骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞聯(lián)合參芪顆粒對(duì)小鼠骨髓抑制模型的造血功能的影響

鄭佳琳，黃小紅，饒子亮，梁艷齡，劉驥德，黃小瓊，曾素丹，鄺少松

（廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，廣東佛山528248）

目前，放化療作為腫瘤治療的重要手段，其臨床應(yīng)用廣泛。但由于放射線與化療藥物對(duì)正常組織細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞的破壞具有無選擇性，故而放化療會(huì)導(dǎo)致機(jī)體一系列的毒副反應(yīng)。其中，骨髓抑制較為常見，往往是放化療被動(dòng)減量或停藥的最常見原因。從某種意義上來說，對(duì)骨髓抑制的控制是化療成功與否的關(guān)鍵[1]。為了最大限度的殺傷腫瘤細(xì)胞，同時(shí)又能最大程度減輕化療藥物的毒性作用，快速地恢復(fù)機(jī)體的造血功能，造血干細(xì)胞和骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植技術(shù)已開始越來越多地用于臨床[2]，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞擴(kuò)增能力強(qiáng)，免疫原性低，多向分化潛能在體內(nèi)外都已得到充分證明，在移植治療肝損傷、心肌梗死、脊髓損傷等產(chǎn)生了良好的治療效果[3]。參芪顆粒具有升白護(hù)髓、補(bǔ)氣養(yǎng)血、健脾益腎、增強(qiáng)免疫，適用于腫瘤患者白細(xì)胞、紅細(xì)胞、血小板減少，貧血等癥，并適用于脾腎虧虛、免疫力低下的治療，具有控制各種腫瘤的復(fù)發(fā)[4]。本研究通過建立小鼠骨髓移植模型，探討骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞聯(lián)合參芪顆粒對(duì)環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)嚴(yán)重骨髓損傷小鼠造血功能的影響，為中西醫(yī)結(jié)合治療放化療引起的骨髓抑制提供基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及實(shí)驗(yàn)環(huán)境

SPF級(jí)BALB/c小鼠，雄性，體重18～22g，購(gòu)于廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心〔SCXK（粵）2013-0002〕。動(dòng)物飼養(yǎng)在廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF級(jí)動(dòng)物房〔SYXK（粵）2013-0002〕。動(dòng)物飼養(yǎng)條件：5只/箱，群養(yǎng)，飼養(yǎng)溫度與濕度：20～26℃，40～70%，采用 10h：14h 晝夜間斷照明；飼養(yǎng)室條件始終保持穩(wěn)定，以保證試驗(yàn)結(jié)果的可靠性。自由進(jìn)食飲水，飼料和飲用水均由廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.2 主要試劑與儀器

參芪顆粒、環(huán)磷酰胺（CTX）、重組人粒細(xì)胞集落刺激因子注射液（rhG–CSF），細(xì)胞周期試劑盒；JEA3001系列電子天平、BCD-5000全自動(dòng)血液細(xì)胞分析儀、BD AccuriC6流式細(xì)胞儀。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)

體外大量培養(yǎng)小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，選擇處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期及狀態(tài)良好的細(xì)胞進(jìn)行給藥治療。

1.4 動(dòng)物造模

將檢疫合格的60只雄性BALB/c小鼠按照體重隨機(jī)分為空白對(duì)照組、模型對(duì)照組、陽性對(duì)照組、參芪顆粒組、小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞組、聯(lián)合用藥組 ，每組10只。除空白對(duì)照組外，其余小鼠腹腔注射環(huán)磷酰胺20 mg·kg-1·d-1，1次/d，連續(xù)7 d，誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生骨髓抑制。

1.5 動(dòng)物給藥

末次給予環(huán)磷酰胺次日，小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞組和聯(lián)合用藥組小鼠一次性尾靜脈注射1.0×107個(gè)小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞；陽性對(duì)照組小鼠腹腔注射 125 μg·kg-1·d-1rhG–CSF，參芪顆粒組和聯(lián)合用藥組小鼠灌胃18.2 g·kg-1·d-1參芪顆粒，空白對(duì)照組和模型對(duì)照組灌胃給予等量純凈水，每天1次，連續(xù)給藥7天。

