野生金銀花高效組培繁殖技術(shù)再生研究*

高慶茂,董春燕

(1.萊蕪職業(yè)技術(shù)學(xué)院,山東 萊蕪271100;2.青州市亞泰農(nóng)業(yè)有限公司,山東 青州262501)

金銀花 (Lonicera japonica Thunb.)又名過(guò)冬藤、金花和銀華等,是忍冬科 (Caprifoliaceae)常綠多年生藤本植物,野生種分布較為廣泛,常見(jiàn)生于林中、山坡灌叢和道路兩邊[1]。金銀花是重要的傳統(tǒng)中藥材,其藤、莖、葉、花蕾均可入藥,具有清熱解毒、抑菌消炎、止血、抗老化等功效,藥用價(jià)值較高[2]。同時(shí),金銀花的花清香怡人,既可用作園林綠化又可作盆景,是一種珍貴的觀賞植物[3]。傳統(tǒng)的金銀花繁殖方式主要有壓條、扦插、分株、嫁接和種子繁殖等,不僅育苗周期長(zhǎng)、繁殖率低、易感病菌[4],還易使金銀花生長(zhǎng)不良,藥用有效成分積累減少,造成產(chǎn)品品質(zhì)的下降。加之,野生金銀花繁殖速度慢,而從野外大量取材又易對(duì)生物資源及生態(tài)環(huán)境造成破壞,因此不易大量獲得栽培種苗。組培快繁不僅能夠保持親本的優(yōu)良性狀,還具有較高的繁殖系數(shù),并能夠排除外界環(huán)境的干擾進(jìn)行周年生產(chǎn)。當(dāng)前,國(guó)內(nèi)外雖有金銀花組織培養(yǎng)方面的研究報(bào)道,如山東平邑縣的紅河金銀花和沂蒙山區(qū)特有的鳳爪金銀花其地域性較強(qiáng),品種上也存在差異[5-6]。另外,前人關(guān)于金銀花組培的研究,在外植體選材上多以莖尖、葉片、芽進(jìn)行組織培養(yǎng),而本試驗(yàn)選取的是植株莖段作外植體,這與前人在取材上存在不同。同時(shí),本試驗(yàn)外植體選取的是當(dāng)年生枝條,有研究報(bào)道選擇2年生枝條做供試材料,在選材上雖然均是植株枝條,但是生長(zhǎng)年齡存在不同。在滅菌消毒、不定芽誘導(dǎo)、繼代增殖和生根誘導(dǎo)等方面所采用的方法與前人亦存在不同,其目的是探索新的組培快繁途徑,為金銀花的快速繁育提供新技術(shù)?？傊?本試驗(yàn)通過(guò)組織培養(yǎng)的方式研究不同激素組合及濃度配比對(duì)野生金銀花莖段滅菌消毒、不定芽誘導(dǎo)、繼代增殖和生根誘導(dǎo)的影響,以期在保持親本特性的基礎(chǔ)上提高繁殖速度和繁殖系數(shù),實(shí)現(xiàn)金銀花工廠化育苗,促進(jìn)金銀花產(chǎn)業(yè)的快速發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料取自連云港師范高等專科學(xué)校試驗(yàn)基地,試驗(yàn)以野生金銀花當(dāng)年生莖段為外植體。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 樣品預(yù)處理

2017年4月10日上午,在大田取金銀花當(dāng)年生健壯幼嫩枝條,剪去葉片,浸泡于含少量洗衣粉的溶液中10min,流水下沖洗20min,用無(wú)菌濾紙吸干表面水分,剪成1.5-2.0cm長(zhǎng)的帶對(duì)生腋芽的幼嫩莖段備用。

1.2.2 外植體滅菌消毒方法試驗(yàn)

試驗(yàn)設(shè)置6個(gè)處理,每處理10瓶,每瓶接種5個(gè)外植體,每處理重復(fù)3次,接種完成后統(tǒng)一放置在人工智能氣候箱中進(jìn)行培養(yǎng)。14d后查看并記錄污染數(shù)、死亡數(shù)和無(wú)菌苗數(shù)。

