固相萃取高效液相色譜熒光法測定炒制堅果中苯并(a)芘殘留量

陶華平

(寧德市食品藥品檢驗檢測中心， 福建 寧德 352100)

當(dāng)前，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的致癌化學(xué)物質(zhì)約有400種，其中200多種屬于多環(huán)芳香烴類化合物。苯并芘(BaP)又稱3，4-苯并芘，是多環(huán)芳烴類化合物的一種，由苯與芘糅合而成。苯并芘致癌性強(qiáng)，且對檢測靈敏度高，故其被作為多環(huán)芳烴(Polycyclic aromatic hy-drocarbons，簡稱PAH)的指標(biāo)化合物[1]。依據(jù)苯與芘不同的糅合位置，可將苯并芘分為苯并(a)芘和苯并(e)芘兩種異構(gòu)體。

堅果營養(yǎng)豐富，富含蛋白質(zhì)、油脂、礦物質(zhì)、維生素等。但在炒制過程中，如果溫度過高，則會使這些有機(jī)物發(fā)生熱裂解反應(yīng)，再經(jīng)環(huán)化、聚合，就生成了如苯并(a)芘等一些多環(huán)芳烴物質(zhì)。另一方面，堅果在生長過程中其根系會從水、土中吸收有機(jī)污染物，且其果實也有可能從大氣中吸附苯并(a)芘。

對苯并(a)芘研究大多集中在熏烤肉制品、油炸食品中，對炒制食品研究較少。目前，對堅果炒貨衛(wèi)生質(zhì)量研究也更加關(guān)注黃曲霉B1等致癌物質(zhì)的測定，很少開展多環(huán)芳烴污染的研究。食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)GB 5009.27-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中苯并(a)芘的測定》并未涉及堅果炒貨的測定。本研究旨在結(jié)合堅果炒貨特點，探討測定堅果炒貨中苯并(a)芘的方法。

1 材料與方法

1.1 試驗儀器

儀器：島津高效液相色譜儀(LC-20A)；配熒光分光檢測器(RF-20A);飛鴿牌高速離心機(jī)(TDL-5-A)；德國IKA旋渦振蕩儀(MS3)；舒美超聲波儀(KQ-500E)；SENCO旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(W2-100SP)；北京優(yōu)晟氮吹儀(UGC-24)。

1.2 試劑與材料

正己烷(色譜純，SINENCE)、乙腈(色譜純，J.T.BAKER)、甲苯(色譜純，ourchem)、丙酮(色譜純，fisher chemical)、超純水、中性氧化鋁柱(月旭科技，22 g,60 mL)、微孔濾膜(0.45 μm)、苯并(a)芘標(biāo)準(zhǔn)溶液(100 μg·mL-1，北京壇墨質(zhì)檢科技有限公司)。

1.3 樣品前處理

稱取經(jīng)去殼、粉碎均勻的樣品1 g(精確至0.001 g)于10 mL離心管中，加入5 mL正已烷與丙酮混合溶液正已烷∶丙酮(V∶V=3∶1)，旋渦混合30 s，于40℃下超聲提取15 min,于5 000 r·min-1離心機(jī)中離心5 min，轉(zhuǎn)移出上層清液。再加入5 mL混合溶液重復(fù)提取1次，合并上清液，待凈化。

1.4 樣品凈化

中性氧化鋁柱用30 mL正已烷活化，將上述凈化液轉(zhuǎn)移入中性氧化鋁柱，收集流出液，并用50 mL正已烷洗脫，繼續(xù)收集凈化液。將凈化液在40℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至約5 mL,后轉(zhuǎn)移至刻度試管，40℃氮吹近干，用1 mL甲苯復(fù)溶，過0.45 μm濾膜備用。

1.5 標(biāo)準(zhǔn)使用液配制

移取100 μg·mL-1苯并(a)芘標(biāo)準(zhǔn)溶液0.5 mL用甲苯定容至50 mL，配制成1 μg·mL-1標(biāo)準(zhǔn)中間液。將苯并(a)芘標(biāo)準(zhǔn)中間液(1.0 μg·mL-1)稀釋10倍后濃度為100 ng·mL-1標(biāo)準(zhǔn)使用液。

1.6 色譜條件

色譜柱：InertSustain C18(5 μm，4.6 mm×150 mm)；激發(fā)波長：384 nm；發(fā)射波長：406 nm；柱溫：35℃；流速：1.0 mL·min-1；流動相：乙腈：水=90∶10；進(jìn)樣體積：10 μL。

