抑制銅綠假單胞菌生長的噬菌體K4基因的篩選

周 維，孫 利，尤甲甲，楊洪江

(工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點實驗室，天津市工業(yè)微生物重點實驗室，天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津 300457)

抗生素的廣泛使用導(dǎo)致細菌耐藥性菌株不斷出現(xiàn)．噬菌體作為一種新型殺菌劑，越來越引起人們的關(guān)注，不斷有研究報道利用噬菌體治療各種病原菌導(dǎo)致的疾病[1–4]．噬菌體通過編碼裂解酶等因子，攻擊宿主菌的細胞外部結(jié)構(gòu)，破壞宿主菌的胞壁質(zhì)，裂解宿主菌，導(dǎo)致宿主菌死亡[5]．同時，噬菌體基因組攜帶多種基因，其編碼蛋白能夠控制細菌的多種代謝途徑，達到抑制宿主菌生長或殺死宿主菌的目的．Datta等[6]研究了λ噬菌體非致死基因?qū)Υ竽c桿菌(E．coli)生長的抑制作用，發(fā)現(xiàn)λ噬菌體N-cIts突變株中存在3種毒性因子對其宿主大腸桿菌生長有抑制作用．首先，其編碼的O蛋白和P蛋白能夠使溶源化細菌在42,℃時被殺死．其次，λ噬菌體基因組中kil編碼的Kil蛋白可能破壞細胞膜的外部結(jié)構(gòu)，并與其他抑制組分共同作用，從而抑制宿主菌的生長．最后，λ噬菌體的 cII基因產(chǎn)物能夠抑制宿主菌染色體DNA的復(fù)制，從而抑制宿主菌的生長[7]．枯草芽胞桿菌(Bacillus subtilis)噬菌體 SPO1基因組中，基因 gp44、gp50和 gp51是中期轉(zhuǎn)錄表達的基因，在未感染的枯草芽胞桿菌或大腸桿菌中表達時，其基因產(chǎn)物能夠抑制細菌RNA的合成，從而導(dǎo)致宿主菌細胞的死亡[8]．

噬菌體在長期進化過程中，其基因組具有極大的遺傳多樣性，能夠編碼多種特定蛋白質(zhì)，具有阻止宿主菌細胞重要代謝過程的功能．一些噬菌體多肽識別宿主菌 DNA復(fù)制和翻譯機制的重要組成部分，從而阻止相應(yīng)代謝途徑的進行，導(dǎo)致細胞生長的停滯或死亡．Liu等[9]首先篩選具有抑制宿主菌生長的噬菌體基因，通過高通量技術(shù)在化合物文庫中篩選潛在的抗菌素分子，以期獲得具有殺菌活性的新型抗菌素．由于噬菌體是地球上種類與數(shù)量最多的生物，具有豐富的遺傳多樣性，該種篩選抗菌素的策略預(yù)計能夠成為獲得新型抗菌素的重要途徑．

本研究分別克隆銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)噬菌體 K4攜帶的全部 75個基因，在阿拉伯糖啟動子控制下進行表達，觀察其表達產(chǎn)物是否能夠抑制宿主菌的生長．同時，利用脈沖場凝膠電泳分析宿主菌染色體 DNA的完整性，分析噬菌體基因表達產(chǎn)物抑制宿主菌生長的可能機制．本研究結(jié)果將有助于發(fā)現(xiàn)篩選新型抗菌素的新靶位．

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與質(zhì)粒

大腸桿菌(E．coli)DH5α(hsdR recA lacZYΦ80 lacZΔM15)、銅綠假單胞菌[10](Pseudomonas aeruginosa)PAK(實驗室菌株血清 O6型)、質(zhì)粒pRKaraRed[11](攜帶基因 araC及 PBAD啟動子)均由本實驗室保存．

