鼠李糖乳桿菌對一次性大強度運動小鼠肝損傷的保護作用

郝慧禎，曹建民，曹 卉，艾 坤，徐 鵬

（1.內(nèi)蒙古師范大學體育學院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010022；2.北京體育大學，北京 100084）

超負荷的運動會引起一系列的不良身體反應，其中包括腸道應激綜合征和急性肝損傷。一次性大強度運動作為一種生理應激還會引起肝細胞血流的改變，從而導致不同程度的肝細胞缺氧，致使肝組織損傷。有大量研究證明，通過益生菌代謝產(chǎn)生的短鏈脂肪酸可以為腸道細胞提供營養(yǎng)，改善腸粘膜的通透性，從而改善腸道功能，降低細菌異位程度。由于肝腸軸的存在，腸道功能紊亂會致使肝臟功能受到影響。因此，補充益生菌來達到維持腸道功能正常的目的對保護肝臟有積極且重要的影響。本文擬通過一次性大強度游泳運動作為應激刺激，在不同時間點取材，測試實驗組（益生菌組）和對照組（蒸餾水組）小鼠在游泳運動后不同時間點的血液中丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（Alanine Transaminase，ALT）、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（Aspartate Aminotransferase，AST）和肝臟組織中腫瘤壞死因子（Tumor Necrosis Factor-α，TNF-α）一氧化氮（Nitric Oxide，NO）和一氧化氮合酶（Nitric Oxide Synthase，iNOS）的濃度，觀察補充鼠李糖乳桿菌是否有加速上述指標恢復的效果。在競技體育和大眾健身中，為補充益生菌緩解運動性疲勞和免疫力下降等情況提供理論參考依據(jù)。

1 研究對象與方法

1.1 研究對象

鼠李糖乳桿菌對一次性大強度運動小鼠肝損傷的保護作用。

1.2 運動模型

實驗對象為SPF級雄性BALB/C 小鼠（鼠齡6～8 周，體重18～22g）48只，由北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供，動物生產(chǎn)合格證編號SCXK（京）2012—0001。小鼠隨機分為8組，每組8只，為蒸餾水安靜組（c1）、蒸餾水運動后3h組（c2）、蒸餾水運動后12h組（c3）、蒸餾水運動后24h組（c4）和益生菌安靜組（y1）、益生菌運動后3h組（y2）、益生菌運動后12h組（y3）和益生菌運動后24h組（y4）。實驗共19d，各組小鼠連續(xù)灌胃2周。采用鼠李糖乳桿菌（lactobacillus rhamnosus GG，LGG），用蒸餾水稀釋濃度為109CFU/ml，每只小鼠按5ml/kg體重灌胃。安靜組不進行任何訓練，其他組進行2次適應性游泳訓練，每隔2d進行1次，最后一次性負重6%進行游泳訓練，小鼠力竭判斷標準按Thomas 報道之文獻。然后按照實驗安排處死。采用100cm×50cm×60cm的泳槽作為小鼠游泳訓練裝置，水深50cm，水溫（31±2）℃。第1d：稱重，分組，編號，適應性飼養(yǎng)；第2～第4d：適應性飼養(yǎng)；第5～第18d：9：00—各組小鼠按5ml/kg體重灌胃。第12開始進行運動組2次適應性訓練，最后進行一次性負重6%游泳訓練，具體訓練取材安排，見表1。

1.3 實驗儀器與試劑

1.3.1 實驗儀器 分光光度計。

1.3.2 實驗試劑 （1）一氧化氮試劑盒；（2）一氧化氮合酶測定試劑盒；（3）丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶試劑；（4）天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶試劑盒；（5）小鼠腫瘤壞死因子α（TNF-α）酶聯(lián)免疫分析試劑盒。

1.4 標本制備

1.4.1 血清制備 小鼠乙醚麻醉，眼眶靜脈取血，離心取上層血清分裝，－80℃超低溫冰箱凍存。

1.4.2 組織取樣 各組小鼠根據(jù)實驗安排處死，取肝左側(cè)葉，保存于超低溫冰箱。取樣本0.2g，剪碎后按照1∶9的比例加入9%的生理鹽水，用電動勻漿機在冰水浴中進行勻漿。提取上層清液，即制備10%組織勻漿液。

表1 小鼠游泳訓練取材方案

表2 安靜組與運動組ALT、AST活性結(jié)果統(tǒng)計 U/L n=6+s

表2 安靜組與運動組ALT、AST活性結(jié)果統(tǒng)計 U/L n=6+s

注：a表示與c1相比有高度顯著性差異（P＜0.01），b表示與y1相比有高度顯著性差異（P＜0.01），c表示與c2相比有高度顯著性差異（P＜0.01），d表示與c3相比有高度顯著性差異（P＜0.01），e表示與c4相比有高度顯著性差異（P＜0.01）。

