諾沃霉素A預防番茄采后灰霉病效果及抑菌譜

黃大野，高 葦，賁海燕，方 偉，王開梅，曹春霞※，饒 犇，劉曉艷，萬中義，張亞妮，姚經(jīng)武，朱志剛

（1. 湖北省生物農(nóng)藥工程研究中心，武漢430064；2. 天津市農(nóng)科院植物保護研究所，天津 300381；3. 黑龍江省農(nóng)業(yè)科學院園藝分院，哈爾濱 150069）

0 引 言

由灰葡萄孢（Botrytis cinerea）引起的灰霉病是番茄的主要毀滅性病害，能侵染果實、花、葉、莖和種子[1-2]。防治該病害主要依靠單一作用位點的化學殺菌劑，如多菌靈、異菌脲、嘧菌環(huán)胺和啶酰菌胺等。但是，化學殺菌劑的使用極易造成灰霉病產(chǎn)生抗藥性，在中國和世界范圍內(nèi)，灰葡萄孢已經(jīng)對多種殺菌劑產(chǎn)生了抗藥性[3-8]。另外也會造成農(nóng)藥殘留及環(huán)境污染并威脅人類健康[9-10]。所以生產(chǎn)上急需更為安全有效的殺菌劑和防治方法。

與化學殺菌劑相比，生物制劑具有很多優(yōu)勢，利用多種作用機理來抑制病害的發(fā)生，如競爭位點和營養(yǎng)、重寄生作用、誘導抗性和產(chǎn)生次生抑菌物質(zhì)等[11-13]。鏈霉菌是一種被廣泛利用的生防菌，可以產(chǎn)生多種類型的天然產(chǎn)物，作為防治作物病害活性化合物。許多鏈霉菌產(chǎn)生的天然產(chǎn)物如多氧霉素、春雷霉素和井崗霉素等已經(jīng)得到廣泛的應用[14-16]鏈霉菌產(chǎn)生的。

諾沃霉素A和B是由湖北省生物農(nóng)藥工程研究中心分離和鑒定的2種全新結(jié)構(gòu)的32元環(huán)大環(huán)內(nèi)酯類化合物分子量 1 228.66。其產(chǎn)生菌為植生鏈霉菌（Streptomyces phytohabitans），菌種代號為 HBERC-20821， 保存在武漢大學中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為 CCTCC NO：M2013379。鏈霉菌分離自四川瓦屋山采集的土樣。前期研究了液體發(fā)酵制備諾沃霉素的方法和農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上大規(guī)模應用的簡單濃縮工藝[17-19]。大鼠急性經(jīng)口、經(jīng)皮和吸入試驗表明未造成明顯病理改變，毒性為微毒級[20]。通過瓊脂稀釋法測定了諾沃霉素A和B對幾種植物病原菌minimum inhibition concentration（最小抑制濃度），結(jié)果表明對禾谷鐮刀菌（Fusarium graminearum）和穎枯殼針孢（Septoria nodorum）等幾種植物病原真菌具有良好抑制效果。諾沃霉素A和B只在側(cè)鏈有一處細微區(qū)別，母核結(jié)構(gòu)相同。前期初步測定殺菌活性，發(fā)現(xiàn)殺菌活性無明顯差異，故只對A殺菌性能進行進一步研究[19]。本試驗選取諾沃霉素A進行對番茄果實灰霉病的防治效果研究，以期為諾沃霉素今后在防治番茄采后灰霉病的應用和推廣奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試菌株：灰葡萄孢（B. cinerea）為多菌靈敏感菌株，核盤菌（Sclerotinia sclerotiorum）、多主棒孢（Corynespora cassiicola）、茄鏈格孢（Alternaria solani）、膠孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides）、立枯絲核菌（Rhizoctonia solani）、茶褐斑擬盤多毛孢（Pestalotiopsis guepinii）、辣椒疫霉（Phytophthora capsici）和勞爾氏菌（Ralstonia solanacearum）均由湖北省生物農(nóng)藥工程研究中心分離和保存。

供試藥物：諾沃霉素 A原藥（有效成分質(zhì)量分數(shù)95%），制備方法參考文獻[17]。98%多菌靈原藥（安徽廣信農(nóng)化股份有限公司）。番茄為市場購買大番茄，品種為紅星二號。

1.2 諾沃霉素A對灰葡萄孢離體抑菌效果

將灰葡萄孢菌從保存斜面活化到potato dextrose ager（PDA）培養(yǎng)基20℃培養(yǎng)5 d備用。將諾沃霉素A原藥加入母液體積 1%N，N-二甲基甲酰胺（N,N-dimethylformamide）溶解，隨即加入無菌水配制成濃度為100μg/mL母液備用。多菌靈母液的配制方法和濃度同諾沃霉素 A。采用菌絲生長速率法，使用梯度稀釋將諾沃霉素 A 稀釋至25、12.5、6.25、3.125 和1.562 5μg/mL。多菌靈稀釋至10.0、5.0、2.5、1.0和0.5μg/mL。待培養(yǎng)基溫度降為45 ℃時，用滅菌槍頭吸取1 mL藥液，隨后加入9 mLPDA培養(yǎng)基混勻，即藥液稀釋10倍，每個梯度濃度3次重復，以加入含1%DMF無菌水作為對照。隨后用4 mm直徑打孔器打取PDA平板培養(yǎng)的灰葡萄孢，接入各處理PDA平板中央。20℃黑暗培養(yǎng)5 d，用十字交叉法測量每個培養(yǎng)皿內(nèi)菌落直徑，用DPS軟件求出諾沃霉素A和多菌靈對灰葡萄孢菌絲生長的毒力回歸方程、相關(guān)系數(shù)r和抑制中濃度EC50（50% effective concentration）。