1.1.2 培養(yǎng)基、抗生素與酶

LB 培養(yǎng)基(g/L)：蛋白胨 10，酵母粉 5，氯化鈉10，pH 7.0～7.2．用于細菌常規(guī)培養(yǎng)．

抗生素：氨芐青霉素 100,μg/mL、四環(huán)素6,μg/mL．

限制性內(nèi)切酶 BamHⅠ和 SnaBⅠ，TaKaRa公司；阿拉伯糖，北京博特普科學(xué)技術(shù)有限公司．

1.1.3 儀器

PCR基因擴增儀、脈沖場凝膠電泳儀，美國Bio-Rad公司；全自動凝膠成像儀，北京原平皓生物技術(shù)有限公司．

1.2 構(gòu)建表達載體質(zhì)粒及噬菌體K4基因克隆

實驗所用的質(zhì)粒為 pRKaraRed，利用 BamHⅠ將3個 lambda-Red系統(tǒng)基因(exo、bet、gam)切除，自連得到質(zhì)粒pZW1501，如圖1所示[11]．

圖1 質(zhì)粒pZW1501構(gòu)建及噬菌體K4基因克隆示意圖Fig. 1 Construction of plasmid pZW1501 for cloning phage genes

根據(jù)已測定的噬菌體 K4基因組序列進行分析， 發(fā)現(xiàn) K4基因組有 75個基因．利用 Primer Premier 5.0軟件進行引物設(shè)計，以噬菌體K4基因組DNA為模板進行擴增．PCR產(chǎn)物用限制性內(nèi)切酶 SnaBⅠ和BamHⅠ酶切，與經(jīng)相同酶切的載體質(zhì)粒連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到 DH5α感受態(tài)細胞，在含四環(huán)素 6,μg/mL的 LB培養(yǎng)基上篩選轉(zhuǎn)化子，提取質(zhì)粒并進行酶切驗證(圖 1)．

1.3 篩選影響宿主菌生長的基因

將重組質(zhì)粒電擊轉(zhuǎn)化進入銅綠假單胞菌PAK菌株中，轉(zhuǎn)化子在含有6,μg/mL 四環(huán)素的LB培養(yǎng)基中37,℃振蕩培養(yǎng)．將過夜培養(yǎng)的菌液轉(zhuǎn)接至含有6,μg/mL四環(huán)素的新鮮 LB培養(yǎng)基中，實驗組加 2%,的阿拉伯糖，對照組不加阿拉伯糖．37,℃振蕩培養(yǎng)5,h，測定 600,nm 下的吸光度．實驗重復(fù) 3次，按照式(1)計算相對菌體濃度．

1.4 涂板計數(shù)法確認噬菌體基因的抑制作用

按上述方法培養(yǎng)攜帶重組質(zhì)粒的 PAK菌株，轉(zhuǎn)接至新鮮的含有 6,μg/mL 四環(huán)素的 LB培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)至 A600＝0.6．重新轉(zhuǎn)接至含有四環(huán)素終質(zhì)量濃度為 6,μg/mL的 LB培養(yǎng)基中，實驗組加入 2%,阿拉伯糖，對照組不加阿拉伯糖．繼續(xù)培養(yǎng)，分別在 0、1、2、3、4、5、6、7、8,h 取樣，用 0.9%,的生理鹽水進行稀釋，然后涂布平板，實驗重復(fù)3次．

1.5 生物信息學(xué)分析

利用 DNA Master 軟件和 SMART 蛋白結(jié)構(gòu)域預(yù)測軟件，在 NCBI核酸數(shù)據(jù)庫進行比對分析，預(yù)測噬菌體 K4 基因編碼蛋白的功能．

1.6 脈沖場凝膠電泳分析宿主菌染色體DNA

37,℃過夜培養(yǎng)攜帶重組質(zhì)粒的菌株，轉(zhuǎn)接至新鮮的 LB培養(yǎng)基中，繼續(xù)培養(yǎng)至 A600＝0.6，重新轉(zhuǎn)接至新鮮含有6,μg/mL四環(huán)素的LB培養(yǎng)基中，實驗組加入 2%,的阿拉伯糖，對照組不加阿拉伯糖，37,℃振蕩培養(yǎng) 5,h．收集 2,mL菌液，5,000,r/min離心 5,min棄上清液，細胞加入含 0.5%, SDS裂解液，澄清后加入 50,μg/mL 蛋白酶 K，60,℃過夜，過夜的混合物與指示劑溴酚藍混合．將梳子放入膠槽，倒入熔化的低熔點瓊脂糖，制成膠塊．待膠塊凝固后用移液槍將樣品點入膠塊中．以 0.5×TBE為電泳緩沖液，在14,℃、120°、6,V/cm 線性條件下電泳．

