腺苷A1受體介導(dǎo)參麥注射液對肢體缺血再灌注損傷大鼠海馬組織的保護作用*

何海娟 楊燕青 戴勤學(xué)

［1.臺州恩澤醫(yī)療中心（集團）恩澤醫(yī)院，浙江 臺州 318000；2.臺州恩澤醫(yī)療中心（集團）浙江省臺州醫(yī)院，浙江 臺州 318000；3.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院，浙江 溫州 325000］

【目的】 觀察腺苷A1受體是否介導(dǎo)參麥注射液對肢體缺血再灌注損傷大鼠的腦保護作用。方法 60只大鼠隨機分為對照組、模型組、參麥注射液組、參麥注射液+腺苷A1受體拮抗劑組、溶劑對照組。采用雙側(cè)股動脈夾閉的方法建立大鼠肢體缺血再灌注損傷模型，對照組大鼠不夾閉股動脈，其他操作同造模大鼠。參麥注射液組大鼠在造模后即刻腹腔注射參麥注射液，模型組大鼠在造模后即刻腹腔注射等量0.9%氯化鈉注射液，參麥注射液+腺苷A1受體拮抗劑組大鼠在造模前30 min腹腔注射腺苷A1受體拮抗劑，造模后即刻腹腔注射參麥注射液。溶劑對照組大鼠只在造模前30 min注射二甲亞砜。大鼠肢體缺血再灌注48 h后處死，觀察海馬組織的腦水含量，采用尼氏染色觀察大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元損傷情況，采用Western blot法觀察大鼠海馬組織中Bcl-2和Bax蛋白表達量。結(jié)果 與對照組比較，模型組大鼠的海馬組織腦水含量明顯增高 （P<0.05），Bcl-2/Bax比率明顯減小，海馬CA1區(qū)正常細胞數(shù)量明顯減少（P<0.05）。與模型組比較，參麥注射液組大鼠海馬組織腦水含量明顯減少（P<0.05），海馬CA1區(qū)正常細胞數(shù)量明顯增多，Bcl-2/Bax比率明顯升高（P<0.05）。與參麥注射液組比較，參麥注射液+腺苷A1受體拮抗劑組大鼠海馬組織腦水含量明顯增加，Bcl-2/Bax比率明顯降低，海馬CA1區(qū)正常細胞數(shù)量明顯減少（P<0.05）。結(jié)論 參麥注射液對肢體缺血再灌注損傷大鼠海馬組織具有保護作用；腺苷A1受體可能介導(dǎo)了參麥注射液對肢體缺血再灌注損傷大鼠海馬組織的保護作用。

肢體缺血再灌注損傷在臨床上是一個常見的病理生理過程，比如肢體血管再通、斷肢再植等［1］。當(dāng)肢體血流恢復(fù)時，其不僅僅引起肢體骨骼肌缺血性損傷，還可以通過全身炎癥反應(yīng)影響到遠端臟器的損傷，比如肺、腦、腎等重要器官損傷［2］。目前研究者的關(guān)注熱點逐漸轉(zhuǎn)移到遠端臟器損傷的保護。有研究表明大鼠肢體發(fā)生缺血再灌注損傷時，可以引起海馬組織損傷，誘發(fā)大鼠認知功能障礙［3］。腺苷A1受體是一種抑制型G蛋白偶聯(lián)受體，通過配體腺苷激活后可以減少釋放興奮性氨基酸，從而達到神經(jīng)保護的作用［4］。參麥注射液是臨床常用的一種藥物，中醫(yī)理論認為參麥注射液具有益氣養(yǎng)陰之功效，其有效成分為麥冬皂苷、人參皂苷、麥冬黃酮、麥冬多糖和人參多糖［5］。課題組前期研究表明參麥注射液對腦缺血再灌注損傷大鼠具有神經(jīng)保護的作用［6］，也有研究表明參麥注射液能改善肢體缺血再灌注損傷過程的肺脂質(zhì)過氧化損傷，從而減少肺臟的損傷［7］，但是其具體的機制并沒有被完全闡明。因此，本研究探討腺苷A1受體是否介導(dǎo)了參麥注射液對肢體缺血再灌注損傷大鼠海馬組織的保護作用?，F(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 健康雄性SPF級Sprague Dawley大鼠 60只，體質(zhì)量（220±20）g，由上海斯萊克實驗動物公司提供，許可證號碼：SCXK（滬）2015-0035。于造模前72 h購買并飼養(yǎng)于SPF級動物房中。手術(shù)前1 d禁食，但不禁水。

