纖維素降解菌的分離篩選及對(duì)中藥廢棄物的固相發(fā)酵研究

常 帆，上官亦卿， 呂 睿， 丁 浩， 賈鳳安

(陜西省微生物研究所 微生物代謝產(chǎn)物研究中心，陜西 西安 710043)

木質(zhì)纖維素(Lignocellulosic biomass)是一類高分子結(jié)構(gòu)復(fù)雜的生物質(zhì)[1]，其中纖維素、半纖維素和木質(zhì)素是木質(zhì)纖維素類物質(zhì)的主要的三種組分，其中纖維素分子通過氫鍵形成牢固的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，有些與木質(zhì)素交聯(lián)在一起，難以轉(zhuǎn)化利用?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)自然界中包括細(xì)菌、真菌、放線菌等多種微生物對(duì)木質(zhì)纖維素類物質(zhì)有降解作用[2-4]，而利用不同微生物組成功能菌系聯(lián)合降解木質(zhì)纖維素類物質(zhì)是當(dāng)今研究的熱點(diǎn)[5-6]。中藥廢棄物(Chinese medicinal herbal residues)主要來源于中藥材的加工、炮制、提取等過程[7-8]，非入藥部位通常歸為廢料簡(jiǎn)單丟棄或焚燒。而中藥廢棄物中富含木質(zhì)纖維素類物質(zhì)，同時(shí)還含有多糖類、蛋白質(zhì)、脂類、黃酮類、生物堿以及多種微量元素等大量可再利用的營(yíng)養(yǎng)成分[9]，利用固相發(fā)酵手段發(fā)揮微生物對(duì)木質(zhì)纖維素類的生物降解作用，增加中藥廢棄物活性成分的釋放，充分利用中藥藥渣的生物質(zhì)資源，是解決提高中藥廢棄物精細(xì)高值化利用的新思路。本研究篩選到16株對(duì)纖維素有降解效果的菌株，對(duì)8株有明顯作用的菌株的纖維素酶活性進(jìn)行了初步研究，并以中藥廢棄物為基質(zhì)，利用5株細(xì)菌、3株真菌固相發(fā)酵檢驗(yàn)其降解木質(zhì)纖維素的效果，為之后的菌系構(gòu)建和聯(lián)合降解提供研究基礎(chǔ)，同時(shí)為利用中藥廢棄物生產(chǎn)生物有機(jī)肥料和微生物飼料提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品 中藥廢棄物：來源于陜西中醫(yī)醫(yī)院；土壤樣本：來源于陜西省微生物研究所采自陜西境內(nèi)各種生境的土壤；引物為北京六合華大基因科技有限公司合成。

1.1.2 培養(yǎng)基(g/L) ①營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基(NA)：牛肉膏3.0，蛋白胨10.0，NaCl5.0，瓊脂15.0， pH 7.3；②富集液體培養(yǎng)基：濾紙片20 g，(NH4)2SO41.4，K2HPO42.0，MgSO40.3，MnSO41.6，CaCl20.3，F(xiàn)eSO45.0 mg/L，ZnCl21.7 mg/L，pH 5.5；③赫奇遜固體培養(yǎng)基：KH2PO4l.0，MgSO4·7H2O 0.3，NaCl 0.1，F(xiàn)eCl20.01，CaCl2·H2O 0.1，NaNO32.5，瓊脂15.0。倒平板后在平板上覆蓋滅菌圓形濾紙片；④羧甲基纖維素培養(yǎng)基：CMC-Na 15.0，K2HPO4l.0，NH4NO3l.0，MgSO4·7H2O 0.5，NaCl 0.5，瓊脂15.0；⑤剛果紅培養(yǎng)基：CMC-Na 2.0，(NH4)2SO42.0，K2HPO41.0，MgSO4·7H2O 0.5，剛果紅0.4，瓊脂15～20，pH 7.0。以上使用試劑均為分析純，上述培養(yǎng)基及材料均經(jīng)過121 ℃滅菌30 min后待用。