1.7 噬菌體敏感性檢測

敏感性實驗采用雙層點滴法進行[12]，將攜帶噬菌體基因的菌株作為指示菌，實驗組培養(yǎng)基中含有2%,阿拉伯糖，對照組培養(yǎng)基中不含阿拉伯糖．將 K4裂解液稀釋 100倍，取 1,μL點板，干燥后，倒置培養(yǎng)，每小時觀察1次．

2 結(jié)果與分析

2.1 噬菌體K4基因組特征

銅綠假單胞菌噬菌體 K4基因組較小，全長為50,284,bp，包含75個基因．通過生物信息學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)噬菌體 K4編碼的大多數(shù)蛋白為功能未知的假定蛋白，只有少數(shù)基因產(chǎn)物具有已知功能．其中，基因gp49編碼假定的5′-3′核酸外切酶，基因gp72編碼末端酶大亞基，基因gp73編碼門蛋白，基因gp74編碼尾絲蛋白．

2.2 噬菌體K4基因?qū)λ拗骶L的影響

噬菌體基因組可能攜帶某些特定基因，其編碼產(chǎn)物通過不同作用機制，控制宿主細胞的特定代謝途徑，進而抑制細菌生長或殺死細菌．為了分析噬菌體K4基因是否具有類似功能，擴增并克隆了75個噬菌體基因，按照篩選影響宿主菌生長的基因的方法，分析基因的功能，結(jié)果如圖2所示．

圖2 噬菌體K4基因?qū)λ拗骶鶳AK生長的影響Fig. 2 Effects of phage K4 genes on the growth of the host strain PAK

實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，噬菌體K4的75個基因中，有6個基因在阿拉伯糖的誘導(dǎo)下，能夠編碼某種蛋白抑制其宿主菌銅綠假單胞菌 PAK菌株的生長，它們分別是 gp17、gp29、gp41、gp49、gp67、gp72．

2.3 攜帶抑制基因的宿主菌生長時間曲線

為驗證噬菌體 K4基因功能，進行平板計數(shù)實驗．將菌株 PAK/pZW1501分別在含有 2%,阿拉伯糖和不含阿拉伯糖的LB培養(yǎng)基上培養(yǎng)，實驗結(jié)果如圖3所示，阿拉伯糖不影響菌株 PAK/pZW1501的生長．?dāng)y帶抑制基因的菌株生長時間曲線如圖4所示．

圖3 菌株P(guān)AK/pZW1501生長時間曲線Fig. 3 Growth curve of strains PAK/pZW1501

圖4 攜帶抑制基因的菌株生長時間曲線Fig. 4 Growth curve of strains carrying the identified phage K4 genes with the inhibition function

有4個基因編碼的蛋白，能夠明顯地抑制宿主菌的生長，它們分別是 gp17、gp41、gp49和 gp72．圖4(a)中g(shù)p17的表達產(chǎn)物從3,h開始抑制宿主菌的生長；圖4(b)中g(shù)p29的表達的產(chǎn)物對宿主菌同樣有抑制作用，但抑制作用較弱；圖 4(c)中基因 gp41在阿拉伯糖誘導(dǎo)條件下，表達的產(chǎn)物在3,h后對宿主細胞的生長產(chǎn)生抑制作用；圖4(d)中g(shù)p49編碼的蛋白積累到 5,h后才對宿主菌有抑制作用；圖 4(e)中 gp67編碼的蛋白積累到一定量后導(dǎo)致宿主菌死亡；圖 4(f)中g(shù)p72編碼的蛋白從3,h開始抑制宿主菌的生長．

2.4 宿主菌生長相關(guān)基因的生物信息學(xué)分析

從上述實驗可知，銅綠假單胞菌噬菌體 K4中有6個基因能對其宿主菌的生長有影響，對這些基因進行生物信息學(xué)分析，結(jié)果見表1．

表1 噬菌體基因的生物信息學(xué)分析Tab. 1 Bioinformatic analysis of phage gene

蛋白 Gp49具有 helix-hairpin-helix結(jié)構(gòu)，含有helix-hairpin-helix結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)具有原核生物 DNA聚合酶 5′核酸外切酶區(qū)域[13]，及真核和原核 RAD2家族 5′-3′核酸外切酶活性，如 T4[14]的前體及一些病毒核酸外切酶．蛋白 Gp72中具有 ATP酶活性中心．蛋白Gp72的ATP酶活性中心與噬菌體T3末端包裝酶大亞基的 ATP酶活性中心同源性為 28%,，蛋白Gp72 核酸內(nèi)切酶活性中心與噬菌體T3末端包裝酶大亞基核酸內(nèi)切酶活性中心同源性為34%,[15]．

