海帶內(nèi)生真菌Galactomyces geotrichum次生代謝產(chǎn)物改善小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力

劉佳，田淑娟，仇宏偉，王鳳舞

（1.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東青島 266109）（2.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)編輯部，山東青島 266109）

阿爾茨海默?。ˋD）是一種神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病。其臨床表現(xiàn)為記憶力減退、認(rèn)知功能發(fā)生障礙、行為異常和社交障礙[1]。阿爾茨海默病發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜，有關(guān)病因?qū)W說頗多，其中包括膽堿能缺失學(xué)說、基因突變學(xué)說、氧化應(yīng)激學(xué)說和炎癥因子學(xué)說等[2]。膽堿能缺失學(xué)說認(rèn)為神經(jīng)遞質(zhì)乙酰膽堿的缺失，膽堿酯酶活性的增強(qiáng)和膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶活性的減弱打破腦內(nèi)平衡，發(fā)生AD[3,4]。氧化應(yīng)激學(xué)說認(rèn)為AD患者存在較高水平的DNA和RNA氧化損傷，脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，蛋白質(zhì)氧化修飾及其它氧化應(yīng)激損傷，大腦內(nèi)部自由基氧化損傷是導(dǎo)致阿爾茨海默病的關(guān)鍵原因[5,6]。目前為止臨床上使用最廣泛的藥物，主要為單靶向的乙酰膽堿酯酶抑制劑，如他克林、多奈哌齊、卡巴拉汀等，但療效不是很理想且多數(shù)價格昂貴[7]，篩選具有抑制AchE活性和抗氧化雙重功能的活性物質(zhì)具有很重要的意義，它既能提高AD患者大腦中Ach的含量，促進(jìn)膽堿能神經(jīng)系統(tǒng)功能的恢復(fù)，提高AD患者的認(rèn)知，又能保護(hù)大腦，延緩AD病人神經(jīng)系統(tǒng)退化。植物真菌的次生代謝產(chǎn)物是天然活性物質(zhì)的重要來源，海帶中含有降血壓、抗疲勞耐缺氧、抗氧化和抑菌抗病毒等多種功能的活性成分，而與海帶互利共生的內(nèi)生真菌產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物中可能會有能夠加以利用的功能成分。

在前期試驗(yàn)中，我們課題組從海帶中分離出內(nèi)生真菌 QDFBLJ-1，發(fā)現(xiàn)其代謝產(chǎn)物的乙酸乙酯相有較強(qiáng)的體外抗抑制乙酰膽堿酯酶和抗氧化的活性。因此本試驗(yàn)以內(nèi)生真菌QDFBLJ-1次生代謝產(chǎn)物為研究對象，采用 D-半乳糖致衰老模型小鼠，進(jìn)行 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)和測定小鼠血清、肝臟和腦部組織 CAT、SOD、MDA、GSH-Px及腦部組織AchE、ChAT的變化，以探討其對AD模型鼠的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

健康雄性SPF級昆明種小鼠80只，體重20～22 g。購自青島大任富城畜牧有限公司，許可證號：SCXK(魯)20140007。

1.2 材料試劑與儀器

海帶內(nèi)生真菌 Galactomyces geotrichum QDFBLJ-1，由青島農(nóng)業(yè)大學(xué)中韓食品生物技術(shù)研究所從青島海域海帶中分離獲得；CAT測試盒、SOD測試盒、GSH-Px測試盒、MDA測試盒、AchE測試盒、ChAT測試盒、總蛋白測試盒，均購于上海源葉生物科技有限公司；他克林、抗壞血酸、D-半乳糖，均購于美國sigma公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

DU-800型紫外分光光度計(jì)，美國貝克曼公司；TGL-16M高速臺式冷凍離心機(jī)，湖南湘儀離心機(jī)儀器有限公司；iMark酶標(biāo)儀，美國bio-rad有限公司；Morris水迷宮，北京眾實(shí)迪創(chuàng)科技發(fā)展有限責(zé)任公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠；恒溫振蕩器ISRDH1，蘇州麥可旺志生物技術(shù)有限公司；電子分析天平，美國奧豪斯電子天平公司；移液槍，法國GILSON公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 海帶內(nèi)生真菌Galactomyces geotrichum QDFBLJ-1代謝產(chǎn)物乙酸乙酯相與培養(yǎng)基浸提物的制備