接種所用培養(yǎng)基為:MS+6-BA 0.4mg/L+NAA 1.6mg/L+2,4-D 0.2mg/L,pH5.8-6.0。75%堿化乙醇配制方法為:100份體積分?jǐn)?shù)75%的乙醇+1份質(zhì)量分?jǐn)?shù)40%的NaOH溶液。

1.2.3 不定芽誘導(dǎo)試驗(yàn)

試驗(yàn)設(shè)置9個(gè)處理,每處理10瓶,每瓶接種5個(gè)外植體莖段,每處理重復(fù)3次,接種完成后統(tǒng)一放置在人工智能氣候箱中進(jìn)行培養(yǎng)。接種所用培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基,pH5.8-6.0。15d后查看并記錄出芽外植體數(shù)。

1.2.4 增殖培養(yǎng)試驗(yàn)

將長(zhǎng)勢(shì)基本一致的不定芽從基部切下,接種于添加不同激素和濃度組合的MS培養(yǎng)基上進(jìn)行繼代增殖培養(yǎng),試驗(yàn)設(shè)置6個(gè)6-BA、NAA組合,每處理接種30瓶,每瓶接種3個(gè)芽,10瓶為1個(gè)重復(fù),每處理3次重復(fù),接種完成后統(tǒng)一放置在人工智能氣候箱中進(jìn)行培養(yǎng)。接種所用培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基,pH5.8-6.0。28d后觀察記錄不同激素組合及濃度配比對(duì)不定芽繼代增殖的影響,記錄增殖數(shù)并計(jì)算增殖系數(shù)。

1.2.5 生根誘導(dǎo)試驗(yàn)

將長(zhǎng)勢(shì)基本一致、高約2cm的叢生芽從基部切下,轉(zhuǎn)接于添加不同激素和濃度組合的1/2MS培養(yǎng)基上進(jìn)行生根誘導(dǎo)試驗(yàn),試驗(yàn)設(shè)置6個(gè)IBA、NAA組合,每處理接種30瓶,每瓶接種3個(gè)幼苗,10瓶為1個(gè)重復(fù),每處理3次重復(fù),轉(zhuǎn)接完成后統(tǒng)一放置在人工智能氣候箱中進(jìn)行培養(yǎng)。轉(zhuǎn)接所用培養(yǎng)基為1/2MS培養(yǎng)基,pH5.8-6.0。30d后觀察記錄不同激素組合及濃度配比對(duì)金銀花無(wú)菌苗生根狀況的影響,記錄生根苗數(shù)、計(jì)算生根率、測(cè)定根長(zhǎng)。

以上4個(gè)試驗(yàn)的培養(yǎng)條件為,溫度24-26℃,濕度60%-65%,光強(qiáng)2 000Lx,光照時(shí)間12h/d。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

采用DPS 7.02統(tǒng)計(jì)軟件和Microsoft excel 2003軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

污染率 (%)=染菌的外植體數(shù)/接種外植體數(shù)×100;死亡率 (%)=死亡的外植體數(shù)/接種外植體數(shù)×100;無(wú)菌苗率 (%)=無(wú)菌出苗的外植體數(shù)/接種外植體數(shù)×100。增殖數(shù)=組培瓶?jī)?nèi)有效苗數(shù);增殖系數(shù)=增殖數(shù)/接種苗數(shù)。生根苗數(shù)=單個(gè)重復(fù)生根苗數(shù);生根率=單個(gè)重復(fù)生根苗數(shù)/單個(gè)重復(fù)轉(zhuǎn)接苗數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同消毒滅菌方法對(duì)外植體污染率、死亡率及無(wú)菌苗率的影響