2.5 脈沖場凝膠電泳分析宿主菌染色體DNA

為了研究噬菌體 K4基因抑制宿主菌生長的機制，在 2%,阿拉伯糖誘導(dǎo) 5,h后，提取宿主菌染色體DNA，利用脈沖場凝膠電泳分析宿主菌染色體 DNA的完整性，結(jié)果如圖5所示．

圖5 脈沖場凝膠電泳分析Fig. 5 Pulsed-field gel electrophoresis

蛋白 Gp17、Gp29、Gp41、Gp49和 Gp72能夠顯著降解宿主菌基因組 DNA，可能是造成宿主菌生長受到抑制的原因；蛋白 Gp67對宿主菌基因組 DNA沒有影響，其抑制細胞生長的機制不同于其他蛋白．

2.6 敏感性檢測結(jié)果

噬菌體 K4基因產(chǎn)物對宿主菌生長具有影響，這些基因產(chǎn)物是否對噬菌體 K4的感染過程也產(chǎn)生影響？按照噬菌體敏感性檢測方法所述，分析了在重組菌株中噬菌體 K4的敏感性變化，結(jié)果如圖 6所示．37,℃培養(yǎng) 5,h后，空白對照銅綠假單胞菌 PAK菌株及PAK/pZW1501菌株在添加2%,阿拉伯糖或不加的誘導(dǎo)條件下，雙層平板上均形成比較清晰噬菌斑．?dāng)y帶抑制作用基因的菌株在不加阿拉伯糖時，雙層平板上出現(xiàn)清晰噬菌斑，而在阿拉伯糖質(zhì)量分數(shù)為2%,時，出現(xiàn)的噬菌斑是模糊的．這 6個具有抑制宿主菌生長作用的基因中，通過功能預(yù)測基因 gp49和gp72編碼的蛋白質(zhì)具有已知功能的結(jié)構(gòu)域，而其余4個基因，編碼的均為假定蛋白，功能尚不清楚．這 6個基因表達的產(chǎn)物對宿主菌的生長均具有抑制作用，該6個基因可能通過抑制宿主菌的代謝過程，最終損傷了細胞的代謝活性即生理狀態(tài)，從而導(dǎo)致了噬菌體K4感染效率的降低，從而形成模糊的噬菌斑．

圖6 攜帶生長抑制基因菌株對噬菌體K4的敏感性分析Fig. 6 Spotting assay of strains carrying genes of phage K4

3 討 論

在篩選噬菌體 K4對宿主菌具有作用的基因時，發(fā)現(xiàn)噬菌體K4的gp72基因是噬菌體K4的末端酶大亞基，能夠抑制宿主菌生長．末端酶大亞基是由400～750個氨基酸組成，以單體的形式存在于溶液中，主要有1個核酸內(nèi)切酶活性中心與1個ATP酶活性中心，具有 ATP酶活性、核酸內(nèi)切酶活性和DNA解旋酶活性．末端酶大亞基具有ATP酶活性區(qū)域，這個區(qū)域水解 ATP釋放出能量[18–19]．根據(jù)Hegde等[20]研究發(fā)現(xiàn)，噬菌體 T4的末端酶大亞基與門蛋白特殊結(jié)合的相互作用是噬菌體 T4組裝 DNA過程中很重要的一步．