選用從青島海域海帶中分離得到的一株內(nèi)生真菌QDFBLJ-1進(jìn)行液體發(fā)酵，培養(yǎng)基為察氏培養(yǎng)基，接種量為10%，28 ℃培養(yǎng)14 d。發(fā)酵結(jié)束后，用4層無菌紗布過濾，得到過濾液。將過濾液和察氏培養(yǎng)基分別經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮，乙酸乙酯萃取3次，合并萃取相，得待測樣品浸提物和培養(yǎng)基浸提物。

1.3.2 實(shí)驗(yàn)分組及造模方法

小鼠經(jīng)3 d適應(yīng)性喂養(yǎng)后，隨機(jī)分為8組，每組10只。分別為：空白對照組、模型對照組、他克林陽性對照組、Vc陽性對照組、乙酸乙酯相低、中、高劑量組。除空白組，其余各組每日皮下注射360 mg/(kg bw·d)D-半乳糖，空白組皮下注射等體積生理鹽水。他克林和Vc陽性對照組按10 mg/(kg bw·d)灌胃并使其灌胃量與空白組、模型組相同。乙酸乙酯相低、中、高劑量組分別按 13 mg/(kg bw·d)、38 mg/(kg bw·d)和63 mg/(kg bw·d)灌胃，培養(yǎng)基浸提物對照組按 63 mg/(kg bw·d)灌胃，空白組和模型組每日灌胃等體積生理鹽水。小鼠飼養(yǎng)溫度為18～22 ℃，自然光照，自由進(jìn)食和飲水。每日定時灌胃、皮下注射一次，連續(xù)飼喂6周，記錄小鼠體重增加量。

1.3.3 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)

定位航行實(shí)驗(yàn)使用Morris水迷宮[8]測定小鼠的學(xué)習(xí)和記憶能力。第43 d開始進(jìn)行試驗(yàn)，共4 d。實(shí)驗(yàn)開始前小鼠自由游泳2 min。正式實(shí)驗(yàn)每天訓(xùn)練2次，每次120 s，隨機(jī)選擇東、南、西、北4個象限中的一個，將小鼠面向池壁放入水中，記錄小鼠尋找并爬上平臺所需時間，該時間即為逃避潛伏期。如果實(shí)驗(yàn)小鼠在120 s內(nèi)未找到平臺，則由實(shí)驗(yàn)者將其引至平臺，停留30 s，該實(shí)驗(yàn)小鼠的逃避潛伏期記為120 s。每只小鼠訓(xùn)練次數(shù)共8次。計(jì)算每天各組小鼠2次逃避潛伏期。

空間搜索實(shí)驗(yàn)用于測定小鼠對平臺空間位置的記憶保持能力。試驗(yàn)小鼠訓(xùn)練4 d后，于第5 d將平臺撤離，選取平臺所在象限的對側(cè)將小鼠放入池中，使小鼠在水中游泳120 s，記錄120 s內(nèi)小鼠經(jīng)過平臺所在象限的停留時間以及穿越平臺所在象限的次數(shù)。

1.3.4 生化指標(biāo)測定

在空間搜索實(shí)驗(yàn)后將小鼠禁食12 h，稱重。摘除眼球取血處死，加入抗凝血劑，靜置3 h后，血樣在4 ℃下5000 r/min離心10 min，收集上清液即血清；取血后立即解剖小鼠，迅速取出肝臟和腦部用生理鹽水清洗，用濾紙吸干，將肝臟和腦部組織研磨，以制備10%勻漿液（勻漿過程始終處于冰水中），在4 ℃下5000 r/min離心10 min后除去細(xì)胞碎片，取上清液備用[9]。按照試劑盒說明書測定血清、肝臟和腦部組織SOD、GSH-Px、CAT酶活力及MDA含量以及小鼠腦部AchE和ChAT活性。

1.4 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 18.0軟件進(jìn)行分析，平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(ˉx±s)來表示，組間均值比較采用單因素方差分析和Duncan多重比較分析，顯著性水平p=0.05。