組別ALT AST 124±5.22 137±2.01a 111±3.02 121±1.70b 137±2.01 121±1.70c 96.4±2.38 82.5±5.55d 81.4±1.72 63.8±2.69e c1 c2 y1 y2 c2 y2 c3 y3 c4 y4 67.9±2.84 76.1±2.93a 52.0±3.05 64.7±2.55b 76.1±2.93 64.7±2.54c 52.9±4.07 42.2±3.68d 38.7±2.66 27.1±3.19e

表3 不同營養(yǎng)干預NO、iNOS、TNF-α結(jié)果統(tǒng)計+s

表3 不同營養(yǎng)干預NO、iNOS、TNF-α結(jié)果統(tǒng)計+s

注：a表示與y2相比高度顯著性差異（P＜0.01），b表示與c2相比有高度顯著性差異（P＜0.01），c表示與c4相比有顯著性差異（P＜0.05）。

組別NO （umol /gprot n=6）iNOS （U/mgprot n=6）TNF-α（ng/L n=6）c2 y2 c3 y3 c4 y4 5.99±0.256 6.07±0.362 5.20±0.369 5.39±0.299 6.83±0.908 6.29±0.475 3.11±0.175 2.75±0.157a 2.61±0.362 2.76±0.159 3.23±0.363 3.07±0.304 112±3.68 106±2.82b 95.5±4.73 87.5±7.33 100±3.54 91.1±5.53c

1.5 指標檢測

1.5.1 ALT測定 采用紫外—乳酸脫氫酶法。

1.5.2 ALT含量測定 采用紫外—蘋果酸脫氫酶法。

1.5.3 NO測定 采用硝酸還原酶法。

1.5.4 iNOS測定 肝組織勻漿內(nèi)iNOS的計算公式為：肝組織中iNOS活性（U/ml）=（總NOS測定管OD值－空白管OD值）/呈色物納摩爾消光系數(shù)?反應總體積/取樣量?1/（比色光鏡?反應時間）/蛋白含量（mgprol/L）=（總NOS測定管OD值－空白管OD值）/（38.3?10-6）?（2.41+a?）/a?x1/（1?15）/ 蛋白含量（mgprol/L）。

1.5.5 小鼠TNF-α酶聯(lián)免疫分析測定應用雙抗體夾心法測定標本中小鼠TNF-α水平。

1.6 統(tǒng)計學分析

使用SPSS 19.0對實驗結(jié)果進行統(tǒng)計分析。使用配對樣本t檢驗進行組內(nèi)比較，獨立樣本t檢驗進行組間比較，顯著性水平為P=0.05。所有數(shù)據(jù)用平均數(shù)±標準差（±s）表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 小鼠力竭情況

8組小鼠中運動組小鼠均完成了一次性大強度運動，整個過程中基本未出現(xiàn)拒絕游泳的現(xiàn)象。運動時間為63±3min。

2.2 血清生化指標的變化

ALT和AST活性的增高是肝膽疾病的表征之一。本文通過運動前后ALT和AST活性來判斷運動損傷建模是否成功，如運動后活性大于運動前活性，且有統(tǒng)計學意義，則說明建模成功。根據(jù)表c組與y組獨立樣本t檢驗統(tǒng)計的結(jié)果可以看出，運動后大于運動前，且有統(tǒng)計學意義，小鼠急性肝損傷模型建模成功。將運動蒸餾水組與運動益生菌組以時間點為基準對ALT和AST活性進行比較，益生菌組活性低于蒸餾水組。統(tǒng)計結(jié)果用平均值±標準差，如表2所示。將各時間組進行獨立樣本檢驗，其P值均小于0.05，具有統(tǒng)計學意義，認為營養(yǎng)干預對小鼠一次性力竭運動所造成的肝損傷可能有一定的保護作用。