另外也發(fā)現(xiàn)，噬菌體 K4的 gp49基因能夠抑制宿主菌的生長，利用DNA master軟件和SMART蛋白結(jié)構(gòu)域預(yù)測軟件，在NCBI核酸數(shù)據(jù)庫進行比對分析，預(yù)測 gp49編碼的蛋白是假定 5′-3′核酸外切酶．核酸外切酶是一類能從多核苷酸鏈的一端開始依次催化水解 3、5-磷酸二酯鍵、降解核苷酸的酶．核酸外切酶一般分為兩種形式，單鏈的核酸外切酶與雙鏈的核酸外切酶[21]．噬菌體核酸外切酶屬于雙鏈核酸外切酶，這種酶催化雙鏈 DNA分子從 5′-P末端進行逐步的水解釋放出 5′-單核苷酸，但不能降解5′-OH末端[22]．在DNA的復(fù)制過程中用到的相關(guān)酶及輔助因子有：DnaA、DnaB、DnaC、單鏈 DNA 結(jié)合蛋白(SSB)、RNA 聚合酶、DNA 解旋酶(拓撲異構(gòu)酶Ⅱ)等；RAN 聚合酶Ⅰ具有 5′-3′核酸外切酶活性，這對 DNA復(fù)制的忠實性(只作用于雙鏈 DNA堿基配對部分，從 5′末端水解下核苷酸或寡核苷酸)極為重要，如果沒有這種活性，DNA復(fù)制的錯誤將會大大增加[23]．蛋白Gp49是否具有5′-3′核酸外切酶活性還有待進一步研究．

根據(jù) Sampath等[24]的研究結(jié)果表明，枯草芽胞桿菌噬菌體 SPO1在抑制宿主菌專一性生物合成中的作用有兩個，即抑制宿主菌基因的表達和抑制宿主菌DNA的合成．總RNA合成的減少，這樣可能直接增加dNTP的儲存量及在治療中引起在DNA合成速率中 dNTP不真實的降低．Datta等[6]的研究發(fā)現(xiàn)噬菌體λ的P蛋白影響其宿主菌大腸桿菌DnaA蛋白結(jié)合oriC DNA-鏈的功能．噬菌體λ,的P蛋白也影響大腸桿菌DnaA蛋白結(jié)合ATP的功能，DnaA蛋白是一種染色體復(fù)制發(fā)起蛋白，參與 DNA復(fù)制的起始，DnaA也是ATP結(jié)合蛋白[25]．

噬菌體感染細菌是一個復(fù)雜的過程，其感染效率制約于宿主菌細胞的生理狀態(tài)，隨著環(huán)境因素變化而不同[26]．本研究對噬菌體 K4基因進行研究，發(fā)現(xiàn)噬菌體 K4基因組攜帶著對宿主菌生長具有抑制的基因，編碼多種具有不同功能的蛋白，影響細胞的多種代謝途徑，最終損傷了細胞的代謝活性即生理狀態(tài)，從而導(dǎo)致了噬菌體 K4感染效率的降低，噬菌斑區(qū)域較對照模糊．

在本研究中，由脈沖場凝膠電泳分析結(jié)果可知，銅綠假單胞菌噬菌體 K4中 6個抑制宿主菌生長的基因的抑制機制分為兩種類型．第一種類型是gp17、gp29、gp41、gp49、gp72這 5個基因抑制宿主菌生長的機制是一致的，這5個基因可能編碼某種蛋白導(dǎo)致宿主菌染色體 DNA的顯著降解．第二種類型是gp67，該基因編碼的蛋白不能導(dǎo)致宿主菌染色體DNA的降解來抑制宿主菌的生長，而是應(yīng)用其他的抑制機制，比如抑制宿主菌的代謝途徑等，這需要進一步的探索與研究．

Molshanski-Mor等[27]運用高通量測序識別 T7噬菌體的特征抑制基因序列．這一結(jié)果驗證了通過識別噬菌體的基因來推斷新靶點抑菌素方法的可行性，這也為治療細菌感染提供了新的治療途徑．銅綠假單胞菌噬菌體K4的基因中大部分編碼的ORFs是假定蛋白，而到目前為止，對已經(jīng)完成測序的 600多種噬菌體基因組序列分析表明，很大一部分預(yù)測的ORFs與現(xiàn)有數(shù)據(jù)庫中的蛋白質(zhì)序列無相似性；即使是人們研究最多的T4噬菌體，也有超過一半的ORF功能沒有明確[28]．這說明目前人們對大部分噬菌體的相關(guān)蛋白及其功能機制的研究少之又少，也就是說，通過研究噬菌體與宿主相互作用機制的前景巨大，這也將為噬菌體治療、開發(fā)新的抗菌素及其應(yīng)用的研究提供一定的基礎(chǔ)．