由表1可知,不同消毒方法對(duì)金銀花外植體污染率、死亡率及無(wú)菌苗率的影響存在差異。A1、A2、A3處理在75%無(wú)水乙醇消毒30s條件下,隨0.1%升汞處理時(shí)間的增加,金銀花外植體污染率表現(xiàn)出下降趨勢(shì),死亡率表現(xiàn)出上升趨勢(shì),而無(wú)菌苗率表現(xiàn)出先升高后降低的趨勢(shì),表明升汞處理時(shí)間增加雖能降低外植體污染率,但卻增加了其死亡率,所以并非0.1%升汞消毒時(shí)間越久越好;A4、A5、A6處理在75%堿化乙醇消毒30s條件下,隨0.1%升汞處理時(shí)間的增加,金銀花外植體污染率、死亡率和無(wú)菌苗率表現(xiàn)出與前者類似的規(guī)律,但在0.1%升汞處理時(shí)間相同時(shí),使用75%堿化乙醇消毒的處理其污染率和死亡率均對(duì)應(yīng)低于用75%乙醇消毒的處理,如A4處理的污染率和死亡率對(duì)應(yīng)低于A1處理。另外,A2、A5處理在外植體無(wú)菌苗率上差異達(dá)顯著水平 (P＜0.05),而它們與其他處理間差異均達(dá)到極顯著水平 (P＜0.01),無(wú)菌苗率極顯著高于其他處理,分別為76.67%和82.67%,說(shuō)明這兩個(gè)處理下外植體消毒效果較好,但無(wú)菌苗率以A5處理下最高。綜合考慮,外植體最佳消毒滅菌方法為75%堿化乙醇+0.1%升汞消毒12min。

表1 不同消毒滅菌方法對(duì)外植體污染率、死亡率及無(wú)菌苗率的影響Tab.1 Effects of different disinfection and sterilization methods on explant contamination rate,mortality rate and aseptic seedling rate

2.2 不同6-BA和NAA濃度及配比對(duì)金銀花外植體不定芽誘導(dǎo)的影響

由表2可知,在NAA濃度一定時(shí),6-BA對(duì)不定芽誘導(dǎo)表現(xiàn)出低濃度促進(jìn),高濃度抑制;而6-BA濃度一定時(shí) (NAA 0.6mg/L除外),NAA對(duì)不定芽誘導(dǎo)的影響也表現(xiàn)出類似規(guī)律。

表2 不同6-BA和NAA濃度及配比對(duì)金銀花外植體不定芽誘導(dǎo)的影響Tab.2 Effects of different concentrations of 6-BA and NAA on the induction of adventitious buds in explants of Lonicera japonica Thunb.

由表2可知,6-BA濃度0.5mg/L的 B1、B4和B7處理下,不定芽發(fā)生個(gè)數(shù)最少,且生長(zhǎng)都相對(duì)細(xì)弱。6-BA濃度2.5mg/L的B3、B6和B9處理下,不定芽發(fā)生數(shù)為2-4個(gè),但不定芽較矮且生長(zhǎng)慢。6-BA濃度1.5mg/L的 B2、B5和 B8處理下,不定芽發(fā)生個(gè)數(shù)3-6個(gè),不定芽生長(zhǎng)快。另外,在6-BA 1.5mg/L+NAA 0.12mg/L的B5處理下,出芽外植體數(shù)量和不定芽誘導(dǎo)率分別為44.33和88.67%,與其他處理達(dá)到極顯著差異水平 (P＜0.01),不定芽發(fā)生數(shù)最多,達(dá)到4-5個(gè),且生長(zhǎng)健壯、生長(zhǎng)速度快。因此,金銀花外植體不定芽誘導(dǎo)最佳培養(yǎng)基配方為MS+6-BA 1.5mg/L+NAA 0.12mg/L。

2.3 不同激素組合及濃度配比對(duì)金銀花不定芽繼代增殖的影響

由表3可知,不同激素組合及濃度配比對(duì)金銀花不定芽繼代增殖的影響差異顯著。其中,含有6-BA的C1和C2處理增殖數(shù)和增殖系數(shù)較大,與其他處理間的差異均達(dá)到極顯著水平 (P＜0.01),其次是含有ZT的C5和C6處理,而含有KT的C3和C4處理較小,由此可知,6-BA較ZT和KT更有利于金銀花不定芽的繼代增殖,增殖效果最佳。在6-BA、KT或ZT相同而NAA濃度不同條件下,NAA濃度0.02mg/L較0.08mg/L更有利于增殖數(shù)和增殖系數(shù)的增加、不定芽的生長(zhǎng)、增粗和分化,如C1處理較C2處理生長(zhǎng)快、分化好,C1不定芽增高約3.8cm,高于C2的1.4cm,C3與C4、C5與C6表現(xiàn)出類似的規(guī)律,這說(shuō)明NAA濃度并非越高越好,超過(guò)一定的限度反而不利于金銀花不定芽的生長(zhǎng)并使其分化減緩?？傊?C1處理下增殖數(shù)和增殖系數(shù)均最大,分別為123.33和4.11,且接種的不定芽生長(zhǎng)快、分化好,所以金銀花繼代增殖最佳培養(yǎng)基配方為C1處理下的配方,即MS+6-BA 1.5mg/L+NAA 0.02mg/L。

