結(jié)合GC-MS的分子蒸餾富集柚皮精油抗氧化成分的研究

王 芳 岳朝敏 Andreea David 林潔茹 何宇城 鄧 剛

(浙江師范大學(xué)化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院1，金華 321004)(浙江師范大學(xué)行知學(xué)院2，金華 321004)

分子蒸餾(Molecular Distillation, MD)，又叫短程蒸餾，是一種特殊的液-液分離技術(shù)，它是依據(jù)不同物質(zhì)分子運(yùn)動(dòng)平均自由程的差異來(lái)實(shí)現(xiàn)分離。分子蒸餾是一種工作在高真空(0.1～100 Pa)，低沸騰溫度(20～65℃)條件下的分離技術(shù)[1]，非常適合熱敏性、高沸點(diǎn)物質(zhì)的分離[2-3]，因此近年來(lái)該技術(shù)被廣泛應(yīng)用于油脂脫酸、不飽和脂肪酸的精制、油溶性脂肪酸的提純等領(lǐng)域[4-7]。植物精油的主要成分是醛、酮、醇類(lèi)，大部分為萜類(lèi)化合物，具有高沸點(diǎn)、熱不穩(wěn)定及易氧化等特點(diǎn)[8]，傳統(tǒng)分離方法如精餾法、浸提法等易引起分子重排、氧化等，導(dǎo)致精油成分破壞[9-10]，而真空低溫條件下的分子蒸餾技術(shù)不僅可能保證精油的品質(zhì)，而且能夠高效提純或富集精油中的一些香氣成分或活性成分，是一種理想而有前景的精油精制方法。

近年來(lái)有關(guān)分子蒸餾用于精制植物精油的研究日新月異，主要研究集中工藝優(yōu)化[11]、精油脫萜脫毒[12]、精油賦香性[13]等方向，尚需加強(qiáng)分子蒸餾在組分多雜植物精油的應(yīng)用基礎(chǔ)研究，考察分子蒸餾如何實(shí)現(xiàn)對(duì)植物精油分級(jí)精煉，進(jìn)而達(dá)到甄別香氣、濃縮活性以及脫除雜質(zhì)的目標(biāo)。本研究實(shí)驗(yàn)材料為琯溪蜜柚[Citrusgrandis(L.) Osbeck]的果皮精油，由于柚子屬大宗水果，種植面積大，年產(chǎn)鮮果上千萬(wàn)噸。目前國(guó)內(nèi)精油市場(chǎng)規(guī)模在200億元～220億元[14]，精油的使用廣泛[15]，但精深加工方法不多，精油附加值低。本實(shí)驗(yàn)對(duì)水蒸氣蒸餾得到的柚皮精油，嘗試采用了二階段分子蒸餾，通過(guò)調(diào)控關(guān)鍵蒸餾條件，最終得到差異明顯的多種餾分，結(jié)合氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(GC-MS)的組分分析和各餾分的抗氧化活性的測(cè)定，找尋并富集柚皮精油抗氧化成分。

1 材料與方法

1.1 材料

柚皮精油：采用水蒸氣蒸餾法從琯溪蜜柚皮中制得，淡黃色，用無(wú)水硫酸鈉干燥，過(guò)濾后將粗精油存于棕色瓶中，-20 ℃保藏。

1.2 儀器與試劑

KDL 5分子蒸餾儀：德國(guó)UIC公司；7890A-5975C氣相色譜-質(zhì)譜儀：美國(guó)Agilent公司；UV-2550紫外可見(jiàn)光分光光度計(jì)：日本Shimadzu公司。

1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、2,2-聯(lián)氮-3-乙苯-二噻唑-6磺酸(ABTS)、過(guò)硫酸鉀(K2S2O8)：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；二氯甲烷、環(huán)己酮為色譜純：德國(guó)Merck公司；其他試劑均為分析純。