1.2 方法

1.2.1 纖維素降解菌的生物富集及篩選 稱取5 g土壤樣品，加入富集液體培養(yǎng)基中，30 ℃ 180 r/min振蕩培養(yǎng)富集2 d。富集培養(yǎng)后樣品進(jìn)行梯度稀釋后從10-3～10-7倍的稀釋液中各取0.1 mL，涂布于羧甲基纖維素培養(yǎng)基，30 ℃ 180 r/min培養(yǎng)3 d，每隔24 h觀察菌落生長(zhǎng)情況。然后挑取對(duì)羧甲基纖維素培養(yǎng)基中濾紙能夠降解的菌落，-80 ℃保存。將菌種接種于NA中活化后點(diǎn)接于羧甲基纖維素培養(yǎng)基上，30 ℃培養(yǎng)2～4 d，0.5 g/L剛果紅染色5 min，1 mol/L 的NaCl溶液7～10 mL脫色30 min。以透明圈的直徑計(jì)算CMC酶的相對(duì)活性。利用3,5-二硝基水楊酸法(DNS法)測(cè)定β-葡聚糖苷酶活力(CMCase)。以1 mg酶每分鐘催化纖維素水解生成葡萄糖微克數(shù)定為一個(gè)活力單位。計(jì)算方法如下：

N：酶液稀釋倍數(shù)；T：糖化所用時(shí)間；1：反應(yīng)酶液mL數(shù)。

1.2.2 纖維素降解菌的鑒定 對(duì)獲得菌株純培養(yǎng)后，提取DNA，然后進(jìn)行PCR擴(kuò)增。菌株的分子生物學(xué)鑒定：對(duì)獲得的菌株純培養(yǎng)后進(jìn)行菌落 PCR。鑒定細(xì)菌所用的特異性通用引物27f (5′-AGAGTTTGATCCTTGGCTCAG-3′)和 1492r (5′-ACGGTTACCTTACGACTT-3′)進(jìn)行菌落PCR擴(kuò)增 16S rDNA基因。反應(yīng)體系(25 μL)：2×PCR 緩沖液12.5 μL，無菌水11 μL，引物各1 μL，模板挑肉眼可見單克隆。PCR擴(kuò)增條件：94 ℃預(yù)變性10 min ，94 ℃變性1 min，50 ℃退火45 s，72 ℃延伸1.5 min，35個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸3 min，PCR產(chǎn)物于4 ℃下存放。反應(yīng)產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)合格后，送六合華大基因公司測(cè)序。鑒定真菌所用的特異性引物NL1 (5′-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3′)和NL4(5′-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3′)擴(kuò)增26S rRNA基因反應(yīng)體系(50 μL)：2×PCR Buffer 25 μL，無菌水22 μL，引物各1 μL，模板菌體肉眼可見。PCR擴(kuò)增條件：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性1 min，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán)后72 ℃延伸3 min，產(chǎn)物于4 ℃下存放。反應(yīng)產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)合格后，送六合華大基因公司測(cè)序。

1.2.3 降解細(xì)菌固態(tài)發(fā)酵中藥廢棄物的效果實(shí)驗(yàn) 上述篩選到的微生物按5%的比例接種于NA中，培養(yǎng)2～5 d，在中藥廢棄物中添加5%的豆粕作為補(bǔ)充氮源，將種子液按10%比例分別接種于中藥廢棄物中。取若干塑料盒，并在其側(cè)面開設(shè)通風(fēng)孔，確保中間的位置可以插入溫度計(jì)。取適量中藥廢棄物，接入菌體后，進(jìn)行淺盤發(fā)酵，每間隔一天分別讀取堆體溫度、pH、含水量。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果均利用Office Excel 2010和GraphPad Prism 5軟件作圖并分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 纖維素降解菌的篩選

將初篩獲得的菌株進(jìn)行剛果紅染色(圖1)，可以發(fā)現(xiàn)有菌株產(chǎn)生了明顯的透明圈，且透明圈大小不一，提示不同菌株對(duì)纖維素降解效果有強(qiáng)弱。

以細(xì)菌透明圈直徑平均值/菌落直徑平均值>2 cm、真菌透明圈直徑平均值/菌落直徑平均值>1 cm為標(biāo)準(zhǔn)，篩選得到7株高效纖維素降解細(xì)菌(表1)?？梢钥吹?株細(xì)菌對(duì)纖維素降解效果較強(qiáng)，其中1#、2#、5#、8X01、13X03效果較好，除1#外透明圈直徑平均值/菌落直徑平均值均高于3(1#為2.92)，透明圈直徑和菌落直徑均較大；同時(shí)真菌的降解效果較弱，多數(shù)真菌隨菌絲體長(zhǎng)勢(shì)降解纖維素，透明圈直徑平均值/菌落直徑平均值接近1；其中7z02、8z02、18z02菌株分泌纖維素酶類至固體培養(yǎng)基中，降解效果較明顯。說明細(xì)菌利用培養(yǎng)基中纖維素并生長(zhǎng)旺盛，而真菌因生長(zhǎng)周期的緣故降解較慢。

