4種藥劑對油松枯梢病的室內(nèi)抑菌研究*

劉滿光,路文雅,李國松

(1.河北省林業(yè)科學(xué)研究院,河北 石家莊050061;2.河北省林木良種工程技術(shù)中心,河北 石家莊050061;3.河北省林木種苗管理站,河北 石家莊050091)

油松 (Pinus tabulaeformis)四季常青,樹形美觀,是中國北方極具價值的造林和綠化樹種,但常常受到松樹枯梢病的危害。松樹枯梢病又稱爛皮病、潰瘍病,是植物侵染性病害,主要危害油松、赤松 (Pinus densiflora Sieb.et Zucc.)和黑松 (Pinus thunbergii Parl.)等,其主要癥狀為油松頂芽枯死、枯枝、枯梢以及枯萎,此外,還表現(xiàn)出樹干流脂、潰瘍、壞死以及木材藍(lán)變和根莖腐爛等癥狀[2],常伴有黃點枯針病和赤枯病[1]發(fā)生。目前,防治松樹枯梢病的主要方法為化學(xué)防治,其是林間常用的防控方法[3-4]。但化學(xué)防治的高毒藥劑不僅會造成環(huán)境的污染,對天敵和人畜都不安全,所以尋找防治松樹枯梢病的高效低毒藥劑具有重要意義。

近年來,人們發(fā)現(xiàn)了一些低毒甚至無毒的無機化合物,這些化合物在防治病害及抑菌方面都表現(xiàn)出很好的優(yōu)勢及前景。據(jù)報道,亞磷酸鉀鹽具有明顯的殺菌效果,其中亞磷酸氫二鉀和亞磷酸二氫鉀是多種殺菌劑及肥料的活性成分,對玉蜀黍赤霉(Ascomycetes)、瓜果腐霉 (Pythium aphanidermatum)、灰葡萄孢 (Botrytis cinerea)、大麗輪枝菌(Verticillium dahliae)、禾谷絲核菌 (Rhizoctonia zeae)及核盤菌 (Sclerotinia sclerotiorum)有明顯的抑制效果[5];此外,研究表明硼酸也有抑菌作用,例如硼酸對由灰霉菌 (Botrytis cinerea)導(dǎo)致的葡萄灰霉病有明顯的抑菌效果[6],并且能夠抑制由鏈核盤菌 (Monilinia laxa)導(dǎo)致的桃褐腐病[7]和由膠胞炭疽菌 (Colletotrichum gloeosporioides)導(dǎo)致的芒果炭疽病[8]等。但亞磷酸、硼酸、亞磷酸二氫鉀以及亞磷酸氫二鉀對油松枯梢病菌 (Sphaeropsis sapinea)的影響還未見報道。

因此,本研究采用菌絲生長速率法和凹玻片法測定亞磷酸、硼酸、亞磷酸二氫鉀以及亞磷酸氫二鉀4種藥劑對油松枯梢病菌絲生長及孢子萌發(fā)的抑菌活性,研究4種藥劑對油松枯梢病菌絲生長及孢子萌發(fā)的抑菌效果,旨在為松樹枯梢病的防治提供新思路,同時為亞磷酸、硼酸、磷酸二氫鉀和磷酸氫二鉀這4種藥劑的抑菌潛力提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料及設(shè)備

1.1.1 供試菌株

油松枯梢病的病菌分離自油松枯梢病的病枝,由河北農(nóng)業(yè)大學(xué)林木病理實驗室提供,編號為KU571453;發(fā)病油松松針采自秦皇島聯(lián)峰山公園。

1.1.2 供試藥劑

硼酸 (H3BO3)由天津市恒興化學(xué)試劑制造有限公司生產(chǎn),純度≥99.5%。亞磷酸 (H3PO3)由山東西亞化學(xué)工業(yè)有限公司生產(chǎn),純度為99%。亞磷酸二氫鉀 (H2KO3P)由天津希恩思生化科技有限公司生產(chǎn),純度為98%。亞磷酸氫二鉀 (K2HPO3)由天津希恩思生化科技有限公司生產(chǎn),純度為98%。

1.1.3 儀器設(shè)備

使用的儀器設(shè)備包括超凈工作臺、高壓滅菌鍋、培養(yǎng)皿、人工氣候箱、電子天平、移液槍等。

1.2 試驗方法

1.2.1 培養(yǎng)基的制備

PDA培養(yǎng)基制備方法 馬鈴薯(Solanum tuberosum)(去皮)200g洗凈切成小塊,加入1 000mL蒸餾水煮30min,雙層紗布過濾,加蒸餾水定容至1 000mL,然后加入葡萄糖20g,瓊脂15-20g,加熱待瓊脂完全融開后,倒入錐形瓶中,用封口膜封口,高壓滅菌備用。