1.3 方法

1.3.1 柚皮精油分子蒸餾實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

柚皮精油分子蒸餾實(shí)驗(yàn)條件的調(diào)控及選取是綜合考慮了對(duì)各餾分組成分析和收率的實(shí)時(shí)測(cè)定結(jié)果，其中可變調(diào)控參數(shù)包括蒸發(fā)器溫度為20～60 ℃，一級(jí)冷凝器為-10～15 ℃，系統(tǒng)真空度1～10 Pa，其他參數(shù)包括二級(jí)冷凝器溫度(-20 ℃)、冷肼溫度(液氮冷卻)、刮膜轉(zhuǎn)速(100 r/min)，進(jìn)料流速(1 mL/min)在整個(gè)蒸餾操作過(guò)程中均保持不變。對(duì)200 mL柚皮精油進(jìn)行了第一階段分子蒸餾后，根據(jù)GC-MS對(duì)殘留液(1RH，重餾分)、一級(jí)冷凝器冷凝液(1DM，中間餾分)，二級(jí)冷凝器冷凝液(1DL，輕餾分)分析結(jié)果，再對(duì)組分沸點(diǎn)分布寬的1RH進(jìn)行了第二階段分子蒸餾，調(diào)節(jié)蒸餾溫度為25 ℃，一級(jí)冷凝器為-10 ℃，真空度190～200 Pa，其他條件不變，得到兩個(gè)餾分，分別記為2RH，2DM。

1.3.2 柚皮精油成分的GC-MS分析

采用GC-MS法分析了分子蒸餾各餾分及原油的化學(xué)組成。氣相色譜條件：毛細(xì)管柱為Agilent HP-5,30 m×0.25 mm×0.25 μm；載氣為高純氦氣(純度>99.99%)，流速1 mL/min；進(jìn)樣溫度250 ℃，進(jìn)樣量1 μL，分流比1∶50。采用程序升溫：初溫40 ℃(保持3 min)，然后以5 ℃/min升溫至200 ℃(保持5 min)；再以2 ℃/min升溫至250 ℃。質(zhì)譜條件：EI離子源溫度230 ℃；電子能量70 eV；四級(jí)桿溫度150 ℃；溶劑延遲2 min；接口溫度280 ℃；掃描范圍40～400 amu，掃描速率3.99 scans/s[16]。

精油組分檢測(cè)：通過(guò)測(cè)定相應(yīng)系列的正烷烴的保留指數(shù)(RI)來(lái)確定各組分的RI值，并結(jié)合比對(duì)NIST質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù)(G1036A, revision D.01.00)和已報(bào)道的相關(guān)文獻(xiàn)[17]，得到柚皮精油各餾分的化學(xué)組成；以環(huán)己酮作為內(nèi)標(biāo)物，通過(guò)氣相色譜對(duì)各餾分中的各成分進(jìn)行了定量分析。

1.3.3 柚皮精油抗氧化實(shí)驗(yàn)

1.3.3.1 清除DPPH·活力測(cè)定

移取0.2 mL 20 mg/mL甲醇精油溶液分別與3 mL 0.004%的DPPH·甲醇溶液混合均勻，置于暗處，室溫下反應(yīng)30 min，在517 nm下測(cè)定吸光值A(chǔ)x,DDPH[18-19]。DPPH·的清除率計(jì)算：

式中：A0,DDPH為甲醇對(duì)照組。

1.3.3.2 清除ABTS+·活力測(cè)定

取7 mmol/L ABTS儲(chǔ)備液和2.45 mmol/L過(guò)硫酸鉀儲(chǔ)備液等體積混合均勻，在黑暗室溫下靜置12～16 h，得到ABTS+·母液。用甲醇稀釋母液，2.5 min后，734 nm處測(cè)得吸光度值約為0.7±0.05，稀釋后的溶液為ABTS+·工作液。取3.6 mL工作液加0.4 mL 20 mg/mL甲醇精油溶液，振搖10 s，以充分混合，黑暗處?kù)o置2.5 min，在734 nm處測(cè)得吸光值A(chǔ)x,ABTS[20]。ABTS+·清除率計(jì)算：