1.6 外周血血常規(guī)檢查

分別于實(shí)驗(yàn)第8，10，14天，取尾靜脈血20 μL置于130 μL肝素抗凝稀釋液中，充分混勻。用Mek-7222k型全自動(dòng)血球計(jì)數(shù)儀檢測(cè)小鼠外周血白細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、紅細(xì)胞、血紅蛋白、紅細(xì)胞壓積和血小板的變化。

1.7 骨髓有核細(xì)胞懸液的制備及有核細(xì)胞計(jì)數(shù)

實(shí)驗(yàn)第14天頸椎脫臼處死各組小鼠，取出右側(cè)股骨，除凈軟組織，用6號(hào)針頭以1 mL PBS沖出骨髓細(xì)胞，200目篩網(wǎng)過濾后裂解紅細(xì)胞，將單個(gè)骨髓細(xì)胞懸液1000 r/min離心5 min，去上清，用預(yù)冷PBS洗滌2次，棄上清，用PBS定容至5 mL。按白細(xì)胞計(jì)數(shù)法進(jìn)行骨髓有核細(xì)胞計(jì)數(shù)。并計(jì)算絕對(duì)數(shù)量。

1.8 骨髓有核細(xì)胞細(xì)胞周期的分析測(cè)定

取上述制備好的骨髓單核細(xì)胞懸液1000 r/min離心5 min，棄上清，加入70%預(yù)冷乙醇固定打散細(xì)胞，4℃固定過夜，用 PBS將上述細(xì)胞洗 2次，加100 μL PBS混勻，加PI染液（4℃，避光 30 min），以標(biāo)準(zhǔn)程序用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期的變化，一般計(jì)數(shù)1～2萬個(gè)細(xì)胞，結(jié)果用軟件FlowJo7.6分析細(xì)胞周期。結(jié)果以細(xì)胞周期各時(shí)相細(xì)胞百分率表示，并按以下公式計(jì)算細(xì)胞增殖指數(shù)(proliferation index,PI)：PI=(S+G2/M)/(G0/G1+S+G2/M)×100%。

1.9 骨髓組織病理學(xué)檢查

取小鼠左側(cè)股骨固定、脫鈣，石蠟切片蘇木精-伊紅染色，觀察股骨骨髓組織形態(tài)學(xué)變化。

1.10 統(tǒng)計(jì)方法

實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)用 SPSS 21.0軟件統(tǒng)計(jì)，結(jié)果用表示，各組數(shù)據(jù)進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，同時(shí)進(jìn)行單因素方差分析。

2 結(jié)果

2.1 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞聯(lián)合參芪顆粒對(duì)骨髓抑制小鼠外周血象的影響

與空白對(duì)照組比較，實(shí)驗(yàn)第8天，其余各組小鼠外周血中白細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、紅細(xì)胞、血小板數(shù)和血紅蛋白、紅細(xì)胞壓積值均顯著降低（P＜0.05），證明造模成功。實(shí)驗(yàn)第14天，模型組小鼠的白細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、血小板數(shù)和血紅蛋白、紅細(xì)胞壓積值均有所升高，但仍均顯著低于空白對(duì)照組（P＜0.05）。

與模型對(duì)照組比較，實(shí)驗(yàn)第10天（即治療第3天），各治療組的白細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、紅細(xì)胞、血小板數(shù)和血紅蛋白、紅細(xì)胞壓積值均開始升高，到實(shí)驗(yàn)第14天（即治療第7天），逐漸恢復(fù)正常水平；各治療組的白細(xì)胞數(shù)目在實(shí)驗(yàn)第10天，白細(xì)胞數(shù)目和血紅蛋白在實(shí)驗(yàn)14天均顯著升高（P＜0.05）；參芪顆粒組血小板數(shù)目在實(shí)驗(yàn)第14天顯著升高（P＜0.05）；小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞組的血紅蛋白在實(shí)驗(yàn)第10天與紅細(xì)胞壓積值在實(shí)驗(yàn)第14天均顯著升高 （P＜0.05）；聯(lián)合用藥組的淋巴細(xì)胞、血小板數(shù)目和血紅蛋白在實(shí)驗(yàn)第10天均顯著升高（P＜0.05），血小板數(shù)目和紅細(xì)胞壓積值在實(shí)驗(yàn)第14天均顯著升高（P＜0.05）。

