酶解法檢測(cè)淀粉糊化度的方法優(yōu)化

The Optimization of Starch Gelatinization Enzyme Hydrolysis Method

◎ 劉 流1，周小波2

（1.鹽城市食品藥品監(jiān)督檢驗(yàn)中心，江蘇 鹽城 430070；2.天邦食品股份有限公司，浙江 寧波 315000）

淀粉糊化是指淀粉懸浮液在一定溫度下，淀粉顆粒吸水膨脹，體積增大，淀粉顆粒破裂，成為黏稠狀膠體溶液的過程。糊化的本質(zhì)是淀粉中晶質(zhì)與非晶質(zhì)態(tài)的淀粉分子間的氫鍵斷開，微晶束分離，形成一種間隙較大的立體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，淀粉顆粒中原有的微晶結(jié)構(gòu)被破壞[1]。糊化度是指淀粉中糊化淀粉與全部淀粉量之比的百分?jǐn)?shù)。淀粉的糊化度越高，越容易被酶水解，越易被消化吸收[2]。

淀粉糊化度及糊化參數(shù)的測(cè)定，一般是根據(jù)淀粉糊化后其物理或化學(xué)特性的變化特點(diǎn)，如雙折射現(xiàn)象消失、顆粒膨脹、透光率及黏度變化等。目前，主要的研究方法有酶水解法、黏度測(cè)定法、雙折射法、DSC技術(shù)、近紅外光譜分析技術(shù)、X-衍射以及核磁共振光譜技術(shù)等[3]。本文主要討論酶解法，對(duì)比復(fù)合淀粉酶和單一酶β-淀粉酶的檢測(cè)結(jié)果。

1 材料與儀器

1.1 供試材料

玉米淀粉，北京鴻潤(rùn)寶順科技有限公司，純度為99.5%。

1.2 試劑

β-淀粉酶：北京鴻潤(rùn)寶順科技有限公司，效價(jià)為10.0萬/g。Sigma淀粉脫支酶（amyloglucosidase）：Sigma，No.A-7255，濃度為12 100單位/g。碘化鉀（KI）：分析純，國(guó)藥滬試。碘單質(zhì)（I2）：分析純，國(guó)藥滬試。氫氧化鈉（NaOH）：分析純，國(guó)藥滬試，粒狀。硫代硫酸鈉（Na2S2O3·5H20）：分析純，國(guó)藥滬試。

1.3 儀器

分析天平（0.000 1 g），水浴鍋，電爐，100 mL三角瓶，10 mL酸式滴定管，燒杯，玻璃棒，100 mL棕色容量瓶，100 mL容量瓶，500 mL容量瓶，1 000 mL容量瓶。

2 原理

2.1 β-淀粉酶酶解法基本原理

葡萄糖和碘單質(zhì)反應(yīng)，消耗部分碘；硫代硫酸鈉滴定剩余部分碘；已知加入的碘的量，計(jì)算出消耗了多少碘，和麥芽糖的量。β-淀粉酶對(duì)糊化淀粉和原淀粉有較高選擇性，僅水解糊化淀粉，不水解生淀粉；根據(jù)β-淀粉酶將糊化淀粉水解為麥芽糖，已知麥芽糖的量，計(jì)算糊化淀粉的量，糊化淀粉與全部淀粉的量之比即為糊化度。經(jīng)過不同標(biāo)準(zhǔn)品驗(yàn)證，β-淀粉酶酶解法可以準(zhǔn)確測(cè)量復(fù)合淀粉的糊化度。

2.2 涉及的化學(xué)反應(yīng)

I2與NaOH作用可生成次碘酸鈉（NaIO），次碘酸鈉可將還原糖分子中的醛基定量地氧化為羧基。未與還原糖作用的次碘酸鈉在堿性溶液中歧化生成NaI和NaIO3，當(dāng)酸化時(shí)NaIO3又恢復(fù)成I2析出，用Na2S2O3標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定析出的I2，可計(jì)算出還原糖的含量。具體反應(yīng)式如下，

C6H12O6和NaIO定量作用：

總反應(yīng)式：I2+C6H12O6+2NaOH=C6H12O7+2NaI+H2O

C6H12O6作用完后，過量的NaIO發(fā)生歧化反應(yīng)：

在酸性條件下NaIO3和NaI作用：

析出過量的碘用Na2S2O3標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定：

2.3 淀粉糊化度的計(jì)算

公式中，X：糊化度；Q：空白試驗(yàn)所消耗的硫代硫酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積，單位為mL；P1：糊化完全時(shí)所消耗的硫代硫酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積，單位為mL；P2：待測(cè)試樣所消耗的硫代硫酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積，單位為mL。

3 實(shí)驗(yàn)方法

3.1 材料與試劑

（1）1%淀粉溶液。取可溶性淀粉0.5 g，加水5 mL攪拌均勻后，緩緩傾入100 mL沸水中，邊加邊攪拌，繼續(xù)煮沸2 min，放冷后傾取上層清液即得。

（2）1 mol/L鹽酸。量取8.34 mL37%濃鹽酸，加蒸餾水定容至100 mL。

（3）0.1 mol/L碘液。稱取碘化鉀3.5 g，溶于10 mL水中，然后稱取碘單質(zhì)1.27g溶于碘化鉀溶液，充分溶解混勻后，轉(zhuǎn)入棕色容量瓶定容至100 mL（保質(zhì)期1個(gè)月）。