式中:A0,ABTS為甲醇對(duì)照組。

1.3.3.3 相對(duì)抗氧化活性等級(jí)的計(jì)算

為了更直觀地了解分子蒸餾后各餾分抗氧化活性的增益或減損，定義了相對(duì)抗氧化活性等級(jí)(Ralative Level of Antioxidant, RLA)，以餾分油比原油每增加或減少20%為一個(gè)等級(jí)，記為一個(gè)“+”，以此類(lèi)推，計(jì)算公式：

2 結(jié)果與分析

2.1 不同餾分化學(xué)組成及組分流向

柚皮精油沸點(diǎn)范圍分布在150～300 ℃之間，與普通的油脂、脂肪酸物料相比，組分多，分子量小，沸點(diǎn)分布窄，因此采用分子蒸餾技術(shù)來(lái)精煉精油，難度大，需要精準(zhǔn)調(diào)控操作參數(shù)，其中蒸發(fā)溫度、冷凝溫度及系統(tǒng)真空度變化均會(huì)引起較大的組分流向的響應(yīng)。分子蒸餾條件對(duì)餾分得率的影響見(jiàn)表1，若真空度和蒸發(fā)溫度設(shè)置過(guò)高(實(shí)驗(yàn)序號(hào)1)，精油中多數(shù)組分的平均自由程遠(yuǎn)大于蒸餾距離，所有組分均被兩級(jí)冷凝器俘集，因而完全無(wú)重餾分；隨著蒸發(fā)強(qiáng)度減弱(實(shí)驗(yàn)序號(hào)2～4)，即降低系統(tǒng)真空度(絕對(duì)壓力升高)或降低蒸發(fā)溫度，則精油中越來(lái)越多組分將無(wú)法汽化而直接降液成為重餾分。當(dāng)真空度為1～10 Pa、蒸發(fā)溫度為20 ℃時(shí)(實(shí)驗(yàn)序號(hào)5～7)，該蒸發(fā)強(qiáng)度下重餾分占比約為44%～46%，進(jìn)而設(shè)置一級(jí)冷凝溫度為-10 ℃、二級(jí)冷凝溫度為-20 ℃，則大部分平均自由程大于蒸餾距離的組分部分被一級(jí)冷凝器俘集，而少部分平均自由程遠(yuǎn)大于蒸餾距離(低沸點(diǎn)組分)的組分在一級(jí)冷凝面無(wú)法及時(shí)冷凝，發(fā)生“彈射”而流向二級(jí)冷凝器并被俘集。柚皮精油一次蒸餾后各餾分的化學(xué)組成分析如圖1所示，結(jié)合GC-MS分析，這些“彈射俘集”的輕餾分得率低于20%，但組分沸點(diǎn)分布窄(圖1d)，基本不含中間餾分中的組分，分離效果好，第二階段分子蒸餾實(shí)驗(yàn)也是依據(jù)此現(xiàn)象進(jìn)行設(shè)計(jì)。

柚皮精油的化學(xué)組成及含量見(jiàn)表2，在柚皮精油中共鑒定出33種化學(xué)成分，主要成分是香葉醇(156.52 g/L)、D-檸檬烯(66.33 g/L)和β-石竹烯(41.05 g/L)，與文獻(xiàn)報(bào)道相符，但含量略有差異[13, 21-22]，可能與果實(shí)的生長(zhǎng)環(huán)境、生長(zhǎng)階段等因素有關(guān)[23-24]。在蒸餾溫度為20 ℃，真空度為1～10 Pa的操作條件下進(jìn)行了一級(jí)分子蒸餾，餾分1RH共富集了17個(gè)沸點(diǎn)較高的組分，并且這些組分的含量較原油顯著提高，其中香葉醇濃度由原油的152.65 g/L升高到253.90 g/L，濃縮了1.7倍，β-石竹烯由原油的41.05 g/L升高至77.06 g/L，濃縮了1.9倍；餾分1DL也顯著濃縮了原油中低沸點(diǎn)部分的組分，其中D-檸檬烯被最大程度地富集，濃縮比高達(dá)4.9。需要指出的是，實(shí)驗(yàn)表明分子蒸餾可將檸檬烯從原油中脫除，并與其他主要成分分離，使得精油有效成分的富集成為可能。

