電針足三里穴對腸易激綜合征大鼠平滑肌收縮蛋白vimentin的影響

劉嬌萍，楊大業(yè)，冉國平，劉嘉穎，李?佳*

（1.湖北中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院/華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬武漢中心醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合腫瘤科，430051；2.湖北中醫(yī)藥大學(xué)針灸骨傷學(xué)院/針灸治未病湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心，武漢?430061）

腸易激綜合征（Ⅰrritable Bowel Syndrome，ⅠBS）是一種感覺動(dòng)力失調(diào)，以對機(jī)械性或化學(xué)性刺激的高敏感性（即高反應(yīng)性或易激性）為特征的慢性腸道功能紊亂性疾病，因其發(fā)病率高、治療困難、嚴(yán)重影響患者生存質(zhì)量而被逐漸重視[1]。目前研究認(rèn)為，腸易激綜合征主要表現(xiàn)在[2]：胃腸功能紊亂、腸道高敏感性、神經(jīng)遞質(zhì)失衡。針灸防治功能性胃腸疾病有良好的療效，特別是針灸對胃腸動(dòng)力的調(diào)整作用更是研究的熱點(diǎn)之一[3]。近年來的研究逐漸證明，平滑肌肌動(dòng)蛋白聚合和解聚、細(xì)胞骨架波形蛋白（vimentin）的重組與平滑肌細(xì)胞收縮動(dòng)力學(xué)過程關(guān)系密切，并且研究發(fā)現(xiàn)，

vimentin可以調(diào)控炎性機(jī)制。足三里乃胃之下合穴，亦是足陽明胃經(jīng)的合穴，乃治療脾胃疾病的要穴，臨床常用之治療胃腸疾病?；诖耍覀円云交〖?xì)胞骨架蛋白vimentin為切入點(diǎn)，以腸易激綜合征模型大鼠為研究對象，探討針刺對胃腸道平滑肌收縮動(dòng)力以及炎性損傷的影響，為“肚腹三里留”的科學(xué)內(nèi)涵提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，進(jìn)一步揭示和豐富經(jīng)穴-臟腑相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物與分組 三月齡SPF級雌性SD大鼠80只，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為4組，正常組、模型組、穴位組、非穴位組，每組各20只。動(dòng)物喂養(yǎng)在湖北中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心完成，生產(chǎn)合格證號：SCXK（鄂）2004-0007，環(huán)境溫度21～25 ℃，濕度40%～60%。光照時(shí)間每日12 h，大鼠可自由取食飲水。

1.2 主要儀器、器材和試劑 BⅠO-RAD化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)、XMTD-204恒溫水箱、Milli-Q Direct超純水機(jī)、ⅠMS-20全自動(dòng)雪花制冰機(jī)、Powerpac Tm HC電泳儀、Trans-Blot SD Cell轉(zhuǎn)膜儀、vimentin和GAPDH抗體、G6805-Ⅱ型電針治療儀、0.30 mm×13 mm毫針。

1.3 模型制備 單一方法建立的模型常有局限性，兩種或以上方法聯(lián)合復(fù)制模型符合發(fā)病機(jī)制與臨床表現(xiàn)。所以我們以高乳糖飼料喂養(yǎng)與束縛應(yīng)激相結(jié)合的方法制備ⅠBS-D大鼠模型，參照文獻(xiàn)方法[5]加工高乳糖飼料，略作改進(jìn)進(jìn)行束縛應(yīng)激。采用捆綁器每天捆綁大鼠，固定于高鐵架上并傾斜60°放置，使大鼠雙后肢完全制動(dòng)，1 h后解除束縛，造模共14 d，此造模方法采用相對溫和的應(yīng)激刺激結(jié)合外周致敏法同時(shí)使用，大大提高了造模的成功率。正常組常規(guī)喂養(yǎng)，束縛應(yīng)激同模型組，其余各組于造模的同時(shí)給予相應(yīng)的處理。

1.4 干預(yù)方法 參照中國針灸學(xué)會(huì)實(shí)驗(yàn)針灸研究會(huì)制定的“實(shí)驗(yàn)動(dòng)物針灸穴位圖譜，穴位組選取雙側(cè)后三里穴，即實(shí)驗(yàn)大鼠的足三里穴。用0.30 mm×13 mm華佗牌毫針直刺，接G6805-Ⅱ型電針治療儀，連續(xù)波，頻率120次/min，強(qiáng)度1 mA，以大鼠雙下肢輕微抖動(dòng)為宜，留針15 min，1次/d，共14 d。非穴位組選取足三里穴外側(cè)5 mm區(qū)域作為針刺點(diǎn)，干預(yù)方法同電針組。