（4）0.2 mol/L NaOH溶液。稱取4 g NaOH，加蒸餾水定容至500 mL。

（5）10%硫酸溶液。量取10 mL98%濃硫酸，加蒸餾水定容至100 mL。

（6）0.1 mol/LNa2S2O3溶液。稱取26 g硫代硫酸鈉（Na2S2O3·5H20），加0.2 g無水碳酸鈉，溶于1 000 mL水中，煮沸10 min，冷卻，放置一周后過濾，定容至1 000 mL。

3.2 β-淀粉酶酶解法

（1）通過60目篩磨碎試樣，分別稱取0.5 g（如有需要進(jìn)行脫糖脫脂處理）置于2個(gè)100 mL的三角瓶中，分別標(biāo)記A1、A2，另取1個(gè)100 mL的三角瓶，不加試樣作空白，標(biāo)記為B。向這3個(gè)瓶中加入蒸餾水50 mL。

（2）把A1置于電爐煮沸（微）或沸水浴中煮沸60 min，每15 min搖勻一次，然后將A1三角瓶迅速冷卻到20 ℃（夏天高溫時(shí)應(yīng)將A2、B與A1一起迅速冷卻到20 ℃）。

（3）在A1、A2、B中各加入0.150 gβ-淀粉酶，在38 ℃水浴中保溫3 h，每15 min攪拌1次，然后在3個(gè)三角瓶中迅速加入2 mL 1 mol/L的鹽酸溶液，用蒸餾水定容到100 mL，過濾后作檢定液用。

（4）各取檢測(cè)液20 mL，分別置于3個(gè)100 mL具塞磨口三角瓶中，各加入0.1 mol/L的碘液10 mL，0.2 mol/L的NaOH溶液10 mL，然后加塞暗處靜置15 min。注意：碘液不同批次不能混用；加入碘液后至滴定結(jié)束，保證每個(gè)樣品實(shí)驗(yàn)時(shí)間一致。

（5）靜置后在上述3個(gè)三角瓶中各加入10%的硫酸溶液2 mL，用0.1 mol/L Na2S2O3的標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行滴定，待試樣顏色變?yōu)榈S色時(shí)加入1%淀粉液指示劑，繼續(xù)滴定至藍(lán)色消失，記錄所消耗Na2S2O3標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積。

3.3 注意事項(xiàng)

①碘液不同批次不能混用。②加入碘液后至滴定結(jié)束，保證每個(gè)樣品實(shí)驗(yàn)時(shí)間一致。③脫糖脫脂處理步驟。取樣品50 g倒入250 mL三角瓶中，加入100 mL乙醚溶解后震蕩1 min后過濾（重復(fù)3次），加入100 mL乙醇溶解后震蕩1 min后過濾（重復(fù)3次）。將濾紙中樣品倒入三角瓶中，通風(fēng)櫥內(nèi)放置1 h后放入45 ℃烘箱，4 h后取出。

4 結(jié)果與分析

4.1 不同酶解時(shí)間玉米（顆粒生玉米）的糊化度檢測(cè)

使用Sigma復(fù)合酶測(cè)量糊化度為0的玉米淀粉，Sigma淀粉復(fù)合酶添加量為1% 4 mL。不同的酶解時(shí)間進(jìn)行對(duì)比，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1。從表中數(shù)據(jù)可以看出，由于Sigma復(fù)合淀粉會(huì)緩慢水解生淀粉，故檢測(cè)結(jié)果與實(shí)際差別較大，且實(shí)驗(yàn)得到的淀粉糊化度結(jié)果會(huì)隨酶解時(shí)間的增加而增加。

表1 復(fù)合淀粉酶檢測(cè)結(jié)果表

4.2 不同熟玉米淀粉比例的玉米淀粉的糊化度檢測(cè)

首先制備不同糊化度的玉米淀粉標(biāo)準(zhǔn)品，分別為0%、20%、40%、60%、80%和100%，進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。每份樣本中添加0.150 0 g的β淀粉酶，然后進(jìn)行充分酶解，酶解時(shí)間為140 min，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2。從表中數(shù)據(jù)可以看出，淀粉糊化度的檢測(cè)結(jié)果比較準(zhǔn)確，基本與標(biāo)準(zhǔn)品數(shù)據(jù)一致。

表2 β淀粉酶檢測(cè)結(jié)果表

5 結(jié)論

實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了淀粉復(fù)合酶可以比較緩慢的分解生淀粉，從而影響檢測(cè)糊化度的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，酶解時(shí)間越長(zhǎng)，結(jié)果數(shù)據(jù)越大。而β-淀粉酶完全不水解生淀粉，經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)品實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，采用β-淀粉酶進(jìn)行充分酶解后，可以得到較準(zhǔn)確糊化度結(jié)果，比復(fù)合酶的傳統(tǒng)方法檢測(cè)結(jié)果更準(zhǔn)確；且β-淀粉酶的新方法成本較低。因此β-淀粉酶可以廣泛應(yīng)用于飼料質(zhì)控檢測(cè)，食品質(zhì)控檢測(cè)等領(lǐng)域。