與陽性對(duì)照組和與參芪顆粒組比較，聯(lián)合用藥組的白細(xì)胞數(shù)目在實(shí)驗(yàn)第8天、實(shí)驗(yàn)第14天均顯著升高 （P＜0.05），結(jié)果見表1和表2。

2.2 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞聯(lián)合參芪顆粒對(duì)骨髓抑制小鼠骨髓有核細(xì)胞的影響

與空白對(duì)照組比較，模型對(duì)照組小鼠骨髓有核細(xì)胞（BMC）數(shù)量顯著降低（P＜0.05）；與模型對(duì)照組比較，各治療組均可以顯增加骨髓抑制小鼠的骨髓BMC數(shù)量 （P＜0.05）；與陽性對(duì)照組、參芪顆粒組比較，聯(lián)合用藥組BMC數(shù)量顯著升高（P＜0.05），結(jié)果見表3。

2.3 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞聯(lián)合參芪顆粒對(duì)骨髓抑制小鼠骨髓細(xì)胞周期變化的影響

與空白對(duì)照組比較，造模后骨髓細(xì)胞細(xì)胞周期出現(xiàn)了停滯的狀態(tài)，模型組小鼠G0/G1期細(xì)胞顯著增加，S期和G2/M期細(xì)胞均顯著減少，細(xì)胞增殖指數(shù)（PI）顯著降低（P＜0.05）。

與模型對(duì)照組比較，各治療組均能解除 G0/G1期細(xì)胞阻滯，促進(jìn) G0/G1期細(xì)胞進(jìn)入增殖周期，使S期和G2/M期細(xì)胞增加，增加骨髓抑制小鼠骨髓細(xì)胞的增殖指數(shù)（P＜0.05）。

與陽性對(duì)照組和參芪顆粒組比較，聯(lián)合用藥組G0/G1期細(xì)胞百分比顯著降低，S期與G2/M期細(xì)胞百分百顯著升高 ，細(xì)胞增殖指數(shù)顯著升高（P＜0.05）。與小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞組比較，聯(lián)合用藥組S期與G2/M期細(xì)胞百分百顯著升高，細(xì)胞增殖指數(shù)顯著升高（P＜0.05），結(jié)果見表3。

2.4 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞聯(lián)合參芪顆粒對(duì)骨髓抑制小鼠骨髓組織病理學(xué)的影響

各組小鼠骨髓病理切片見圖A～F。空白對(duì)照組小鼠骨髓造血細(xì)胞比例正常且分布均勻，未見明顯的脂肪組織（圖A）；模型對(duì)照組小鼠骨髓腔充滿脂肪組織，出現(xiàn)大量空白區(qū)，造血細(xì)胞殘余少量，成熟紅細(xì)胞增多（圖B）；陽性對(duì)照組（圖C）、參芪顆粒組（圖D）、小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞組（圖E）、聯(lián)合用藥組（圖F）小鼠的骨髓抑制均有所改善，病理切片可見脂肪細(xì)胞明顯減少，造血細(xì)胞增生且比例未見異常，成熟紅細(xì)胞數(shù)量正常。

表1 各組小鼠白細(xì)胞、淋巴細(xì)胞與紅細(xì)胞的比較（±s，n=10，♂）

表1 各組小鼠白細(xì)胞、淋巴細(xì)胞與紅細(xì)胞的比較（±s，n=10，♂）

注：與空白對(duì)照組比較，1)P＜0.05；與模型組比較，2)P＜0.05；與陽性對(duì)照組比較，3)P＜0.05；與參芪顆粒組比較，4)P＜0.05；與小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞組比較，5)P＜0.05。