分別挑取少許含1.25μg/mL諾沃霉素A平板和對照菌絲于載玻片，在40倍光學顯微鏡（OLYMPUS CX21,Tokyo，Japan）觀察處理和對照菌絲形態(tài)。

1.3 諾沃霉素A防治番茄果實灰霉病研究

將灰葡萄孢菌在PDA平板25℃培養(yǎng)14 d，用無菌水刷取孢子懸浮液，將其混入 0.05%的吐溫 80，隨后用紗布過濾，使用血球計數(shù)板將孢子濃度調(diào)到 5×104個孢子/mL。從市場購買大小一致，外皮沒有破損的番茄。

用帶1 mL無菌槍頭分子槍在番茄中部相對應的兩側(cè)打孔，將諾沃霉素 A 稀釋至 50 和 100μg/mL，浸果10 min，對照藥劑使用有效成分25和12.5μg/mL多菌靈浸果10 min，空白對照使用無菌水浸果10 min。取出風干后滴入10μL灰霉孢子懸浮液，25℃保濕培養(yǎng)6 d[21-26]，試驗設(shè)3個重復，每個重復10個番茄果實。統(tǒng)計方法和防效計算同上。

1.4 諾沃霉素A抑菌譜測定

按照1.2制備100μg/mL諾沃霉素A，采用菌絲生長速率法觀察10μg/mL含藥PDA培養(yǎng)基條件下對7種常見植物病原菌抑制效果，以加入質(zhì)量分數(shù) 1%DMF無菌水作為對照。防效計算方法同上。勞爾氏菌在nutrient ager（NA）平板活化，挑取單菌落轉(zhuǎn)入 SPA培養(yǎng)基，于170 r/min轉(zhuǎn)速、30℃培養(yǎng) 24 h 后，將菌液均稀釋至108cfu/mL，將0.5 mL菌液與45℃ 9.5 mL NA固體培養(yǎng)基混合制成含菌平板。隨后放入滅菌濾紙片，滴入10μL諾沃霉素A藥液，對照藥劑為平板濃度10μg/mL氨芐青霉素鈉，3 d后觀察抑菌圈。

1.5 數(shù)據(jù)分析

使用DPS進行毒力回歸方程計算，SAS9.1.3進行差異顯著性分析，在0.05水平下進行單因素差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 諾沃霉素A對灰葡萄孢離體抑菌效果

表1為諾沃霉素A與多靈菌抑菌活性對比，諾沃霉素A對灰葡萄孢具有良好的抑菌活性，離體條件下在2.5、1.25、0.625、0.312 5和0.156 25μg/mL 5個梯度濃度均有一定的抑菌效果，經(jīng)計算EC50為0.631μg/mL，相關(guān)系數(shù)r為0.999 7，說明試驗濃度梯度設(shè)置合理。生產(chǎn)上防治灰霉病常用殺菌劑多菌靈EC50為0.157μg/mL，諾沃霉素A殺菌活性略低于多菌靈。與對照菌絲相比，經(jīng)1.25μg/mL諾沃霉素A處理5 d后灰葡萄孢菌絲發(fā)生明顯的膨脹、扭曲和變形（圖 1），菌絲微觀形態(tài)的影響可能是抑制灰霉病生長的一個重要因素。

表1 諾沃霉素A對灰葡萄孢抑菌活性Table 1 Inhibition activity of novonestmycin A on Botrytis cinerea

圖1 顯微鏡條件下諾沃霉素A對菌絲生長影響Fig.1 Optical micrographs of the inhibition of fungal growth by novonestmycin A

2.2 諾沃霉素A預防番茄果實灰霉病效果

表 2為諾沃霉素 A、多靈菌及對照組對番茄灰霉病預防效果對比，離體組織試驗表明，諾沃霉素 A對番茄果實灰霉病具有良好的防治效果。諾沃霉素 A在 50和100μg/mL浸果處理對番茄果實灰霉病防效分別達到68.29%和100%。多菌靈在12.5和25μg/mL浸果處理對番茄果實灰霉病防效分別為69.51%和100%。在處理濃度下諾沃霉素A和多菌靈對番茄果實灰霉病預防效果相當（P<0.05）。試驗過程中在50和100μg/mL浸果處理條件下均未發(fā)現(xiàn)諾沃霉素對番茄果實表觀造成藥害，試驗濃度下對番茄果表觀形態(tài)安全（見圖2）。100μg/mL及更高濃度可以作為實際應用中諾沃霉素A的浸果濃度，更高濃度諾沃霉素A對番茄果實安全性及最佳浸果時間需要進一步研究。