1.5 指標(biāo)檢測 1）結(jié)腸蠕動(dòng)波測定：依據(jù)相關(guān)報(bào)告[6]進(jìn)行測定，1%戊巴比妥鈉尾靜脈注射麻醉大鼠，將自制的結(jié)直腸擴(kuò)張刺激球囊插入大鼠肛門內(nèi)，記錄單位時(shí)間（30 min）內(nèi)的結(jié)腸蠕動(dòng)波個(gè)數(shù)。2）小腸黏膜組織炎性因子檢測：剖開腹腔，摘取小腸，縱向剪開，0 ℃生理鹽水清潔沖洗，刮取黏膜組織，- 70 ℃低溫冰箱儲(chǔ)存?zhèn)溆?。酶?lián)免疫吸附法（ELⅠSA）定量檢測目的蛋白含量，檢測指標(biāo)包括ⅠL-1β、ⅠL-10。3）相關(guān)蛋白檢測：蛋白免疫印跡法檢測指標(biāo)包括vimentin和內(nèi)參GAPDH。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，對于正態(tài)分布數(shù)據(jù)采用方差分析和t檢驗(yàn)，非正態(tài)分布數(shù)據(jù)采用Mann-Whitney U檢驗(yàn)，率的顯著性比較采用χ2檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 針刺對各組大鼠腸蠕動(dòng)波的影響 見圖1。

圖1 各組大鼠30 min腸蠕動(dòng)波計(jì)數(shù)總量注：NC：正常；Model：模型；RA：穴位；SA：非穴位。各組30 min大鼠腸蠕動(dòng)波計(jì)數(shù)總量比較，模型組與非穴位組大鼠蠕動(dòng)波次數(shù)明顯高于正常組（*P＜0.05），而穴位組與模型組和非穴位組比較，蠕動(dòng)波減少，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（# P＜0.05）。

2.2 針刺對腸易激綜合征結(jié)腸黏膜組織炎性因子的影響 見圖2。

圖2 各組大鼠結(jié)腸黏膜ⅠL-1β和ⅠL-10的含量注：模型組大鼠結(jié)腸ⅠL-1β較正常組高，而 ⅠL-10 較正常組低，相比具有顯著性差異（* P＜0.05）；經(jīng)電針足三里穴治療后，與模型組、非穴位組相比，結(jié)腸黏膜組織中ⅠL-1β降低，ⅠL-10增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（# P＜0.05）。

2.3 針刺足三里穴對腸易激綜合征結(jié)腸組織中vmentin的表達(dá) 見圖3。

圖3 各組大鼠結(jié)腸組織中vimentin的表達(dá)注：針刺足三里穴促進(jìn)ⅠBS結(jié)腸組織中vimentin的表達(dá)，與模型組、非穴位組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（# P＜0.05），而非穴位組對vimentin沒有影響。

3 討論

中醫(yī)學(xué)無腸易激綜合征之名，根據(jù)其反復(fù)腹瀉或便秘，或腹瀉和便秘交替等主癥，散見于中醫(yī)學(xué)“腹痛”“泄瀉”“下利”“饗泄”“便秘”“滯下”等范疇的文獻(xiàn)中。國家標(biāo)準(zhǔn)《中國臨床診療術(shù)語》明確腸易激綜合征病名為“腸郁”?！端貑枴り庩枒?yīng)象大論》：清氣在下，則生饗泄，濁氣在上，則生?脹。腹瀉型腸易激綜合征多為脾虛氣滯，運(yùn)化失職，肝郁氣滯，津液無制而發(fā)泄瀉[7]。治療上當(dāng)宜健脾補(bǔ)虛，行氣。氣得行則大便自調(diào)，脾氣旺則津液自行，則泄瀉得解。而且脾虛泄瀉臨床常見，且反復(fù)發(fā)作，纏綿難愈。從本虛標(biāo)實(shí)論治，重補(bǔ)虛行氣?；诖?，我們選取調(diào)節(jié)胃腸功能的足三里穴，固護(hù)后天正氣，調(diào)節(jié)胃腸功能。