2 結(jié)果與討論

2.1 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 小鼠體重變化結(jié)果

表1 小鼠體重增加量Table 1 The result of mice weigh gain

模型建造期間，空白對照組僅體重穩(wěn)定增加，其他指標(biāo)無變化。體重測定結(jié)果表明：8組小鼠處死前與給藥前相比體重均有所增加，無顯著性差異，表明小鼠身體除氧化損傷、癡呆方面，其他各項(xiàng)機(jī)能基本穩(wěn)定。模型對照組小鼠和浸提物對照組小鼠體重亦增加，但活動量減少，精神萎靡，反應(yīng)遲鈍。說明 D-半乳糖對小鼠體內(nèi)氧化應(yīng)激反應(yīng)劇烈，造成氧化損傷、小鼠身體衰老、大腦癡呆，初步表明建模成功。

2.1.2 對AD模型小鼠學(xué)習(xí)和記憶能力的影響

定位航行試驗(yàn)：培養(yǎng)基浸提物對照組與模型對照組基本一致，無顯著性差異。說明培養(yǎng)基浸提物對小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力無改善影響。各組小鼠隨著訓(xùn)練時間的延長，逃避潛伏期均有所縮短。與空白組相比，模型組逃避潛伏期明顯高于空白組小鼠（p＜0.05）。與模型組相比，他克林、Vc陽性對照組明顯延長于模型對照組（p＜0.05），中、高劑量組逃避潛伏期與模型對照組差異性顯著（p＜0.05）。隨著樣品劑量的增加，受試動物組中小鼠的逃避潛伏期相對應(yīng)縮短。與Vc陽性對照組相比，高劑量組逃避潛伏期與其差距較小，說明待測樣品尤其是高劑量組有增強(qiáng) D-半乳糖模型小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的作用。

空間探索實(shí)驗(yàn)：培養(yǎng)基浸提物對照組與模型對照組基本一致，無顯著性差異。撤出平臺后，與模型組相比，空白組在Morris水迷宮穿越平臺次數(shù)和象限停留的時間明顯延長（p＜0.05）。陽性對照組和低、中、高劑量組穿越平臺次數(shù)與模型對照組差異顯著（p＜0.05），高劑量組穿越平臺次數(shù)大于Vc陽性對照組，且與他克林陽性對照組基本一致。陽性對照組和高劑量組平臺象限時間明顯延長于模型對照組（p＜0.05）。隨著待測樣品劑量的增高，受試動物組有逐步延長的趨勢。說明待測樣品尤其是高劑量組有改善D-半乳糖模型小鼠對空間位置記憶能力作用趨勢。

表2 定位航行和空間探索結(jié)果Table 2 The result of locates the navigation and easpace exploration experiment

2.2 生化指標(biāo)測定結(jié)果

2.2.1 QDFBLJ-1次生代謝產(chǎn)物對小鼠血清、肝臟和大腦組織MDA含量的影響

從表3可知，培養(yǎng)基浸提物對照組與模型對照組基本一致，無顯著性差異。模型組小鼠血清、肝臟和大腦中MDA含量顯著高于空白組（p＜0.05），說明建模成功。與模型組相比，陽性對照組和組織中、高劑量組MDA含量明顯降低（p＜0.05）。

與Vc陽性對照組相比，高劑量組小鼠的肝臟和大腦組織中MDA含量均少于Vc陽性對照組，表明抗氧化效果優(yōu)于Vc陽性對照組。低、中、高劑量組與模型對照組相比，血清中 MDA含量分別下降8.29%、12.71%和16.71%，肝臟組織中MDA含量分別下降17.75%、20.41%和46.08%，大腦組織中MDA含量分別下降14.95%、28.47%和36.48%。說明樣品組尤其是高劑量組能夠抑制肝臟和大腦組織中的脂質(zhì)過氧化，延緩衰老。

表3 小鼠血清、肝臟和大腦MDA含量Table 3 MDA content of serum, liver and brain in mice

2.2.2 QDFBLJ-1次生代謝產(chǎn)物對小鼠血清、肝臟和大腦組織SOD活力的影響

由表4可知，培養(yǎng)基浸提物對照組與模型對照組基本一致，無顯著性差異。與空白組相比，模型組小鼠血清、肝臟和腦部組織中 SOD酶活力明顯降低（p＜0.05）。

與Vc組相比，高劑量組小鼠大腦組織SOD活力較高。與模型對照組相比，低、中、高劑量組小鼠血清、肝臟和腦部組織中 SOD活力高于模型組，且各組織中、高劑量組與模型組差異顯著（p＜0.05）。樣品組血清中 SOD活力分別上升 15.71%、20.37%和25.97%，肝臟組織中分別上升 8.00%、21.35%和28.91%，大腦組織中分別上升 10.86%、26.06%和40.23%?？梢钥闯鰳悠方M尤其是高劑量組能夠有效清除大腦內(nèi)超氧離子自由基，減少大腦氧化損傷，延緩衰老。

