn)生不利影響，而對IIIa期患者預(yù)后影響甚微。因此當(dāng)前多數(shù)學(xué)者傾向于將肺切除前PLC陽性的T分期升級到T3[18,20]或T4[14,16,17]，以示與惡性胸水形成的IV期（M1a）患者的預(yù)后進(jìn)行區(qū)分。同樣，在I期和II期肺癌患者中，肺切除前PLC陽性者較陰性者更易出現(xiàn)局部和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[22,35]；而這種區(qū)分度在IIIa期和IIIb期患者中亦明顯縮小[11]。此外，肺切除前PLC陽性的早期肺癌患者術(shù)后更易出現(xiàn)以癌性胸膜炎為形式的疾病復(fù)發(fā)[24,37]，這也部分解釋了某些早期患者在接受根治性切除后短時(shí)間內(nèi)出現(xiàn)局部復(fù)發(fā)的現(xiàn)象。Ichinose等[38]的一項(xiàng)前瞻性研究則提出，針對肺切除前PLC陽性患者使用低滲性鉑類沖洗液相比常規(guī)的生理鹽水沖洗，可顯著降低患者術(shù)后癌性胸膜炎的發(fā)生率，但因入組過慢致該研究提前終止，最終僅納入49例，存在樣本量過小且未體現(xiàn)術(shù)后生存優(yōu)勢的問題。此外，Ogawa等[15]于2015年發(fā)表的一項(xiàng)回顧性研究表明，對包括病理I期在內(nèi)的術(shù)中PLC陽性患者，手術(shù)聯(lián)合術(shù)后輔助化療相比單純手術(shù)可顯著改善患者術(shù)后的無復(fù)發(fā)生存期，而在該項(xiàng)研究中，行PLC的時(shí)機(jī)為進(jìn)胸后立即送檢，因此該項(xiàng)研究有著明顯時(shí)機(jī)局限性，證據(jù)等級亦尚顯不足。

如表4所示，肺切除后PLC陽性不僅是患者術(shù)后生存的不利因素，而且已有多項(xiàng)研究經(jīng)多因素分析提出其相比切除前PLC陽性具有更大的預(yù)后價(jià)值[7,14,34]。甚至有研究提出肺切除后PLC陽性可成為等價(jià)于惡性胸腔積液的獨(dú)立預(yù)后因素[14,32]。同時(shí)肺切除后PLC陽性與術(shù)后局部復(fù)發(fā)及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的相關(guān)性也更顯著，但不可否認(rèn)的是胸腔內(nèi)局部復(fù)發(fā)亦可能由關(guān)胸前沖洗殘留的腫瘤細(xì)胞所致，至于其導(dǎo)致遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的具體機(jī)制則不得而知?？傮w而言，近年來關(guān)于切除前PLC陽性預(yù)后意義的研究數(shù)量遠(yuǎn)多于切除后PLC陽性，這或與學(xué)界已逐步達(dá)成對肺切除后PLC陽性的一致看法有關(guān)，即承認(rèn)肺切除后PLC陽性是預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。

表3 探究開胸后肺切除前行胸腔沖洗液細(xì)胞學(xué)檢查預(yù)后意義的相關(guān)研究Tab 3 Studies demonstrating the prognostic significance of pleural lavage cytology immediately after thoracotomy and before lung resection

表4 探究肺切除后行胸腔沖洗液細(xì)胞學(xué)檢查預(yù)后意義的相關(guān)研究Tab 4 Studies demonstrating the prognostic significance of pleural lavage cytology after lung resection

5 PLC與其他腫瘤相關(guān)指標(biāo)

近年來，學(xué)者們在關(guān)注術(shù)中沖洗液內(nèi)的腫瘤細(xì)胞之外，也逐步開始探索PLC陽性與沖洗液中其他指標(biāo)的關(guān)系。Inoue等[10]指出，EGFR外顯子21 L858R存在突變的患者相比沒有EGFR突變的患者更容易出現(xiàn)肺切除前PLC陽性結(jié)果。這或?qū)Σ糠諩GFR突變的肺癌患者預(yù)后評估及后續(xù)治療指導(dǎo)起到啟示作用。Tsutani等[9]發(fā)現(xiàn)術(shù)中沖洗液CEA水平與腫瘤大小、胸膜浸潤及血清CEA水平相關(guān)，而與肺切除前PLC無關(guān)，但沖洗液中CEA相比血清CEA具有更顯著的預(yù)后意義。目前術(shù)中沖洗液內(nèi)腫瘤相關(guān)指標(biāo)與PLC的關(guān)系及其預(yù)后價(jià)值尚有待深入研究。

6 總結(jié)與展望

盡管不同醫(yī)學(xué)中心的研究之間存在明顯異質(zhì)性，且結(jié)果不盡相同，甚至存在矛盾，但迄今諸多大規(guī)模前瞻性和回顧性臨床研究已證實(shí)了PLC陽性結(jié)果的預(yù)后意義。但肺切除前后PLC陽性結(jié)果能否成為納入T分期的指標(biāo)尚有待學(xué)界進(jìn)一步驗(yàn)證。正如上文所提，對早期肺癌患者而言，PLC陽性結(jié)果預(yù)后價(jià)值更大，且與術(shù)后癌性胸膜炎、遠(yuǎn)期復(fù)發(fā)密切相關(guān)，而使用何種液體進(jìn)行胸腔沖洗尚無定論。目前在多數(shù)醫(yī)學(xué)中心仍使用生理鹽水或蒸餾水進(jìn)行沖洗，而本文所納入的文獻(xiàn)中幾乎都使用生理鹽水行PLC檢測。但沖洗液的用量、液體類別、沖洗時(shí)機(jī)等可影響研究結(jié)果的變量都有待規(guī)范。隨著近年來早期肺癌的高發(fā)，在高通量的外科中心比較不同沖洗液的使用對PLC陽性患者術(shù)后結(jié)局的影響可對早期患者的治療效果起到積極意義。

在肺癌根治術(shù)中，外科操作不可避免地會(huì)造成胸膜破損或淋巴結(jié)破碎，這亦可能造成切除術(shù)后PLC陽性結(jié)果，甚至造成人為的胸膜腔內(nèi)腫瘤細(xì)胞殘留而導(dǎo)致術(shù)后復(fù)發(fā)。面對該類情況，目前尚無規(guī)范干預(yù)措施的共識達(dá)成，而常規(guī)使用的大量蒸餾水沖洗是否能有效降低切除術(shù)后PLC陽性率，以及該種干預(yù)能否使患者獲得生存獲益尚有待多中心前瞻性研究驗(yàn)證。

此外，大量分子生物學(xué)研究已證實(shí)腫瘤細(xì)胞KRAS突變[39]、腫瘤分泌的炎癥因子[40]及腫瘤募集的肥大細(xì)胞對惡性胸水形成起到促進(jìn)作用，相關(guān)轉(zhuǎn)化研究及預(yù)后靶標(biāo)在PLC陽性患者中則尚未見報(bào)道。因此在胸腔沖洗液中尋找更多與預(yù)后密切相關(guān)的分子靶標(biāo)，或可使肺癌術(shù)后患者在TNM分期及PLC結(jié)果外獲得更準(zhǔn)確的預(yù)后。