白細(xì)胞數(shù)目（×109/L） 淋巴細(xì)胞數(shù)目（×109/L） 紅細(xì)胞數(shù)目（×1012/L）d8 d10 d14 d8 d10 d14 d8 d10 d14空白對(duì)照組 7.7±0.6 9.3±0.5 10.4±1.4 6.83±1.37 7.10±1.66 7.11±1.80 9.1±0.3 9.1±0.9 8.9±0.9模型對(duì)照組 1.9±0.51) 2.2±0.71) 3.9±0.91) 2.34±0.801)3.56±0.831)4.91±1.251) 6.5±0.61) 7.3±0.91) 7.8±1.1陽性對(duì)照組 2.2±0.51) 5.0±0.61)2)6.7±0.81)2)2.93±0.921)4.85±1.081)6.05±1.18 6.9±0.81) 7.8±0.71) 8.7±1.2參芪顆粒組 2.1±0.71) 4.6±0.41)2)6.6±0.81)2)3.02±0.941)4.42±0.851)5.95±0.90 6.8±1.11) 7.8±0.41) 8.1±1.2組別小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞組 2.2±0.71) 5.6±1.01)2)4)6.8±0.71)2)2.64±0.711)4.88±0.741)6.02±0.94 6.8±0.91) 7.5±1.01) 8.3±1.0聯(lián)合用藥組 2.0±0.61) 6.0±0.91)2)3)4)8.0±0.81)2)3)4)2.84±0.421)5.09±0.881)2) 6.32±0.94 7.0±1.31) 8.1±1.21) 9.0±0.7

表2 各組小鼠的血小板數(shù)目、血紅蛋白與紅細(xì)胞壓積值比較（±s，n=10，♂）

表2 各組小鼠的血小板數(shù)目、血紅蛋白與紅細(xì)胞壓積值比較（±s，n=10，♂）

注：與空白對(duì)照組比較，1)P＜0.05；與模型組比較，2)P＜0.05；與陽性對(duì)照組比較，3)P＜0.05；與參芪顆粒組比較，4)P＜0.05；與小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞組比較，5)P＜0.05。

血小板數(shù)目（×109/L） 血紅蛋白（×109/L） 紅細(xì)胞壓積（×1012/L）d8 d10 d14 d8 d10 d14 d8 d10 d14空白對(duì)照組 921±102 930±75 973±163 150±3 161±17 154±19 42.3±1.3 41.0±4.6 43.3±3.8模型對(duì)照組 536±1161) 652±1051) 748±1481) 86±101) 95±171) 101±161) 33.7±3.61) 35.3±2.01) 38.0±3.01)陽性對(duì)照組 513±991) 762±1671) 900±86 89±151) 108±141) 126±221)2)32.8±3.21) 39.0±3.3 42.5±4.0參芪顆粒組 534±1401)741±1631) 918±972) 91±121) 117±61) 125±161)2)31.7±3.41) 38.4±2.0 41.4±2.3組別小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞組 549±1541) 798±106 907±101 94±141) 120±201)2)133±172) 30.3±4.71) 39.4±4.9 43.1±3.72)聯(lián)合用藥組 547±1281) 824±922) 953±1162) 88±171) 118±201)2) 143±142) 33.3±4.61) 38.8±5.1 43.2±3.8 2)

表3 各組小鼠骨髓有核細(xì)胞數(shù)和細(xì)胞周期的比較（±s，n=10，♂）

表3 各組小鼠骨髓有核細(xì)胞數(shù)和細(xì)胞周期的比較（±s，n=10，♂）

注：與空白對(duì)照組比較，1)P＜0.05；與模型組比較，2)P＜0.05；與陽性對(duì)照組比較，3)P＜0.05；與參芪顆粒組比較，4)P＜0.05；與小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞組比較，5)P＜0.05。