2 結(jié)果與分析

2.1 萃取溶劑的選擇

已有的研究表明，苯并(a)芘可溶于非極性及中等極性有機(jī)溶劑中，結(jié)合幾種常用的有機(jī)溶劑，本研究考察了正已烷、二氯甲烷、丙酮3種溶劑的提取效果。結(jié)果表明，二氯甲烷沸點較低，在常溫下極易揮發(fā)，在試驗過程中損耗較大，且對苯并(a)芘萃取效率不如正已烷。由圖1可以看出丙酮雖萃取效率高，但其對BaP和其他雜質(zhì)都具有較強(qiáng)萃取能力，容易引入雜質(zhì)。提取出的雜質(zhì)會干擾BaP的準(zhǔn)確定量而選擇單一正已烷，萃取效果并不理想。正已烷∶丙酮(V∶V=3∶1)很好克服提取效果不佳及雜質(zhì)萃取較多的問題。故本試驗選取萃取溶液為正已烷∶丙酮(V∶V=3∶1)混合溶劑。

圖1 不同溶劑萃取回收率對比 注：1為正已烷；2為丙酮；3為正已烷∶丙酮(1∶1)；4為正已烷∶丙酮(2∶1)；5為正已烷∶丙酮(2∶1)。

2.2 凈化柱的選擇

由于堅果中油脂含量較高，故選用對油脂具有較好吸附效果的中性氧化鋁BaP專用柱(填充量為22 g)。該凈化柱基于層析柱的原理，將油脂中的非極性干擾物質(zhì)與苯并芘分離，達(dá)到去除檢測中的干擾基質(zhì)的作用。中性氧化鋁BaP專用柱具有電中性表面，更易保留一些極性雜質(zhì)，中性及堿性物質(zhì)則能保持游離狀態(tài)，使得苯并(a)芘更易洗脫。

2.3 色譜條件的選擇

為了獲得苯并(a)芘測定的最佳色譜條件，分別從流動相組成、流速和柱溫等幾個方面進(jìn)行考察。首先，分別比較乙腈∶水(90∶10)、乙腈∶水(80∶20)、甲醇∶水(90∶10)、甲醇∶水(90∶10)4種流動相，結(jié)果發(fā)現(xiàn)選用乙腈∶水(90∶10)時，苯并(a)芘的峰形尖銳，而且可以與樣品中的雜質(zhì)達(dá)到較好的基線分離。分別在0.6、0.8、1.0、1.2、1.5 mL·min-1等5個流速下進(jìn)行試驗，發(fā)現(xiàn)當(dāng)流速為1.0 mL·min-1時，苯并(a)芘峰形尖銳，出峰時間也合適；通過設(shè)置柱溫25℃、30℃、35℃、40℃進(jìn)行分析，柱溫為35℃，苯并(a)芘色譜峰和出峰時間最佳。所得標(biāo)準(zhǔn)工作液色譜圖如圖2所示。

圖2 濃度為1.0 ng·mL-1標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖

2.4 線性方程和檢出限

準(zhǔn)確移取100 ng·mL-1苯并(a)芘標(biāo)準(zhǔn)液，用乙腈定容，配制成濃度為0.50、1.00、2.00、5.00、10.00 ng·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)曲線。按照試驗確定色譜條件進(jìn)樣。曲線線性范圍0.5～10 ng·mL-1，線性回歸方程y=119 649x+1 831.08，相關(guān)系數(shù)為0.999 8。以3倍信噪(S/N)比計算苯并(a)芘的檢出限為0.15 μg·L-1，10倍信噪(S/N)比計算苯并(a)芘的定量限為0.45μg·L-1。

2.5 回收率及精密度

以炒制瓜子為試驗樣，準(zhǔn)確稱取1.0 g空白樣品，進(jìn)行1.00、5.00、10.00 ng·mL-13個濃度水平的加標(biāo)回收試驗。其中各個添加量的重復(fù)樣品數(shù)為6個。按照本試驗建立的方法添加標(biāo)樣量，各濃度測定值、回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差如表1所示，結(jié)果顯示，回收率為80.4%～87.2%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.5%～4.2%。

表1 各濃度測定值、回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差

2.6 實際樣品測定

采集市場上不同種類炒制堅果30批次，按照本試驗建立的方法進(jìn)行檢測。結(jié)果顯示，22批次炒制堅果樣品中都有不同程度苯并(a)芘檢出，檢出值0.5～2.3 μg·kg-1。

3 結(jié)論

本試驗通過萃取劑、凈化柱的選擇及色譜條件的選擇確立了高效液相色譜-熒光檢測器測定炒制堅果中苯并(a)芘殘留的方法。試驗證明該方法簡便靈敏，回收率高，操作簡便，精確度高，適用于炒制堅果中苯并(a)芘的檢測。本次研究表明，市面上的炒貨堅果或多或少存在苯并(a)芘殘留，雖含量不高，但考慮到苯并(a)芘的強(qiáng)致癌性，仍應(yīng)引起重視。從堅果種植到堅果加工都應(yīng)加強(qiáng)監(jiān)管，減少苯并(a)芘殘留。