1.2.2 藥劑溶液配制

在超凈工作臺上進行,分別稱取4種待測藥劑放入滅菌小燒杯中,用無菌水溶解稀釋,根據(jù)預(yù)試驗結(jié)果,將其配成相應(yīng)濃度梯度的母液備用。

1.2.3 孢子懸浮液的制備

將采來的發(fā)病油松松針用無菌水沖洗干凈后,0.1%的升汞表面消毒30s,無菌水沖洗3次后,放置在無菌培養(yǎng)皿中,用接種針將其成熟的分生孢子器挑下來,輕輕按壓,并加入適量無菌水浸泡,使分生孢子完全釋放于無菌水中,配成濃度為1×106個/mL的孢子懸浮液,保存于-4℃冰箱中備用。

1.2.4 供試藥劑對菌絲生長的影響

在超凈工作臺中無菌操作環(huán)境下,采用菌絲生長速率法[9],將10mL母液倒入溫度為50-60℃滅菌溶融狀態(tài)的90mL的PDA培養(yǎng)基中,充分搖勻,倒入直徑9cm的培養(yǎng)皿內(nèi),冷卻凝固后,將在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)了3d的松樹枯梢病菌用直徑5mm的打孔器在距菌落中心3cm處打取菌餅,然后接種于含藥PDA培養(yǎng)基中央,并置于25℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)黑暗培養(yǎng),3d、5d、7d后,以十字交叉法測量菌落直徑取平均值。每處理重復(fù)3次,以加10mL無菌水的培養(yǎng)基為對照。通過以下公式計算藥劑對菌絲生長的抑制率:I=(D0-D1)/D0×100%,式中,I為抑制率,D0為空白對照菌落增長直徑,D1為藥劑處理菌落增長直徑。

1.2.5 供試藥劑對孢子萌發(fā)的影響

根據(jù)預(yù)試驗結(jié)果,用無菌水配制成不同濃度梯度的供試藥液,采用凹玻片法[10],將孢子懸浮液及配好的供試藥液各20μL,滴于蓋玻片上混勻,翻轉(zhuǎn)平放于凹玻片凹槽上,放在鋪有濕潤濾紙的培養(yǎng)皿中,用保鮮膜封上進行保濕,并置于25℃培養(yǎng)箱中恒溫光照培養(yǎng),每個處理3次重復(fù),以無菌水為對照。每隔8h鏡檢1次,每個載玻片觀察5個視野,記錄孢子萌發(fā)數(shù)量,計算萌發(fā)率及萌發(fā)抑制率。以萌發(fā)出的芽管長度大于孢子直徑長度(指直徑最小的一邊)的一半時計為萌發(fā)。孢子萌發(fā)率 (%)=萌發(fā)的孢子數(shù)/孢子總數(shù)×100;孢子萌發(fā)抑制率 (%)=對照孢子萌發(fā)量-處理孢子萌發(fā)量/對照孢子萌發(fā)量×100。

1.3 數(shù)理統(tǒng)計

采用Excel軟件整理錄入數(shù)據(jù),用DPS、SPSS軟件對數(shù)據(jù)進行分析,并計算各藥劑的毒力回歸方程和EC50值 (半最大效應(yīng)濃度)。

2 結(jié)果與分析

2.1 4種藥劑對油松枯梢病菌絲生長的影響

由表1可以看出,亞磷酸、硼酸、亞磷酸二氫鉀和亞磷酸氫二鉀4種藥劑對油松枯梢病菌絲的生長均有一定的抑制作用,抑制率均隨各藥劑濃度的增加而增大,且隨時間的延長而下降。即各藥劑濃度對油松枯梢病菌絲生長的抑制率在第3d最高。第3d,濃度為0.5g/L的亞磷酸對油松枯梢病的抑制率為97.16%,濃度為10g/L的硼酸對油松枯梢病的抑制率為79.2%,濃度為28g/L的亞磷酸二氫鉀及亞磷酸氫二鉀對油松枯梢病的抑制率分別為98.77%和95.51%。

表1 不同藥劑對油松枯梢病菌絲生長的影響Tab.1 Effect of four fungicides on the mycelial growth of S.sapinea

2.2 4種藥劑對油松枯梢病菌絲生長的室內(nèi)毒力測定分析

由表2可以看出,亞磷酸、硼酸、亞磷酸二氫鉀和亞磷酸氫二鉀4種藥劑對油松枯梢病抑制率的EC50值均隨時間的增加而增大,說明其持效性較差。即各藥劑對油松枯梢病抑制率的EC50值在第3d最小,其中亞磷酸的EC50值最小,為0.374,硼酸的EC50值為1.669,亞磷酸二氫鉀的EC50值為6.136,亞磷酸氫二鉀的EC50值最大,為7.360。