表2 諾沃霉素A對番茄灰霉病預防效果Table 2 Prevention of novonestmycin A on tomato gray mold

圖2 諾沃霉素A對番茄果實灰霉預防效果Fig.2 Prevention effect of novonestmycin A on tomato fruit gray mold

2.3 諾沃霉素A抑菌譜

抑菌譜試驗結(jié)果見表3，試驗表明，諾沃霉素 A在10μg/mL條件下對子囊菌核盤菌S.sclerotiorum抑菌率為86.11%、對半知菌多主棒孢C.cassiicola、茄鏈格孢A.solani、膠孢炭疽菌C.gloeosporioides、茶褐斑擬盤多毛孢P.guepinii和擔子菌立枯絲核菌R.solani抑菌效果分別為91.11%、82.78%、77.22%、86.46%和85.56%，抑菌率均達到75%以上。對卵菌綱辣椒疫霉P.capsici無抑菌作用。在細菌抑菌試驗中，抑菌圈法表明諾沃霉素A在10μg/mL處理條件下對勞爾氏菌R.solanacearum無抑菌圈，而對照殺細菌藥劑氨芐青霉素鈉在相同濃度下具有明顯抑菌圈（圖 3），即諾沃霉素 A對細菌勞爾氏菌R.solanacearum無抑菌效果。諾沃霉素A在防治半知菌引起的作物病害表現(xiàn)出一定的防治潛力，對由上述病原菌引起的病害的田間防效、應用技術(shù)及對應作物的安全性需要進一步評價。

表3 諾沃霉素A對植物病原菌離體抑菌效果Table 3 In vitro inhibition of plant pathogens with novonestmycin A

圖3 諾沃霉素對勞爾氏菌抑菌活性Fig.3 Inhibition activity of novonestmycin A on Ralstonia solanacearum

3 討 論

研究表明諾沃霉素A對番茄果實灰霉病具有良好的預防效果，對其作用機理和與其他灰霉病防治藥劑的交互抗藥性值得進一步研究，為灰霉病抗性菌株的治理和殺菌劑交替和混合使用奠定基礎(chǔ)。

諾沃霉素A對常見植物病原真菌核盤菌、膠孢炭疽和立枯絲核菌等具有良好抑制效果，其離體抑菌活性均為首次報道。其對卵菌綱疫霉菌無效，不能用于其引起的作物疫病的防治。對細菌勞爾氏菌無效，不能用于其引起的作物細菌青枯病防治。本研究共研究 9種病原菌抑菌活性，還需對其抑菌譜進行更深入的研究。在試驗濃度下，對番茄表皮未造成影響，高濃度下對番茄的安全性需要進一步研究。

最近的研究表明大環(huán)內(nèi)酯類化合物抑菌機理為直接與真菌細胞膜麥角甾醇結(jié)合從而抑制真菌生長[27-29]。麥角甾醇是子囊菌、擔子菌和半知菌等大多數(shù)真菌細胞膜重要組成部分，卵菌綱病害和細菌不含有麥角甾醇[30]。諾沃霉素A對卵菌綱辣椒疫霉菌P. capsici和細菌勞爾氏菌R.solanacearum無效，而對其他隸屬于囊菌、半知菌和擔子菌 6種真菌具有明顯的抑菌效果。通過其化學結(jié)構(gòu)類型和抑菌譜研究表明麥角甾醇可能為諾沃霉素A抑制真菌的作用靶標，藥劑對真菌麥角甾醇合成影響需要進一步驗證。

大環(huán)內(nèi)脂類抗生素納他霉素通過作用于麥角甾醇而對大多數(shù)真菌和酵母菌具有抑制和殺滅活性，其具有不易產(chǎn)生抗藥性，無致癌、致畸形、致突變和過敏性等優(yōu)點，被廣泛應用于食品防腐和水果保鮮[31]。同為大環(huán)內(nèi)酯諾沃霉素在食品防腐和其他水果保鮮，例如柑橘青霉病的應用值得進一步研究。

4 結(jié) 論

本研究通過離體抑菌、果實預防和抑菌譜試驗，研究結(jié)果如下：

1）諾沃霉素A對灰葡萄孢具有良好的抑菌效果，離體抑制中濃度為0.631μg/mL。

2）經(jīng)1.25μg/mL 諾沃霉素A處理的菌絲發(fā)生明顯的腫脹和變形。經(jīng)50和100μg/mL諾沃霉素A浸果處理對番茄果實灰霉病防效分別為68.29%和100%。對番茄安全無藥害，在防治番茄果實灰霉病具有良好的應用前景。

3）諾沃霉素A對核盤菌、膠孢炭疽和立枯絲核菌等常見植物病原真菌具有抑菌效果，對卵菌綱辣椒疫霉P.capsici和細菌勞爾氏菌R.solanacearum無效。

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