2.3 肝組織生化指標的改變及討論

NO在體內(nèi)大量產(chǎn)生時會引起大量有毒代謝物的產(chǎn)生，致使肝臟損傷，是引起肝細胞凋亡的重要因素。故經(jīng)益生菌干預后小鼠組織內(nèi)NO含量能夠在一定程度上反映出益生菌在一次性大強度力竭運動中保護肝臟的作用。表3將運動蒸餾水組與運動益生菌組以時間點為基準進行NO活性進行比較，益生菌組小鼠組織中NO含量與蒸餾水組小鼠組織中NO含量無明顯差異。推測是由于取材后將樣品放入液氮保存進而轉(zhuǎn)存至超低溫冰箱，并未使用新鮮樣品直接進行測定，故以上因素可能會對實驗結(jié)果造成一定影響。NOS可以以左旋精氨為底物催化生成NO，所以iNOS的活性可以有效地反應肝臟內(nèi)NO的情況。將運動蒸餾水組與運動益生菌組以時間點為基準對iNOS活性進行比較，如表3。y2組小鼠iNOS活性低于c2組，經(jīng)獨立樣本檢驗其顯著性低于0.05，具有統(tǒng)計學意義。但運動后12h組與運動后24h組NOS活性并沒有顯著性差異，推測是由于取材后將樣品放入液氮保存進而轉(zhuǎn)存至超低溫冰箱，并未使用新鮮樣本直接進行測定，以上因素可能會對實驗結(jié)果造成一定影響。TNF-a是內(nèi)毒素所致的急性肝損傷中的炎癥反應的啟動因子。能激活級聯(lián)反應，引起肝臟損傷，如表3。將運動蒸餾水組與運動益生菌組以時間點為基準進行TNF-α含量進行比較，y2和y4組小鼠TNF-α含量均低于c2和c4組。經(jīng)獨立樣本檢驗P＜0.05，具有統(tǒng)計學意義。這證明益生菌能夠通過肝-腸軸作用到肝細胞內(nèi)，可能會對一次性大強度運動造成的肝損傷進行保護。

3 討 論

3.1 一次性力竭運動對小鼠肝臟的影響

在超負荷運動中，機體處于缺氧狀態(tài)；體內(nèi)血液分布發(fā)生改變，血液由內(nèi)臟器官大量流向肌肉組織，以上兩種因素共同作用，導致肝損傷的發(fā)生。

本次研究發(fā)現(xiàn)，一次性力竭運動可以導致小鼠肝臟損傷，其表現(xiàn)為血清中ALT、AST活性增高。通常，ALT在肝臟組織中活性最強，AST在心肌細胞和肝細胞中有較強的酶活性。當肝細胞受損，出現(xiàn)炎癥反應，肝細胞細胞膜完整性受到破壞甚至溶解，線粒體內(nèi)容物擴散至組織和血清中，引起血清中轉(zhuǎn)氨酶幅度大幅上升。

3.2 益生菌對一次性力竭運動引起的小鼠肝損傷的保護作用

本研究中針對小鼠進行了益生菌營養(yǎng)干預。結(jié)果顯示，補充益生菌的小鼠相較于蒸餾水組，血清中ALT和AST活性大幅下降，這證明肝細胞膜受到了一定的保護，在沒有補充益生菌的小鼠中，其細胞膜通透性大幅增加，致使小鼠血清中ALT、AST的活性有顯著性增高。而在補充益生菌的小鼠血清中，盡管其ALT、AST的活性也增高了，但是其增高顯著低于蒸餾水組，這說明益生菌的補充有益于保持肝細胞膜的完整性。

腸道黏膜屏障的完整性主要依靠腸上皮細胞維持，通過微絨毛等保證屏障結(jié)構(gòu)功能完整。TNF-α與肝損傷和腸粘膜損傷密切相關(guān)。當腸粘膜通透性增高時，腸道細菌代謝產(chǎn)生的毒素、細菌及一些大分子物質(zhì)可以穿過腸道屏障進入血液或者腹腔，引起肝臟內(nèi)環(huán)境的改變。TNF-α是一種具有多態(tài)性的細胞因子，與炎癥發(fā)生、細胞凋亡、新陳代謝等相關(guān)。而這些生物活性和其重要的調(diào)節(jié)功能，與急性肝損傷的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。在急性肝損傷過程中，TNF-α含量較低時，可以抑制細胞的凋亡，而濃度過高時，加重損傷的惡化。在組織處于氧化應激的狀態(tài)下，iNOS即誘生型NOS被激活，持續(xù)大量的NO被合成、釋放，具有顯著的肝細胞毒作用。在研究中，運動益生菌組小鼠組織中NO的結(jié)果與運動蒸餾水組沒有明顯差異，這可能是由于未使用新鮮樣本進行測試造成的。組織中iNOS在運動后3h，益生菌組要顯著低于蒸餾水組。由于NO不穩(wěn)定極易降解，樣本保存措施不當，以至出現(xiàn)上述結(jié)果。

4 結(jié) 論

一次性大強度運動后，小鼠血液中ALT，AST活性增高，證明小鼠發(fā)生急性肝損傷，小鼠血液中TNF-α含量增高，而益生菌營養(yǎng)干預可以使小鼠血液中TNF-α含量降低。推測益生菌通過改善腸粘膜通透性抑制細菌異位，減少了肝組織細胞內(nèi)環(huán)境的改變，從而達到保護肝臟的目的。