表4 小鼠血清、肝臟和大腦SOD活力Table 4 SOD activity of serum, liver and brain in mice

表5 小鼠血清、肝臟和大腦GSH-Px活力Table 5 GSH-Px activity of serum, liver and brain in mice

2.2.3 QDFBLJ-1次生代謝產(chǎn)物對小鼠血清、肝臟和大腦組織GSH-Px活力的影響

由表5可知，培養(yǎng)基浸提物對照組與模型對照組基本一致，無顯著性差異。模型組小鼠血清、肝臟和腦部組織中 GSH-Px活力較空白對照組顯著降低（p＜0.05）。與模型組相比，與Vc組相比，小鼠血清高劑量組GSH-Px活力較高。小鼠血清中、高劑量組和肝臟高劑量組以及大腦中、高劑量組中GSH-Px活力顯著降低（p＜0.05）。血清中低、中、高劑量組GSH-Px分別升高26.00%、40.90%和52.60%，肝臟組織中、高劑量組分別升高11.52%和22.30%，大腦組織中分別升高6.06%、27.38%和39.41%?？梢钥闯觯瑯悠方M能夠較好的催化血清中還原型谷胱甘肽對過氧化氫的還原反應(yīng)，保護(hù)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能完整。

2.2.4 QDFBLJ-1次生代謝產(chǎn)物對小鼠血清、肝臟和大腦組織CAT活力的影響

由表6可知，培養(yǎng)基浸提物對照組與模型對照組基本一致，無顯著性差異。模型組小鼠肝臟、腦部組織和血清中 CAT活力較空白對照組顯著降低（p＜0.05）。與Vc組相比，小鼠血清高劑量組CAT活力較高。與模型組相比，血清高劑量組中CAT活力與模型組差異顯著（p＜0.05），血清中低、中、高劑量組CAT活力分別上升4.16%、18.94%和29.79%，肝臟組織中分別上升14.11%、26.13%和33.43%，大腦組織中分別上升7.89%、25.41%和34.29%?？梢钥闯觯瑯悠纷顚Ω闻K和大腦中CAT活力提高較多，尤其是高劑量組能夠較好的分解大腦中的過氧化氫，減少氧化應(yīng)激反應(yīng)，延緩大腦衰老。

表6 小鼠血清、肝臟和大腦CAT活力Table 6 CAT activity of serum, liver and brain in mice

2.2.5 QDFBLJ-1次生代謝產(chǎn)物對小鼠大腦AchE、ChAT活力的影響

表7 小鼠大腦AchE、ChAT活力Table 7 Activity of AchE and ChAT in mouse brain

由表7可知，培養(yǎng)基浸提物對照組與模型對照組基本一致，無顯著性差異。與空白組相比，模型組小鼠大腦AchE活性顯著升高（p＜0.05），ChAT活性顯著降低（p＜0.05），說明建模成功，可以認(rèn)為 D-半乳糖導(dǎo)致小鼠衰老和記憶障礙的機(jī)制之一是膽堿能系統(tǒng)損傷。與模型對照組相比，小鼠腦部低、中、高劑量組AchE活性明顯降低（p＜0.05），其中高劑量組AchE活性升高了28.64%。小鼠大腦中、高劑量組ChAT活性明顯升高（p＜0.05），低劑量組已提高 ChAT活力92.79%。說明樣品對于膽堿能系統(tǒng)的損傷修復(fù)，主要是Ach的合成，神經(jīng)遞質(zhì)增多，從而抑制老年癡呆。與他克林陽性對照組相比，小鼠大腦高劑量組 AchE活力低于陽性對照組，ChAT活力高于陽性對照組。說明該菌株次生代謝產(chǎn)物尤其是高劑量組可以在一定程度上改善 D-半乳糖對小鼠大腦造成的膽堿能系統(tǒng)損傷，提高小鼠的學(xué)習(xí)和記憶能力。

