注射用鹽酸青藤堿透明質(zhì)酸復(fù)合凝膠的穩(wěn)定性研究

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(1臨沂市中醫(yī)醫(yī)院，山東 臨沂 276000；2山東省藥學(xué)科學(xué)院，山東 濟南 250033；3山東大學(xué)第二醫(yī)院關(guān)節(jié)外科)

關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射藥物是治療骨性關(guān)節(jié)炎(Osteoarthritis，OA)的重要方法，透明質(zhì)酸已成為該法經(jīng)典的藥物選擇。研究表明，透明質(zhì)酸凝膠治療OA的總有效率為80%以上，是治療OA的一種安全、理想的有效藥物。近30多年來，大量的臨床資料證明關(guān)節(jié)腔透明質(zhì)酸注射不僅僅能緩解OA癥狀，而且能顯著降低關(guān)節(jié)的退化抑制免疫損害進程。透明質(zhì)酸為高分子多糖，是直鏈的大分子，其分子中每一雙糖單位含有一個羧基，可解離成負(fù)離子，等空間距離的負(fù)離子相互排斥，使分子在溶液中呈一定剛性的線團狀。當(dāng)達到一定濃度后，透明質(zhì)酸分子可相互交錯纏繞構(gòu)成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，使藥物分子進入網(wǎng)格中，具有控制藥物釋放速度的作用。透明質(zhì)酸作為藥物緩釋載體具有諸多優(yōu)點，如優(yōu)良的生物相容性和可降解性，通過酯化、交聯(lián)的透明質(zhì)酸衍生物由于改善了對強酸、強堿、熱、自由基的不穩(wěn)定性及對透明質(zhì)酸酶的敏感性，使其降解時間延長，更適宜作為藥物緩釋載體的應(yīng)用[1]。

青藤堿是從中藥青風(fēng)藤中提取的單體生物堿，臨床多用其鹽酸鹽，具有顯著的抗炎、鎮(zhèn)痛和免疫抑制作用且本身無成癮性。對白介素(IL-1β、IL-6)有明顯的抑制作用。有研究表明，OA患者血清及關(guān)節(jié)液中軟骨寡聚基質(zhì)蛋白(Cartilage oligomeric matrix protein，COMP)水平顯著升高[2-3]，而青藤堿膝關(guān)節(jié)腔注射可降低關(guān)節(jié)液中炎性因子含量，延緩軟骨退變進程[4]，其通過對各種炎癥因子的抑制作用而發(fā)揮對關(guān)節(jié)軟骨的保護作用[5]，這可能與抑制滑膜炎性反應(yīng)、降低MM-13表達有關(guān)[6]。但是，青藤堿生物半衰期較短，對光、熱不穩(wěn)定，易分解。為了克服以上缺點并且觀察其與透明質(zhì)酸聯(lián)合關(guān)節(jié)腔注射是否對OA患者能取得更好的療效，筆者制備了注射用鹽酸青藤堿透明質(zhì)酸復(fù)合凝膠，在不同pH值、不同緩沖系和不同輔料條件下對其穩(wěn)定性進行了研究。現(xiàn)報告如下。

1 資料與方法

1.1藥品與儀器 鹽酸青藤堿(陜西天成植物工程有限公司)、透明質(zhì)酸鈉(山東福瑞達生物醫(yī)藥有限公司)、半透膜(截留分子量2000)；所有試劑為分析純。ZRS-4智能溶出試驗儀(天津大學(xué)無線電廠)，紫外可見分光光度計(Agilent 8453)。

1.2方法

1.2.1不同pH值復(fù)合凝膠測定液的制備 在2 mM的磷酸鹽緩沖體系中加入2.5%鹽酸青藤堿，用鹽酸或氫氧化鈉調(diào)節(jié)溶液的pH分別為3～7，0.22 μm濾膜除菌，按1%投入無菌透明質(zhì)酸鈉，加熱助溶30 min后過夜，完全溶解后，密封，置40 ℃恒溫箱，5 d取樣用蒸餾水作10倍稀釋，測定其運動黏度(ν)和420 nm波長處的吸光度(A420nm)。

1.2.2不同緩沖系復(fù)合凝膠測定液的制備 在2 mM磷酸鹽、3 mM醋酸鹽、3 mM酒石酸鹽、2 mM枸櫞酸鹽、3 mM硼酸鹽5種緩沖體系中各加入2.5%鹽酸青藤堿和0.5%氯化鈉，用鹽酸或氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH為6，其它同上。