由此可知,4種藥劑對油松枯梢病菌絲生長均有抑制作用,抑制作用由強到弱為亞磷酸＞硼酸＞亞磷酸二氫鉀＞亞磷酸氫二鉀,并且亞磷酸的速效性和持效性都優(yōu)于其他3種藥劑。

表2 不同藥劑對油松枯梢病病菌菌絲生長的室內(nèi)毒力測定Tab.2 The toxicity of four fungicides on mycelial growth of S.sapinea in laboratory

2.3 不同藥劑對松樹枯梢病孢子萌發(fā)的影響

由表3可以看出,亞磷酸、硼酸、亞磷酸二氫鉀和亞磷酸氫二鉀4種藥劑對油松枯梢病的孢子萌發(fā)率均有抑制作用,抑制率均隨各藥劑濃度的增加而增大,且隨時間的延長而增加。即各藥劑濃度對油松枯梢病孢子萌發(fā)的抑制率在24h最高。濃度為2g/L的亞磷酸對油松枯梢病的抑制率在24h為99.41%,濃度為3g/L的硼酸對油松枯梢病的抑制率在24h為99.54%,濃度為22.4g/L亞磷酸二氫鉀及亞磷酸氫二鉀對油松枯梢病的抑制率在24h分別為75.87%和50.84%。

表3 4種藥劑對油松枯梢病孢子萌發(fā)的影響Tab.3 Effect of four fungicides on spore germination of S.sapinea

2.4 不同藥劑對油松枯梢病孢子萌發(fā)室內(nèi)毒力測定分析

由表4可以看出,亞磷酸、硼酸、亞磷酸二氫鉀和亞磷酸氫二鉀4種藥劑對油松枯梢病孢子萌發(fā)抑制率的EC50值均隨時間的增加而減小,說明持效性好,即各藥劑對油松枯梢病孢子萌發(fā)抑制率的EC50值在24h最小,其中亞磷酸的EC50值最小,為0.587,硼酸的EC50值為1.043,亞磷酸二氫鉀的EC50值為4.636,亞磷酸氫二鉀的EC50值最大,為19.058。結(jié)果表明,4種藥劑對油松枯梢病孢子萌發(fā)均有抑制作用,且抑制作用由強到弱為亞磷酸＞硼酸＞亞磷酸二氫鉀＞亞磷酸氫二鉀,其中亞磷酸的速效性最好。

3 結(jié)論與討論

松樹枯梢病是松樹上比較嚴(yán)重的病害,不僅影響松樹生長,還影響它的觀賞價值,選擇防治松樹枯梢病的高效低毒藥劑可以彌補傳統(tǒng)化學(xué)藥劑的不足。本研究對亞磷酸、硼酸、磷酸二氫鉀以及磷酸氫二鉀4種藥劑對油松枯梢病的影響結(jié)果表明,4種藥劑對油松枯梢病菌絲生長及孢子萌發(fā)均有一定的抑制作用,且菌絲生長抑制率的篩選結(jié)果與對孢子萌發(fā)抑制率的篩選結(jié)果大致相同,抑制作用由強到弱依次為亞磷酸、硼酸、磷酸二氫鉀和磷酸氫二鉀。

亞磷酸對菌絲生長和孢子萌發(fā)抑制效果最好,但其抑菌機制還需要進一步的試驗研究。硼酸對松樹枯梢病的抑制作用也較好,其抑菌機理可能是通過引起病原菌細(xì)胞內(nèi)活性氧代謝紊亂,破壞線粒體的功能,導(dǎo)致蛋白質(zhì)氧化損傷,抑制病原菌細(xì)胞外水解酶的分泌[11-19]。Qin等[6]的研究表明,硼酸能夠直接破壞病原菌的質(zhì)膜,導(dǎo)致胞內(nèi)物質(zhì)的滲漏。亞磷酸二氫鉀以及亞磷酸氫二鉀對松樹枯梢病的抑制作用則可能是因為亞磷酸鹽不僅可以直接作用于病原菌,還能刺激宿主產(chǎn)生防御反應(yīng)[20]。雖然本研究中亞磷酸和硼酸對松樹枯梢病菌的抑制作用較強,但在實際應(yīng)用中,亞磷酸有腐蝕性,對皮膚及呼吸道均有刺激性,所以要慎重使用,而硼酸也能夠刺激皮膚,其生物安全性需要進一步探討評估。

本研究為亞磷酸、硼酸、亞磷酸二氫鉀以及亞磷酸氫二鉀4種藥劑對松樹枯梢病的防治奠定了基礎(chǔ),之后可以對4種藥劑的抑菌作用機制以及各種抑菌物質(zhì)的復(fù)配效果進行探索研究。但本研究僅在室內(nèi)完成,其林間應(yīng)用效果以及未來的產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用還需要進一步的林間試驗。