排便習(xí)慣及大便性狀的改變是腸易激綜合征的主癥，而胃腸動(dòng)力學(xué)異常和炎性損傷一直是腸易激綜合征病理生理研究的重點(diǎn)。雖然功能障礙的表現(xiàn)呈顯著的廣泛性，甚至可能涉及整個(gè)胃腸道，但結(jié)腸本身的運(yùn)動(dòng)功能紊亂仍然是腸易激綜合征的一個(gè)重要特征。因此，結(jié)腸功能的紊亂可作為研究腸易激綜合征的切入點(diǎn)。胃腸道疾病發(fā)病機(jī)制中，消化道平滑肌細(xì)胞收縮異常，細(xì)胞表型發(fā)生改變，從而引起細(xì)胞骨架蛋白一系列的變化。而機(jī)體內(nèi)分化成熟的平滑肌細(xì)胞與心肌細(xì)胞、骨骼肌細(xì)胞不同，具有可塑性，能夠在一定的條件下發(fā)生表型轉(zhuǎn)化，從收縮型平滑肌細(xì)胞去分化為合成型平滑肌細(xì)胞，進(jìn)而合成多種細(xì)胞因子、介質(zhì)及細(xì)胞外基質(zhì)等參與炎癥和消化道重建；與此相應(yīng)，平滑肌細(xì)胞由生理狀態(tài)下的“收縮型”轉(zhuǎn)化為“合成型”，一些分化標(biāo)志物表達(dá)明顯下調(diào)甚至消失，細(xì)胞骨架發(fā)生重塑，細(xì)胞處于去分化狀態(tài)，從而喪失收縮功能。由此可見，平滑肌細(xì)胞的表型轉(zhuǎn)化與平滑肌收縮功能和炎癥反應(yīng)密切相關(guān)。而且相關(guān)研究表明，早期的炎癥反應(yīng)可能是平滑肌細(xì)胞功能失調(diào)的誘因，進(jìn)而引起腹瀉型為主的腸易激綜合征結(jié)腸運(yùn)動(dòng)[8]。

參與炎癥反應(yīng)的粘附分子、趨化因子、細(xì)胞因子、炎癥介質(zhì)等都是NF-κB的靶基因，包括細(xì)胞間粘附分子-1、血管細(xì)胞粘附分子-1、單核細(xì)胞趨化因子-1、白細(xì)胞介素 -1（Ⅰnterleukin-1，ⅠL-1）、ⅠL-6、ⅠL-8、ⅠL-10、腫瘤壞死因子-α（TNF-a）等。ⅠL-10是一種抑制性的細(xì)胞因子，具有抗炎、免疫抑制活性。ⅠL-1β能增加由巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子如ⅠL-6、ⅠL-10和TNF-a，使中性粒細(xì)胞向炎癥部位募集，引起一系列腸道病變，從而導(dǎo)致平滑肌細(xì)胞的增生異常。而腸道炎癥時(shí)增生異常的平滑肌細(xì)胞會(huì)導(dǎo)致平滑肌肌層變薄，以致平滑肌運(yùn)動(dòng)異常。所以，ⅠL-1β和ⅠL-10不僅能反映炎癥，在一定程度上也反映腸道平滑肌運(yùn)動(dòng)功能變化[9]。

中間絲是真核生物細(xì)胞的特征性結(jié)構(gòu)，與微管、肌動(dòng)蛋白微絲組成細(xì)胞骨架Vimentin屬于中間絲蛋白的一種，其主要附著在細(xì)胞核、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及線粒體的旁邊或末端，在支撐及錨固細(xì)胞器方面具有重要作用，同時(shí)它還能夠維持細(xì)胞形狀、細(xì)胞質(zhì)完整性及穩(wěn)定細(xì)胞骨架內(nèi)的相互作用[10]。平滑肌細(xì)胞內(nèi)F-actin與vimentin均形成絲線狀的微絲，沿同一方向排列有序而又相互交錯(cuò)的分布于細(xì)胞質(zhì)，在胞質(zhì)外圍靠近細(xì)胞膜處密集排列[11]。近年來的研究逐漸證明，平滑肌肌動(dòng)蛋白聚合和解聚、細(xì)胞骨架波形蛋白vimentin的重組，平滑肌細(xì)胞收縮動(dòng)力學(xué)過程與這兩種功能的行使有密不可分的關(guān)系[12-14]。而且我們最近的研究也發(fā)現(xiàn)[15-16]，平滑肌細(xì)胞骨架調(diào)節(jié)蛋白引起vimentin的磷酸化從而影響該蛋白的重組，進(jìn)而調(diào)節(jié)平滑肌細(xì)胞收縮[17-18]。但之前對其在炎癥方面的作用研究較少，有實(shí)驗(yàn)表明，波形蛋白能夠影響調(diào)控平滑肌細(xì)胞炎性小體形成及活性[19]。Vimentin通過不同途徑調(diào)控著細(xì)胞多種功能，與類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、白內(nèi)障、丙型肝炎以及腫瘤的發(fā)生發(fā)展相關(guān)[20]。我們實(shí)驗(yàn)證實(shí)，針刺可以有效抑制腸易激綜合征模型平滑肌細(xì)胞收縮蛋白vimentin的表達(dá)，減少炎癥反應(yīng)，從而對胃腸收縮以及炎癥機(jī)制有調(diào)節(jié)作用。