圖1 纖維素降解細(xì)菌、真菌的篩選Fig.1 Degradation of cellulose degradation bacteria and fungi

菌落編號(hào)透明圈直徑D1/cm透明圈直徑D2/cm菌落直徑d1/cm菌落直徑d2/cm透明圈直徑/菌落直徑1#2.12.00.90.52.922#2.62.50.90.73.194#4.03.82.01.62.175#3.12.61.10.73.178X013.33.21.20.93.1011X011.71.50.80.52.4613X031.30.70.30.24.007z014.54.44.34.21.047z024.64.93.23.11.507z033.43.33.23.31.037z044.34.03.73.51.158z025.55.43.43.01.709z013.13.23.13.11.0111z014.24.34.34.21.0018z013.53.43.33.21.0618z022.52.62.02.11.20

2.2 纖維素降解菌的復(fù)篩

在赫奇遜培養(yǎng)基中培養(yǎng)不同時(shí)間，利用DNS法檢測(cè)不同菌株在不同時(shí)間的纖維素酶活性，在540 nm的光吸收值對(duì)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算，即可確定還原糖產(chǎn)生的量，用以確定以下酶活力單位?？梢园l(fā)現(xiàn)，與初篩結(jié)果相似，細(xì)菌在培養(yǎng)初期就展現(xiàn)較高的CMCase活性，而隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加，不同菌株展現(xiàn)出不同的產(chǎn)纖維素酶能力，其中細(xì)菌1#、2#、5#、13X03隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加酶活不斷增加；而細(xì)菌4#、11X01隨著培養(yǎng)時(shí)間達(dá)到4 d后，酶活開始下降；細(xì)菌8X01在培養(yǎng)2 d后酶活一直持續(xù)在一定水平。4 d時(shí)1#菌CMCase酶活最強(qiáng)，達(dá)到1 560.5 u/mL。發(fā)現(xiàn)細(xì)菌1#、2#、5#和13X03在生長(zhǎng)過程中，纖維素酶活力一直在升高，在4 d時(shí)1#和5#的CMC酶活性明顯高于其他菌株。而菌株在培養(yǎng)過程中CMCase的變化也提示在降解纖維素類物質(zhì)的過程中應(yīng)發(fā)揮不同菌株的特性聯(lián)合降解。

圖2 細(xì)菌CMCase活性隨培養(yǎng)時(shí)間的變化Fig.2 The results of bacterial CMCase activity changes with culture time

圖3為真菌培養(yǎng)時(shí)CMCase活性變化情況。因真菌生長(zhǎng)周期較長(zhǎng)等因素，影響真菌產(chǎn)纖維素能力，但5 d后各真菌纖維素酶產(chǎn)酶活性均高于3 d，其中7z02、8z02、18z02三株真菌在5 d時(shí)表現(xiàn)出較高的酶活力和較快的產(chǎn)酶變化率。

圖3 真菌CMCase活性隨培養(yǎng)時(shí)間的變化Fig.3 The results of fungalCMCase activity changes with culture time

2.3 纖維素降解菌的鑒定

將酶活較高的不同菌株(細(xì)菌：1#、2#、5#、8X01、13X03；真菌：7z02、8z02、18z02)PCR產(chǎn)物送華大基因測(cè)序，得到不同的測(cè)序序列，用Blast程序比對(duì)，得到序列同源性達(dá)到99%的鑒定結(jié)果，見圖4。

圖4 降解纖維素細(xì)菌系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.4 Phylogenetic tree of lignocellulolyticbacteria