組 別 骨髓有核細(xì)胞數(shù)（×106/L） G0/G1（%） S（%） G2/M（%） PI（%）空白對(duì)照組 15.33±2.00 54.76±2.85 34.22±2.29 11.32±1.08 45.41±1.96模型對(duì)照組 5.48±1.131) 72.48±1.881) 22.55±1.771) 6.05±0.751) 28.28±1.751)陽性對(duì)照組 11.68±1.062) 65.55±2.451)2) 24.12±2.601) 8.27±1.061)2) 33.05±2.531)2)參芪顆粒組 11.73±1.822) 66.50±2.771)2) 23.86±2.371) 8.07±0.451)2) 32.41±1.081)2)小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞組 12.26±0.971)2) 65.00±2.461)2) 25.06±1.371) 8.44±0.471)2) 34.02±1.521)2)聯(lián)合用藥組 13.83±1.422)3)4) 61.90±3.181)2)3)4) 29.36±3.471)2)3)4)5) 9.84±0.771)2)3)4)5) 38.72±1.891)2)3)4)5)

3 討論

環(huán)磷酰胺是臨床上常用的抗腫瘤藥物，主要用于血液系統(tǒng)及各種實(shí)體腫瘤的治療[5]。但是由于環(huán)磷酰胺是一種細(xì)胞周期非特異性細(xì)胞毒藥物[6]，在抑制腫瘤細(xì)胞增殖的過程中也會(huì)影響正常細(xì)胞的增殖與分化，從而引起骨髓抑制等諸多不良反應(yīng)。

骨髓間充干細(xì)胞具有高增殖和多向分化潛能，易于采集、分離純化和體外擴(kuò)增，在細(xì)胞治療、基因治療中具有廣泛的應(yīng)用前景。近年來證實(shí)，骨髓間充干細(xì)胞除具有促進(jìn)造血干細(xì)胞移植后造血重建外，還具有免疫調(diào)節(jié)作用，防治移植物抗宿主病[7]。

參芪顆粒主要成分是黨參和黃芪，黨參有益氣、養(yǎng)津、補(bǔ)血作用，黃芪有補(bǔ)氣升陽、護(hù)衛(wèi)固表作用。研究表明，黃芪能促進(jìn)人骨髓細(xì)胞中紅細(xì)胞系和粒細(xì)胞系祖細(xì)胞的生成[8]，并在臨床用于治療白細(xì)胞減少癥中被證實(shí)有顯著療效[9]；黨參有增加紅細(xì)胞、血紅蛋白和白細(xì)胞的作用[10]。參芪顆粒藥效與骨髓抑制的病癥相類似，且中藥配方顆?？蓾M足臨床辨證論治，隨癥加減的需要，同時(shí)服用方便，保持和發(fā)揚(yáng)了傳統(tǒng)中醫(yī)藥的特點(diǎn)和優(yōu)勢(shì)，既有利于中藥質(zhì)量的規(guī)范化，亦有利于中藥的標(biāo)準(zhǔn)化和國(guó)際化。

圖A～F各組小鼠骨髓病理切片HE染色（×400）

有研究表明，參芪液在體外可以誘導(dǎo)成人骨髓間質(zhì)干細(xì)胞分化為神經(jīng)元樣細(xì)胞[11]。本研究觀察了小鼠骨髓間充干細(xì)胞聯(lián)合參芪顆粒對(duì)小鼠骨髓抑制模型的造血功能的影響，結(jié)果表明，與模型對(duì)照組比較，參芪顆粒與小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞單獨(dú)使用均具有一定改善骨髓抑制小鼠的造血機(jī)能，促進(jìn)骨髓造血細(xì)胞進(jìn)入細(xì)胞增殖周期，提高細(xì)胞增殖率和造血細(xì)胞比例的作用，但小鼠骨髓間充干細(xì)胞聯(lián)合參芪顆?？梢赃_(dá)到更好的效果。與陽性對(duì)照組和參芪顆粒組比較，聯(lián)合用藥組小鼠外周血白細(xì)胞數(shù)和骨髓有核細(xì)胞數(shù)明顯恢復(fù)，G0/G1期細(xì)胞比例降低，S期、G2/M期細(xì)胞比例升高，細(xì)胞增殖指數(shù)升高。以上結(jié)果提示，小鼠骨髓間充干細(xì)胞聯(lián)合參芪顆粒能夠拮抗環(huán)磷酰胺對(duì)骨髓細(xì)胞的抑制作用，提高骨髓細(xì)胞的增殖和外周血象，促進(jìn)造血功能恢復(fù)，有利于緩解骨髓抑制病征。