表3 不同激素組合及濃度配比對(duì)金銀花不定芽繼代增殖的影響Tab.3 Effects of different hormone combinations and concentration ratios on subculture of adventitious buds of Lonicera japonica Thunb.

2.4 不同濃度激素配比對(duì)金銀花無(wú)菌苗生根誘導(dǎo)的影響

接種7-10d,不同處理的植株陸續(xù)有不定根分化,16-20d各處理不定根逐漸發(fā)生。由表4可以看出,在金銀花無(wú)菌苗接種30d后,各處理均有不定根長(zhǎng)出,但處理間生根苗數(shù)、出苗率、根長(zhǎng)和根系生長(zhǎng)狀況存在差異。在IBA濃度1.5-3.5mg/L范圍內(nèi),金銀花生根苗數(shù)、出苗率、根長(zhǎng)表現(xiàn)出類似的規(guī)律,均隨其濃度的增加呈現(xiàn)先升高再降低的趨勢(shì),并以IBA濃度2.5mg/L時(shí)上述指標(biāo)最佳。

表4 不同濃度激素配比對(duì)金銀花無(wú)菌苗生根誘導(dǎo)的影響Tab.4 Effects of different concentrations of hormones on rooting induction of aseptic seedling of Lonicera japonica Thunb.

由表4可知,在IBA濃度相同時(shí),金銀花生根苗數(shù)、出苗率、根長(zhǎng)的表現(xiàn)在NAA濃度0.6mg/L時(shí)好于 0.2mg/L時(shí)。D5(IBA 2.5mg/L+NAA 0.6mg/L)處理下,金銀花生根苗數(shù)、出苗率、根長(zhǎng)分別為 27.67個(gè)、92.2%和 3.27cm,與 D1、D3、D4差異水平達(dá)到極顯著 (P＜0.01),與D2、D6差異不明顯;生長(zhǎng)狀況,以D1、D4處理生根慢,D3、D6處理雖然生根快,但根系細(xì)弱且有愈傷組織出現(xiàn),D2和D5處理根系生長(zhǎng)快且根系健壯。所以,金銀花無(wú)菌苗生根誘導(dǎo)培養(yǎng)基配方以1/2MS+IBA 2.5mg/L+NAA 0.2-0.6mg/L較好。

3 結(jié)論與討論

以野生金銀花當(dāng)年生莖段為外植體,MS和1/2 MS作基本培養(yǎng)基,研究不同激素對(duì)金銀花外植體滅菌消毒效果、不定芽誘導(dǎo)、增殖培養(yǎng)和組培苗生根誘導(dǎo)的影響,以建立野生金銀花高效快繁體系。結(jié)果表明:外植體最佳消毒滅菌方法為75%堿化乙醇+0.1%升汞消毒12min,外植體無(wú)菌苗率達(dá)到82.67%;不定芽誘導(dǎo)最佳培養(yǎng)基配方為MS+6-BA 1.5mg/L+NAA 0.12mg/L,不定芽誘導(dǎo)率為88.67%;繼代增殖最佳培養(yǎng)基配方為MS+6-BA 1.5mg/L+NAA 0.02mg/L,增殖倍數(shù)達(dá)到4.11,與其他處理差異達(dá)到極顯著水平 (P＜0.01);生根誘導(dǎo)培養(yǎng)基配方以1/2MS+IBA 2.5mg/L+NAA 0.2-0.6mg/L較好,生根率和根長(zhǎng)分別達(dá)到85.56%-92.22%和3.14-3.27cm。