1.2 試藥與儀器 參麥注射液（正大青春寶藥業(yè)有限司）；A1R拮抗劑腺苷受體阻斷劑（1，3-dipropyl-8-cyclopentylxanthine，DPCPX，批號：2016YE356678）、二甲基亞砜（DMSO，美國 Sigma公司，批號：2013YE246396）；Bcl-2抗體 （美國Bioworld Technology公司，批號：SY20134321）；Bax抗體（美國abcam 公司，批號：ab53154）；酶標(biāo)儀（DENLEY DRAGON Wellscan MK3，Thermo，芬蘭）；BX60 顯微鏡（Olympus）。

1.3 給藥方法 參麥注射液組大鼠在造模后即刻腹腔注射參麥注射液15 mL/kg［9］，模型組大鼠在造模后即刻腹腔注射等量0.9%氯化鈉注射液。將腺苷A1受體拮抗劑用DMSO溶劑溶解成1 mg/mL，參麥注射液+腺苷A1受體拮抗劑組大鼠在造模前30 min腹腔注射腺苷A1受體拮抗劑1 mg/kg，造模后即刻腹腔注射參麥注射液15 mL/kg。溶劑對照組大鼠僅在造模前30 min注射DMSO溶劑1 mL/kg。

1.4 標(biāo)本采集與檢測 1）尼氏染色。每組取6只大鼠麻醉后處死，剪開胸腔，用4%多聚甲醛經(jīng)心臟進行灌注，直至大鼠全身僵硬，取出腦組織，放置4%多聚甲醛溶液浸泡過夜后，按常規(guī)方法制備石蠟組織切片。將備好的組織切片用甲酚紫染色液（尼氏染色液）對切片進行染色10 min，用蒸餾水沖洗干凈；在顯微鏡下用分化液進行分化，直至背景色接近無色；酒精脫水，二甲苯透明，樹膠封片。海馬CA1區(qū)錐體層正常神經(jīng)元細胞數(shù)在400倍光鏡下計數(shù)。對照組大鼠海馬神經(jīng)元中的圓形神經(jīng)元認為是正常細胞。2）腦水含量測定。大鼠麻醉后處死，斷頭，在冰面上取出雙側(cè)海馬組織，其中一側(cè)放入液氮中準(zhǔn)備進行Western bolting檢測。另一側(cè)海馬組織用濾紙吸干，稱重并記錄濕重，后置于60℃恒溫箱48 h烤干稱干重，求得腦水含量（%）=（濕重-干重）/濕重×100%。3）Western bolting法檢測 Bcl-2/Bax比率。海馬組織總蛋白的提取采用細胞蛋白提取試劑盒（Thermo公司，美國），按照說明書的步驟操作。等量樣品經(jīng)聚偏二氟乙烯膜分離蛋白轉(zhuǎn)移至NC膜上，轉(zhuǎn)移后的NC膜經(jīng)BSA孵育1 h，再封閉后，分別加入兔抗大鼠Bcl-2或Bax單克隆抗體 （Santa Cruz公司，美國），4℃孵育并過夜。室溫下?lián)u床沖洗，再孵育二抗（山羊抗兔），并化學(xué)發(fā)光，顯影、成像。β-actin作為內(nèi)參對照。應(yīng)用Alphaimager 2200凝膠圖像處理系統(tǒng)分析目的蛋白。蛋白表達水平用目的蛋白條帶光密度值與β-actin條帶光密度值的比值來表示。Bcl-2/Bax比率＝Bcl-2蛋白表達水平/Bax蛋白表達水平。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS19.0統(tǒng)計軟件。計量資料以（±s）表示，組間比較均采用單因素方差分析，若方差不齊采用Tamhane檢驗進行兩兩比較；若方差齊采用LSD檢驗進行兩兩比較。P<0．05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠海馬組織腦水含量比較 見表1。與空白對照組比較，模型組大鼠的海馬組織腦水含量明顯增高（P<0.05），與模型組比較，參麥注射液組大鼠海馬組織腦水含量明顯減少（P<0.05），與參麥注射液組比較，參麥注射液+腺苷A1受體拮抗劑組大鼠海馬組織腦水含量明顯增加（P<0.05）。溶劑對照組與模型組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。