由圖4可知，1#、2#、5#均為Bacillus屬，其中1#、2#可能為Bacillusmethylotrophicus，而5#可能為Bacillussubtilis。因Bacillus屬種間進(jìn)化關(guān)系非常相近，所以需要利用脂肪酸代謝、DNA雜交等手段進(jìn)一步確定其進(jìn)化關(guān)系。Bacillus降解纖維素類物質(zhì)的相關(guān)報(bào)道很多[10-11]，部分是由腸道系統(tǒng)分離得到的[12]，本研究由土壤中分離到纖維素降解菌，因缺乏腐殖質(zhì)的新造土壤為原生環(huán)境，利用潛力較大。8X01菌株經(jīng)鑒定為Streptomyces屬，可以看到其與Streptomycesgriseovifidis和Streptomycesniveoruber聚為一簇，提示可能屬于其中的一種；報(bào)道發(fā)現(xiàn)Streptomyces屬除產(chǎn)生多種抗生素外，還能產(chǎn)生纖維素酶類物質(zhì)[13]，在原始森林土壤中也發(fā)現(xiàn)大量Streptomyces屬放線菌，提示在腐殖質(zhì)豐富的基質(zhì)中放線菌也擁有潛在的作用。13X03菌株與Enterobacter屬最為接近，Enterobacter屬與Klebsiella屬有較近的親緣關(guān)系，Raoultella屬是Klebsiella屬的分支；Enterobacter屬對(duì)纖維素半纖維素類物質(zhì)的降解作用相關(guān)研究早有報(bào)道[14-15]，Manfredi 等[16]在昆蟲腸道中分離出45株具有較強(qiáng)降解能力的菌株，發(fā)現(xiàn)Enterobacter屬是降解菌中比較大的一個(gè)類群。且Enterobacter屬已被應(yīng)用于構(gòu)建纖維素發(fā)酵菌系[17]的相關(guān)研究中。

圖5 降解纖維素真菌系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.5 Phylogenetic tree of lignocellulolyticfungus

真菌鑒定結(jié)果見圖5，由圖5可以看出7z02與Ascomycete屬、Nectria屬較為接近，Ascomycete屬具有分泌纖維素酶的能力[18-19]，是纖維素降解菌系的主要類群之一，Nectria屬不僅能分泌纖維素酶類，還能利用氨基酸進(jìn)行代謝[20]。8z02經(jīng)鑒定建樹發(fā)現(xiàn)其與Aspergillus屬最接近，親緣關(guān)系達(dá)到99%以上；曲霉對(duì)纖維素降解的研究是近年來的研究熱點(diǎn)[21-22]，其中利用曲霉[23]降解纖維素的機(jī)制和提高降解效率研究是當(dāng)今重點(diǎn)問題。本研究中篩選出的8z02菌株降解效率較強(qiáng)，同時(shí)能長(zhǎng)時(shí)間維持較高的纖維素酶活性，有一定的開發(fā)利用價(jià)值。18z02菌株與Trichosporon屬親緣關(guān)系達(dá)99%以上，Trichosporon屬報(bào)道發(fā)現(xiàn)其與其他細(xì)菌、真菌組成降解菌系聯(lián)合降解纖維素類物質(zhì)[24]，并能富集蛋白。

2.4 降解細(xì)菌固態(tài)發(fā)酵中藥廢棄物的效果

利用分離出的有纖維素降解能力的微生物，不同細(xì)菌、真菌單獨(dú)添加10%(體積分?jǐn)?shù))后對(duì)中藥藥渣發(fā)酵腐熟的效果不同。細(xì)菌對(duì)中藥廢棄物發(fā)酵過程中溫度、pH的變化見圖6?？梢钥吹桨l(fā)酵的4 d，相比中藥廢棄物在自然腐熟(CK組)，接入降解功能菌株的堆體均有不同程度的升溫，其中1#和13X03菌株達(dá)到48 ℃，pH也下降至6.3。但4 d后堆體溫度均開始下降，同時(shí)pH變化波動(dòng)較小，說明細(xì)菌對(duì)中藥廢棄物腐熟過程作用較小，在前期首先利用中藥廢棄物中速效C、N源快速生長(zhǎng)。

圖6 細(xì)菌固相發(fā)酵中藥廢棄物溫度和pH變化Fig.6 Temperature and pH changes of bacterial Chinese medicinal herbal residuessolid fermentation

圖7 真菌固相發(fā)酵中藥廢棄物溫度和pH變化Fig.7 Temperature and pH changes of fungal Chinese medicinal herbal residuessolid fermentation