1.2.3不同輔料復(fù)合凝膠測定液的制備 在2 mM磷酸鹽緩沖體系中加入2.5%鹽酸青藤堿和0.5%氯化鈉和其它輔料，輔料的不同組合及比例見表3，其中0、5號管為未添加輔料的青藤堿與不同比例透明質(zhì)酸鈉的復(fù)合凝膠測定液，然后用鹽酸或氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH為6，其它同上。

1.3復(fù)合凝膠穩(wěn)定性的判定 運動粘度表示透明質(zhì)酸的穩(wěn)定性，運動黏度值越大透明質(zhì)酸越穩(wěn)定。A420nm吸光度表示青藤堿的穩(wěn)定性，吸光度越小表明對青藤堿影響越小，穩(wěn)定性越好。

2 結(jié)果

2.1不同pH值對復(fù)合凝膠穩(wěn)定性的影響 隨著pH值的降低，透明質(zhì)酸鈉的分解加速；而隨著pH值的升高，鹽酸青藤堿的分解加速。在pH值為6時兩種成分相對穩(wěn)定。見表1。

表1 不同pH值對復(fù)合凝膠穩(wěn)定性的影響

2.2不同緩沖系對復(fù)合凝膠穩(wěn)定性的影響 不同緩沖體系對透明質(zhì)酸鈉穩(wěn)定性的影響無明顯差異，磷酸鹽和酒石酸鹽緩沖體系中鹽酸青藤堿穩(wěn)定性的影響相對較小。見表2。

表2 不同緩沖系對復(fù)合凝膠穩(wěn)定性的影響

2.3不同輔料對復(fù)合凝膠穩(wěn)定性的影響 絡(luò)合劑乙二胺四乙酸(Ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA)、NaHSO3、Na2S2O4、L-半胱氨酸(L-cys)、增溶劑吐溫80、環(huán)狀糊精(β-cyclodextrin，β-CD)、聚乙二醇400(PEG400)、防腐劑山梨酸的加入，對透明質(zhì)酸鈉的穩(wěn)定性影響不大，但可降低鹽酸青藤堿的分解，提高鹽酸青藤堿在溶液中的穩(wěn)定性。見表3。

表3 不同輔料對復(fù)合凝膠穩(wěn)定性影響

3 討論

3.1復(fù)合凝膠的穩(wěn)定性 關(guān)節(jié)軟骨內(nèi)透明質(zhì)酸分子量(Mr)隨年齡增加而呈下降趨勢，進而軟骨基質(zhì)的構(gòu)成單位聚乙醇酸(Polyglycolic acido，PGA)的體積明顯減小，加上蛋白聚糖和連接蛋白等發(fā)生的變化可能是老年人易患OA的主要原因。當(dāng)患OA時，由于自由基和關(guān)節(jié)積液等原因，關(guān)節(jié)內(nèi)透明質(zhì)酸(Haluronic acid，HA)濃度和Mr明顯降低，使其生理功能發(fā)生明顯障礙。外源性透明質(zhì)酸必須具有一定的Mr和濃度并相對穩(wěn)定才能發(fā)揮其治療作用。所以制備復(fù)合凝膠時透明質(zhì)酸須具有一定穩(wěn)定性，保持一定的濃度和Mr。本實驗表明，各種緩沖對和輔料對透明質(zhì)酸的穩(wěn)定性影響較小，但隨著pH值的降低其分解加速。而鹽酸青藤堿在偏酸的環(huán)境中穩(wěn)定，隨著pH值的升高其分解加速。本研究發(fā)現(xiàn)在pH值為6時，復(fù)合凝膠中的這兩種主要成分都相對穩(wěn)定，所以制備不同的緩沖液和各種輔料對復(fù)合凝膠穩(wěn)定性研究時取pH值為6。

3.2復(fù)合凝膠應(yīng)用的優(yōu)勢 兩種藥物單獨制劑先后注入關(guān)節(jié)腔，由于透明質(zhì)酸黏度大，青藤堿注射液不易均勻分散到透明質(zhì)酸網(wǎng)狀凝膠中，難以發(fā)揮透明質(zhì)酸的緩釋作用，藥物很快分散流失。另外，兩者單獨制劑聯(lián)合應(yīng)用時注射過程中間需更換注射器，這樣增加了器械的污染機會，增加膝關(guān)節(jié)感染的概率，若膝關(guān)節(jié)內(nèi)感染將引起災(zāi)難性的后果。注射用鹽酸青藤堿透明質(zhì)酸復(fù)合凝膠體外制備后可一次將兩種藥物注射入關(guān)節(jié)腔，避免了以上風(fēng)險。