2.2 各組大鼠海馬CA1區(qū)正常神經(jīng)元計數(shù)比較 見表1，圖1。采用尼氏染色的方法標(biāo)記海馬CA1區(qū)正常神經(jīng)元?？梢娔Ｐ徒M大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元胞體明顯縮小，胞漿內(nèi)尼氏體少而小，呈顆粒狀，細胞周圍出現(xiàn)水腫裂隙。參麥注射液組大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元損傷程度較模型組大鼠明顯好轉(zhuǎn)。參麥注射液+腺苷A1受體A1拮抗劑組大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元損傷程度較參麥注射液組大鼠嚴重。與空白對照組比較，模型組大鼠海馬CA1區(qū)正常神經(jīng)元計數(shù)明顯減少（P<0.05），與模型組比較，參麥注射液組大鼠海馬CA1區(qū)正常神經(jīng)元計數(shù)明顯增多（P<0.05），與參麥注射液組比較，參麥注射液+腺苷A1受體拮抗劑組大鼠海馬CA1區(qū)正常神經(jīng)元計數(shù)明顯減少（P<0.05）。溶劑對照組與模型組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。

2.3 各組大鼠海馬組織Bcl-2/Bax比率比較 見表1，圖2。與空白對照組比較，模型組大鼠海馬組織Bcl-2/Bax比率明顯減小（P<0.05），與模型組比較，參麥注射液組大鼠海馬組織Bcl-2/Bax比率明顯增大（P<0.05），與參麥注射液組比較，參麥注射液+腺苷A1受體拮抗劑組大鼠海馬組織Bcl-2/Bax比率明顯減?。≒<0.05）。溶劑對照組與模型組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。

表1 各組大鼠海馬組織腦水含量、正常神經(jīng)元計數(shù)、Bcl-2/Bax比率比較（±s）

表1 各組大鼠海馬組織腦水含量、正常神經(jīng)元計數(shù)、Bcl-2/Bax比率比較（±s）

與對照組比較，*P＜0.05；與模型組比較，△P＜0.05，與參麥注射液組比較，#P＜0.05

組 別 n Bcl-2/Bax比率海馬組織腦水含量（%）空白對照組 12 1.73±0.35模型組 12 0.67±0.25*參麥注射液組 12 2.27±0.79△正常神經(jīng)元計數(shù)（個/mm2）76.25±1.92 502±198 87.65±1.12* 329±129*79.36±2.13△ 467±157△參麥注射液+腺苷A1受體拮抗劑組 12 1.32±0.57#83.97±1.59# 394±116#溶劑對照組 12 75.19±1.79 486±143 0.58±0.31

圖1 各組大鼠海馬CA1區(qū)尼氏染色圖

圖2 各組大鼠海馬組織Bcl-2/Bax蛋白表達量

3 討 論

肢體缺血再灌注損傷可以引起遠端重要臟器損傷，從而誘發(fā)多器官功能障礙，最終導(dǎo)致死亡［10］。因此預(yù)防肢體缺血再灌注損傷誘發(fā)的遠端臟器損傷顯得十分重要。目前在臨床上，參麥注射液已經(jīng)廣泛運用于圍手術(shù)期患者的器官保護［11］，但是其具體的機制并不明確。故本文以肢體缺血再灌注損傷大鼠為模型，以參麥注射液為干預(yù)手段，以大鼠海馬組織CA1組織形態(tài)學(xué)、腦水含量、Bcl-2/Bax比率為觀察指標(biāo)，以腺苷A1受體為研究切入點，從機制上闡明腺苷A1受體介導(dǎo)參麥注射液對大鼠肢體缺血再灌注損傷誘發(fā)腦損傷的保護作用。