表1 分子蒸餾條件對(duì)餾分得率的影響

注：Y表示各餾分的得率。

表2 柚皮精油的化學(xué)組成及含量

注：-表示未檢出，化合物沸點(diǎn)從上到下由高到低。

圖1a顯示了柚子原油中絕對(duì)含量大于0.5 g/L的26種化學(xué)組分，這些組分沸點(diǎn)分布在430～550 ℃范圍內(nèi)，經(jīng)過(guò)第一次分子蒸餾，餾分1RH富集了未汽化高沸點(diǎn)組分，基本脫除了低沸點(diǎn)的組分，如圖1b所示；餾分1DL富集效應(yīng)最佳，圖1b顯示了GC-MS的總離子流圖中各組分峰分布窄，并且通過(guò)計(jì)算組分的摩爾分率可知，1DL中主要含有9種低沸點(diǎn)組分，沸點(diǎn)范圍約在430～550 ℃之間，結(jié)合餾分1DM組分分析(圖1c)，1DM中組分分布較廣，即含有重餾分組分，也含輕餾分組分，表明了餾分1DL是那些平均自由程遠(yuǎn)大于蒸發(fā)距離、在一級(jí)冷凝器上未被冷凝而被二級(jí)冷凝器俘集的組分。

注：bp表示各組分在常壓下沸點(diǎn)；RT，RA分別表示GC-MS總離子圖中的保留時(shí)間和相對(duì)豐度。
圖1 柚皮精油一次蒸餾后各餾分的化學(xué)組成分析

根據(jù)抗氧化實(shí)驗(yàn)結(jié)果，餾分1RH的抗氧化活性顯著增強(qiáng)，因此對(duì)1RH進(jìn)行了第二次分子蒸餾以期進(jìn)一步富集抗氧化成分。在蒸餾溫度為25 ℃，真空度為190～200 Pa的條件下進(jìn)行低強(qiáng)度的分子蒸餾，由于1RH中低沸點(diǎn)組分極少，因此餾出物中僅有兩個(gè)餾分2RH和2DM，其中2RH中再次富集了香葉醇和β-石竹烯，濃縮比分別為3.7和4.3，同時(shí)又進(jìn)一脫除了部分的D-檸檬烯。

2.2 不同餾分抗氧化活性分析

測(cè)定分子蒸餾所得不同餾分對(duì)DPPH.和ABTS+.的清除能力，結(jié)果表明抗氧化活性強(qiáng)弱順序?yàn)?RH>1RH>2DM>Co(原油)>1DM>1DL，不同餾分對(duì)DPPH和ABTS自由基的清除能力如圖2所示。Choi等[25]認(rèn)為柑橘屬精油對(duì)DPPH·的清除能力與香葉醇的含量呈正相關(guān)，而Wang等[26]研究了番石榴(PsidiumguajavaL.)精油的抗氧化活性，其主要抗氧化成分是β-石竹烯。由圖2可知，餾分1RH較原油(Co)富集了高沸點(diǎn)組分，尤其是兩個(gè)抗氧化成分香葉醇和β-石竹烯，同時(shí)脫除了低沸點(diǎn)組分，如D-檸檬烯，因而相應(yīng)的DPPH·和ABTS+·的清除能力顯著增強(qiáng)，分別較原油提高60%和46%，而餾分1DM和1DL也因抗氧化成分被脫除而活性下降。值得指出的是，精油的生物活性可能是幾種化合物的協(xié)同作用[27]，所以柚皮精油對(duì)DPPH·和ABTS+·的清除作用，也可能是以香葉醇和β-石竹烯為主的多種高沸點(diǎn)組分共同作用的結(jié)果。