金銀花外植體無(wú)菌材料的獲得是其進(jìn)行組培快繁的前提條件,但由于其枝條表面生有疏腺毛和疏柔毛,內(nèi)部中空[7],常規(guī)消毒方法難以有效殺滅病菌。本試驗(yàn)條件下,0.1%升汞處理12min對(duì)當(dāng)年生莖段的滅菌效果好且無(wú)菌苗率最高,而處理時(shí)間5min和19min效果均不理想。李翔等[8]在對(duì)華南忍冬 (Lonicera confusa)組織培養(yǎng)的無(wú)菌研究時(shí)指出,金銀花腋芽用75%酒精處理25s+0.1%升汞處理9min和帶腋芽的莖段用75%酒精處理30s均能取得較好的滅菌效果,與本試驗(yàn)條件下升汞處理時(shí)間不同,這可能是因?yàn)槠贩N的不同、處理時(shí)間的長(zhǎng)短等對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響存在差異。本研究還得出,在0.1%升汞處理時(shí)間相同前提下,75%堿化乙醇對(duì)金銀花外植體表明滅菌效果優(yōu)于75%乙醇,這可能是因?yàn)閴A化乙醇中所含的OH-能改變細(xì)胞表面所帶電荷的性質(zhì),進(jìn)而改變膜的通透性[9],使其殺菌效果較75%乙醇更為理想?？傊?本試驗(yàn)研究表明,當(dāng)年生莖段作外植體,采用75%堿化乙醇+0.1%升汞消毒12min進(jìn)行消毒,可使用外植體無(wú)菌苗率達(dá)到82.67%,效果較好。

6-BA有利于芽的分化并能促進(jìn)側(cè)芽萌發(fā)生長(zhǎng)[10],NAA在低濃度下能夠促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng),而高濃度下促使細(xì)胞成熟衰老[11]。楊冬業(yè)等[12]通過(guò)在培養(yǎng)基中添加6-BA和IBA兩種激素進(jìn)行不定芽誘導(dǎo)研究,指出以 MS作基本培養(yǎng)基,添加6-BA 2.0mg/L+IBA0.01-0.05mg/L適合不定芽的誘導(dǎo)。本試驗(yàn)條件下,以金銀花莖段作外植體,采用MS+6-BA 1.5mg/L+NAA 0.12mg/L的方法使不定芽誘導(dǎo)效果最佳。6-BA濃度過(guò)低、過(guò)高均不利于金銀花不定芽的發(fā)生,NAA在低濃度下能夠促進(jìn)芽的生長(zhǎng),而在高濃度下作用與之相反,可見(jiàn)只有生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素在一定濃度時(shí)才能較好地誘導(dǎo)金銀花不定芽的發(fā)生。

IBA是試管苗生根試驗(yàn)中最為常用的生根劑之一[11],其濃度過(guò)低過(guò)高均不利于組培苗生根,當(dāng)濃度過(guò)低時(shí)對(duì)組培苗生根誘導(dǎo)的促進(jìn)作用不明顯,過(guò)高時(shí)會(huì)誘導(dǎo)出大量的愈傷組織從而降低生根率[13],因此只有適宜濃度的IBA才有利于試管苗的生根。本試驗(yàn)條件下,金銀花無(wú)菌苗生根誘導(dǎo)培養(yǎng)基配方以1/2MS+IBA 2.5mg/L+NAA 0.2-0.6mg/L較好,而當(dāng)IBA濃度達(dá)到3.5mg/L時(shí)D3和D6兩個(gè)處理組培苗均出現(xiàn)了愈傷組織,而愈傷組織的出現(xiàn)將嚴(yán)重影響金銀花室外移栽成活率[14],因此D6處理下的培養(yǎng)基配方不適于生根誘導(dǎo)。趙賢惠[15]在以紅金銀花頂芽為外植體進(jìn)行組培快繁研究時(shí)指出,生根培養(yǎng)以1/2MS+6-BA 0.25mg/L+NAA 1.0mg/L+活性炭1.0g/L可得到理想的生根苗。李永興等[16]研究認(rèn)為,以 1/2MS+NAA 1.50mg/L作培養(yǎng)基,金銀花灰氈毛忍冬組培苗生根效果最好,前人研究結(jié)論與本試驗(yàn)結(jié)果不一致,這可能是因?yàn)檠芯克玫钠贩N及組培所用植株部位不同造成試驗(yàn)結(jié)果的差異。