在本實驗中，筆者發(fā)現(xiàn)肢體缺血再灌注損傷可以引起大鼠海馬組織CA1區(qū)正常神經(jīng)元計數(shù)明顯較對照組減少，海馬組織腦水含量明顯高于對照組，Bcl-2/Bax比率明顯低于對照組，說明肢體缺血再灌注損傷確實可以誘發(fā)大鼠海馬組織的損傷，這與先前的研究結(jié)果相一致。參麥注射液注組大鼠海馬組織CA1區(qū)正常神經(jīng)元計數(shù)明顯較模型組增多，海馬組織腦水含量明顯低于模型組，Bcl-2/Bax比率明顯高于模型組，說明參麥注射液可以緩解肢體缺血再灌注損傷誘發(fā)的腦損傷。而參麥注射液+腺苷A1受體拮抗劑組大鼠的海馬組織腦水含量明顯較參麥注射液組增加，海馬CA1區(qū)正常神經(jīng)元計數(shù)明顯少于參麥注射液組，Bcl-2/Bax比率明顯低于參麥注射液組，說明腺苷A1受體拮抗劑能夠部分逆轉(zhuǎn)參麥注射液對肢體缺血再灌注損傷大鼠的腦保護作用。溶劑對照組與模型組比較，海馬組織CA1區(qū)正常神經(jīng)元計數(shù)、海馬組織腦水含量和Bcl-2/Bax比率差異均無統(tǒng)計學(xué)意義，說明DMSO溶劑本身并不會對實驗結(jié)果造成影響。

有研究表明大鼠肢體缺血再灌注后腦組織中Bcl-2蛋白表達減少而Bax蛋白表達增加，我們的研究結(jié)果與其相一致。有研究認為，Bcl-2和Bax蛋白調(diào)節(jié)細胞的程序性死亡，不但取決于自身表達量的高低，還與其兩者的比值相關(guān)。當(dāng)Bcl-2蛋白表達增加時，則抑制細胞凋亡，當(dāng)Bax蛋白表達增加時，則加快細胞凋亡［12］。故本實驗采用Bcl-2/Bax比率來評價海馬組織的損傷程度。

另有研究表明，參麥注射液可以增加腦組織中三磷酸腺苷（ATP）水平［6］，而 ATP 可以通過酶降解生成腺苷［13］。腺苷是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的一種重要的神經(jīng)調(diào)質(zhì)［13］。腺苷受體分為A1、A2a、A2b、A3受體，其中與腦保護最為密切相關(guān)的是腺苷A1受體［4］。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，腺苷A1受體密集分布在海馬、小腦、上丘、皮質(zhì)中。已有大量的研究表明腺苷A1受體對腦缺血性損傷具有神經(jīng)保護作用，其機制為抗炎、抗氧自由基形成、抗凋亡等［14］。因此，我們推測參麥注射液可以通過提高海馬組織中的腺苷水平，進而激動腺苷A1受體達到腦保護的作用。

肢體缺血再灌注損傷誘發(fā)遠端臟器損傷的機制十分復(fù)雜，目前認為炎癥反應(yīng)在此起了重要作用，腫瘤壞死因子-α（TNF-α）和白介素-1β（IL-1β）在其中起了重要作用［15］。進一步實驗將會觀察海馬組織中的TNF-α和IL-1β，從更深一層機制中闡明參麥注射液對肢體缺血再灌注損傷的腦保護作用。

綜上所述，參麥注射液可以緩解大鼠肢體缺血再灌注損傷誘發(fā)的海馬組織損傷，而腺苷A1受體拮抗劑能夠部分逆轉(zhuǎn)該效應(yīng)。因此，腺苷A1受體可能部分介導(dǎo)了參麥注射液對肢體缺血再灌注損傷大鼠海馬組織的保護作用。