注：標(biāo)注字母為顯著性分析 (P<0.05)。
圖2 不同餾分對(duì)DPPH和ABTS+自由基的清除能力

對(duì)抗氧化活性較強(qiáng)的餾分1RH進(jìn)行了第二次分子蒸餾，對(duì)抗氧化成分進(jìn)行了進(jìn)一步富集，通過(guò)計(jì)算各餾分相對(duì)抗氧化活性等級(jí)，各餾分抗氧化活性富集程度評(píng)價(jià)見(jiàn)表3，不難發(fā)現(xiàn)餾分2RH的抗氧化活性較餾分1RH又上升一個(gè)等級(jí)，對(duì)ABTS+·的清除能力較原油提高了75%。

表3 各餾分抗氧化活性富集程度評(píng)價(jià)

2.3 分子蒸餾富集柚皮精油抗氧化成分過(guò)程分析

為了更直觀地顯示分子蒸餾用于柚皮精油抗氧化成分富集的效果，分子蒸餾富集柚皮精油抗氧化成分過(guò)程分析如圖3所示。圖3匯總了二次分子蒸餾過(guò)程中所有餾分的主要抗氧化成分、D-檸檬烯的含量以及對(duì)ABTS+·的清除能力，兩種抗氧化成分香葉醇和β-石竹烯的平均自由程分別0.019 cm和0.073 cm，均小于有效蒸發(fā)距離8.6 cm，因而未汽化部分直接沉降于餾分1RH中，而汽化部分冷凝至餾分1DM，極少出現(xiàn)在餾分1DL中，而宏量成分D-檸檬烯的平均自由程為9.1 cm，大于有效蒸發(fā)距離，只要將一級(jí)冷凝器溫度控制在較高水平，大部分D-檸檬烯則被冷凝至餾分1DL，顯然脫除宏量成分D-檸檬烯有利于活性成分的富集。對(duì)1RH的二次分子蒸餾的富集效果更加明顯，兩種抗氧化成分香葉醇和β-石竹烯的含量提高了1倍以上，活性也得到了顯著提升，再次表明經(jīng)多次分子蒸餾可以從植物精油中富集濃縮目標(biāo)活性成分，實(shí)際上為植物精油的精制提供了一種非常有效的方法。

圖3 分子蒸餾富集柚皮精油抗氧化成分過(guò)程分析

3 結(jié)論

植物精油種類(lèi)繁多，用途廣泛，具有極高商業(yè)開(kāi)發(fā)價(jià)值，但精油原料的穩(wěn)定性、生產(chǎn)的標(biāo)準(zhǔn)化等因素嚴(yán)重制約了其應(yīng)用，我國(guó)在精油深加工及高附加值產(chǎn)品研發(fā)上還需加大力度。本研究以柚皮精油為實(shí)驗(yàn)材料，探索了結(jié)合GC-MS及活性分析的分子蒸餾技術(shù)用于精油抗氧化成分的分離富集，結(jié)果表明在分子蒸餾過(guò)程中如果能實(shí)時(shí)地監(jiān)測(cè)主要活性成分的流向及活性的變化，并且在了解目標(biāo)及雜質(zhì)組分物性參數(shù)的前提下，設(shè)計(jì)多次特定分子蒸餾可以將精油中的有效成分進(jìn)行有目的地富集。這種精準(zhǔn)的分子蒸餾技術(shù)，雖無(wú)法取代昂貴的制備型氣相色譜技術(shù)作為純化方法，但因其低溫、真空的操作條件及良好富集效率，有望成為植物精油精制的一種方法，拓展了分子蒸餾的用途，具有一定的商業(yè)化應(yīng)用前景。