利用真菌分泌的纖維素酶系和自身菌絲體的延伸作用，真菌對(duì)纖維素類物質(zhì)降解效果要遠(yuǎn)大于細(xì)菌。從圖7可見，不同菌株對(duì)于固態(tài)發(fā)酵纖維素類含量較多的中藥廢棄物效果是不同的。中藥廢棄物在自然腐熟的狀態(tài)下(CK組)，溫度緩慢上升，7～10d達(dá)到最高溫度28 ℃，之后自然下降至22 ℃。相對(duì)于CK組，8z02的曲霉屬菌株在發(fā)酵4 d時(shí)堆體溫度可達(dá)到52 ℃，是篩選到的纖維素降解菌株中最高的，之后緩慢下降，16 d時(shí)仍保持堆體溫度達(dá)32 ℃，同時(shí)pH緩慢上升至6.8，與發(fā)酵過程氧氣消耗較快，堆體進(jìn)入氨化過程有關(guān)。7z02菌株發(fā)酵后期10 d時(shí)溫度達(dá)到47 ℃，發(fā)酵腐熟后期16 d仍保持38 ℃。18z02菌株雖發(fā)酵溫度上升較慢發(fā)酵最高溫度較低，但在發(fā)酵中后期其他堆體溫度下降的情況下仍能上升至42 ℃。pH在發(fā)酵過程中均有不同程度的上升，這與堆體未進(jìn)行翻堆，堆體內(nèi)部缺氧造成的氨化作用有關(guān)，應(yīng)在腐熟過程中進(jìn)行翻堆作業(yè)并保持通風(fēng)。固相發(fā)酵過程中堆體溫度和pH是發(fā)酵腐熟的關(guān)鍵，本研究發(fā)現(xiàn)不同菌株對(duì)堆體發(fā)酵溫度的作用各有差異，提示可利用其建立發(fā)酵菌系，提高腐熟效率。

堆體溫度在一定程度上可以反映出微生物菌劑對(duì)堆肥進(jìn)程的影響，隨著時(shí)間的增加，有機(jī)物漸漸降解，微生物數(shù)量下降，代謝活動(dòng)減弱，堆體溫度也逐漸達(dá)到室溫，堆肥進(jìn)入腐熟階段。pH是堆肥中微生物生長(zhǎng)的關(guān)鍵影響因素之一。在整個(gè)堆肥進(jìn)程中，堆料的pH值增加，可能表示堆料中有機(jī)物易降解蛋白含量較大，被微生物利用分解為堿性氨氣，導(dǎo)致氨氣大量釋放所致；堆料的pH值下降，可能表示堆料中有大量有機(jī)質(zhì)的分解產(chǎn)生有機(jī)酸，有機(jī)酸的大量積累導(dǎo)致堆料pH值逐漸降低。

3 討 論

目前我國(guó)中藥材年產(chǎn)量約7 500萬t[9]，而生產(chǎn)加工過程中產(chǎn)生的中藥固體廢棄物近50%～70%[7]。通過微生物的發(fā)酵作用，轉(zhuǎn)化中藥廢棄物是實(shí)現(xiàn)中藥廢棄物高值化利用的有力手段；基于生物發(fā)酵技術(shù)的中藥廢棄物開發(fā)，是解決中藥廢棄物造成的生態(tài)環(huán)境問題和中藥資源開發(fā)合理化應(yīng)用的新方式。但由于微生物發(fā)酵過程中對(duì)菌株或菌群的篩選、中藥廢棄物來源多樣性和發(fā)酵工藝的穩(wěn)定性、安全性等問題，仍需要更深層次的探索。本研究篩選到8株對(duì)木質(zhì)纖維素類物質(zhì)有明顯降解效果的菌株，經(jīng)鑒定分別為在木質(zhì)纖維素降解中能單獨(dú)或配合發(fā)揮較強(qiáng)作用的菌株，在單獨(dú)固相發(fā)酵中藥廢棄物過程中發(fā)揮了顯著作用，對(duì)發(fā)酵過程中堆體溫度和pH等參數(shù)提高明顯，對(duì)加速中藥廢棄物轉(zhuǎn)化腐熟起到關(guān)鍵作用。同時(shí)發(fā)現(xiàn)不同的微生物對(duì)堆體腐熟效果也有區(qū)別，在后續(xù)的研究中應(yīng)利用其各自優(yōu)勢(shì)形成降解細(xì)菌-真菌的微生態(tài)菌系，增強(qiáng)降解效應(yīng)。