3 結(jié)論

3.1 本實(shí)驗(yàn)中，Morris水迷宮行為學(xué)實(shí)驗(yàn)評價 G.geotrichum QDFBLJ-1次生代謝產(chǎn)物對小鼠學(xué)習(xí)記憶力有改善作用。研究表明，培養(yǎng)基浸提物對照組與空白組基本一致，無顯著性差異，排除培養(yǎng)基浸提物對實(shí)驗(yàn)的影響。在定位航行與空間探索實(shí)驗(yàn)中，三個樣品劑量組較衰老模型組相比逃避潛伏期縮短、穿越平臺次數(shù)增加、平臺象限時間增加，以高劑量組的效果尤為顯著。

3.2 氧化應(yīng)激和中樞膽堿功能損傷是神經(jīng)性退行疾病中認(rèn)知功能減退的主要原因之一。MDA是機(jī)體內(nèi)的自由基引發(fā)脂質(zhì)過氧化的一種產(chǎn)物，能夠間接反映細(xì)胞損傷程度和機(jī)體過氧化水平[10]。SOD是體內(nèi)一種重要的抗氧化酶，能夠有效清除超氧陰離子自由基，降低MDA及自由基代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生，使細(xì)胞免受破壞[11]。GSH-Px是機(jī)體內(nèi)廣泛存在的一種重要的過氧化物分解酶，它催化還原型谷胱甘肽對過氧化氫的還原反應(yīng)，能夠保護(hù)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能完整，緩解機(jī)體內(nèi)的氧化損傷[12]。CAT是存在于紅細(xì)胞和某些組織內(nèi)的過氧化體中，催化H2O2分解為H2O與O2，延緩機(jī)體衰老[13]。因此本實(shí)驗(yàn)選用SOD、MDA、GSH-Px、CAT作為評估抗氧化作用的指標(biāo)。Ach是大腦中樞系統(tǒng)內(nèi)與學(xué)習(xí)記憶相關(guān)的重要神經(jīng)遞質(zhì)，能特異性的作

用于各類膽堿受體，其含量與ChAT和AchE活性有關(guān)，AchE分解Ach，ChAT則是催化Ach合成的限速酶，二者相互作用共同維持腦內(nèi)Ach量的動態(tài)平衡[14]，通過檢測其活性可以間接推測出Ach含量的高低[15]。因此本實(shí)驗(yàn)選擇AchE和ChAT作為評估膽堿能神經(jīng)系統(tǒng)活性的指標(biāo)。結(jié)果表明，G. geotrichum QDFBLJ-1次生代謝產(chǎn)物顯著提高了小鼠血清、特別是肝臟和腦部組織中SOD、CAT、GSH-Px水平、降低MDA水平，而且能夠顯著降低小鼠腦部組織AchE活性，提高ChAT活性，部分高劑量組效果優(yōu)于陽性對照Vc。說明G. geotrichum QDFBLJ-1次生代謝產(chǎn)物能夠降低氧化應(yīng)激程度，減輕自由基對腦組織的損傷，延緩大腦衰老，恢復(fù)小鼠中樞膽堿功能，從而改善D-半乳糖所致衰老模型小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力。

3.3 本課題組多年來致力于從海洋微生物中尋找具有抑制乙酰膽堿酯酶和抗氧化雙重活性的功能活性物質(zhì)，以期開發(fā)新型的抗AD天然藥物。通過本次實(shí)驗(yàn)可以看出，海帶內(nèi)生真菌白地霉 G. geotrichum QDFBLJ-1次生代謝產(chǎn)物屬于實(shí)際無毒，其乙酸乙酯相有抗氧化損傷和抑制乙酰膽堿酯酶的雙重活性，能夠改善D-半乳糖致AD模型小鼠學(xué)習(xí)記憶能力。說明調(diào)節(jié)中樞膽堿能系統(tǒng)、保護(hù)神經(jīng)元細(xì)胞、提高機(jī)體自由基清除能力和抗脂質(zhì)氧化損傷可能是改善AD模型小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的作用機(jī)制之一。目前國內(nèi)外有關(guān)海帶內(nèi)生菌的研究報(bào)道僅見于海帶內(nèi)生菌DNN6蛋白對小黃魚的保鮮效果[16]和抗腫瘤活性[17]，DNN7蛋白的分離及抗腫瘤研究[18]以及HSN2胞外蛋白對粉紅單端孢霉的影響[19]，未發(fā)現(xiàn)關(guān)于海帶內(nèi)生菌的抗老年癡呆相關(guān)活性報(bào)道。因此本次研究對開發(fā)新型的抗 AD天然藥物具有重要意義。